Đề tài Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây cà chua (Lycopersicum esculentum L.) phục vụ chuyển gen

Mở Đầu Đặt vấn đề Cà chua là nguồn thực phẩm quan trọng trong đời sống thường ngày của con người. Đây là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, dễ trồng, vốn chi phí ban đầu thấp, có thể mở rộng sản xuất ở hầu khắp các vùng sinh thái khác nhau. Nhu cầu tiêu thụ cà chua ở nước ta rất lớn và nhu cầu này ngày càng tăng vì cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, trong cà chua có chứa nhiều loại vitamin như A, B, C, B2, PP, K,…và các chất khoáng như Ca, Fe, P, S, Na, K, Mg và đường. Mặt khác, cà chua là loại thực phẩm dễ chế biến và sử dụng, có thể dùng ăn tươi, nấu, chế biến thành cà chua khô, cà chua bột, tương cà chua,…Bên cạnh đó, cà chua còn là mặt hàng xuất khẩu có nhiều triển vọng vì sản phẩm cà chua ở nước ta được thu hoạch vào đúng thời điểm nhiều nước không trồng được trong mùa đông lạnh [15]. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng cà chua phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố. Bởi cà chua là loại cây rất dễ bị sâu bệnh phá hại, đặc biệt là những bệnh do nấm, vi khuẩn, virus. Chúng gây hại từ giai đoạn cây con trong vườn ươm, giai đoạn trồng ngoài sản xuất cho đến khi thu hoạch [16]. Do đó làm giảm năng suất đồng thời người trồng phải sử dụng rất nhiều loại thuốc phòng trừ sâu bệnh với liều lượng cao hơn khuyến cáo rất nhiều lần, vì thế chúng thường gây độc cho người tiêu dùng do dư lượng trong sản phẩm. Bên cạnh đó, với năng suất trung bình 14 tấn/1 ha, sản lượng hàng năm trên cả nước là 100 ngàn tấn mới chỉ đảm bảo cho bình quân đầu người trên cả nước hơn 1 kg sản phẩm một năm. Mặt khác, do vùng trồng cà chua và thời gian thu hoạch thường tập trung nên sản phẩm có nơi có lúc thừa, giá bán quá rẻ, dập nát và hư hỏng khi vận chuyển và bảo quản,... [15]. Vì vậy, việc tạo ra những giống cà chua có khả năng kháng sâu bệnh, nâng cao năng suất, chất lượng là rất cần thiết. Trước đây, muốn tạo ra được một giống cây mới, người ta đã phải mất rất nhiều năm bằng cách lai tạo, chọn lọc qua nhiều thế hệ, tuy nhiên không phải lúc nào cũng tạo ra được giống cây mang được các đặc tính như mong muốn. Nhưng ngày nay, công nghệ gen đã giúp cho việc chuyển gen ưu việt vào việc lai tạo giống mới trong nông nghiệp được tiến hành một cách nhanh chóng và dễ dàng hơn [13]. Tuy nhiên, một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu dẫn tới sự thành công của công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và chuyển gen vào thực vật nói riêng là việc xây dựng hệ thống tái sinh có hiệu quả cao [14]. Chính vì vậy chúng tôi quyết định tiến hành"Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây cà chua (Lycopersicum esculentum L.) phục vụ chuyển gen" nhằm khảo sát khả năng tái sinh in vitro cây cà chua từ thân mầm để phục vụ cho việc chuyển gen sau này. 2. Nội dung nghiên cứu. - Tìm hiểu ảnh hưởng cuả một số chất kích thích sinh trưởng lên khả năng nảy mầm của hạt. - Tìm hiểu khả năng tái sinh cây từ thân mầm. Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Sinh học - Khoa KHTN & XH - ĐHTN. Chương 1. Tổng Quan Tài Liệu 1.1. Giới thiệu chung về cây cà chua 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Bolivia, Ecuado. Trước khi tìm ra châu Mỹ thì cà chua đã được trồng ở Peru và Mehico. Những loài cà chua hoang dại gần gũi với loài cà chua trồng ngày nay vẫn tìm thấy ở dọc theo dãy núi Andes (Peru), đảo Galapagos (Ecuado) và Bolivia. Các nhà vườn đã trồng, thuần dưỡng những giống cà chua quả nhỏ và dạng hoang dại. Những giống và loài hoang dại này được mang từ nơi xuất xứ đến Trung Mỹ, rồi đến Mehico [2]. Đến đầu thế kỷ XVIII, các giống cà chua đã trở nên phong phú và đa dạng, nhiều vùng đã trồng cà chua làm thực phẩm. Vào thế kỷ XIX (1830) quả cà chua đã trở thành loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn thường ngày. Cuối thế kỷ XIX, trên 200 dòng, giống cà chua được giới thiệu một cách rộng rãi trên thế giới [2]. Cà chua thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phân lớp bạc hà (Lamiidae), lớp ngọc lan (Magnoliopsida), có tên khoa học là Lycopersicum esculentum L., cà chua còn có nhiều tên gọi khác nhau như Lycopersicum esculentum Mill, L. lycopersicum, S. lycopersicon, L. kort...[15]. Từ lâu có nhiều tác giả nghiên cứu về phân loại cà chua và lập thành hệ thống phân loại theo quan điểm riêng của mình. Theo H.J.Muller (1940) thì loài cà chua trồng hiện nay thuộc chi phụ Eulycopersion C.H.Muller. Tác giả phân loại chi phụ này thành 7 loài, loài cà chua trồng hiện nay (Lycopersicon esculentum L.) thuộc loài thứ nhất [2]. Theo L.B.Lihner Nonnecke (1989) thì L.esculentum là loài cà chua trồng có 4 biến chủng sau. + L. esculentum var. Commune là giống cà chua thông thường. Hầu hết những giống cà chua trồng đều thuộc biến chủng này. Đặc điểm là thân, lá rậm rạp, sum suê, quả có khối lượng trung bình lớn. + L. esculentum var. Grandifolium. Lá của biến chủng này to, giống lá khoai tây, mặt lá rộng và láng bóng, số lá trên cây ít. + L. esculentum var. Validum. Cà chua anh đào, cây đứng, mập. + L. esculentum var. Pyriforme. Cà chua hình quả lê. Tất cả các loài cà chua đều có số nhiễm sắc thể 2n = 24. 1.1.2. Đặc điểm sinh học Cà chua là loại thân thảo, sống theo mùa, ưa khí hậu ấm áp và ánh sáng đầy đủ. Có ánh sáng cây mới sinh trưởng và phát triển tốt. Cà chua sinh trưởng và phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ trung bình từ 22oC -26oC. Nếu nhiệt độ trên 35oC cây cà chua ngừng sinh trưởng, khi nhiệt độ xuống dưới 10oC cà chua không ra hoa. Mặc dù được xếp vào nhóm cây tương đối chịu hạn song cà chua cũng là cây ưa nước, cà chua cần một lượng nước lớn cho suốt quá trình sinh trưởng, phát triển nên cà chua cần phải được tưới nhiều nước, nếu để ruộng trồng cà chua lúc thừa lúc thiếu nước sẽ làm cho quả dễ bị nứt. Vào thời gian ra hoa nếu thiếu nước sẽ làm cho hoa được hình thành ít, dễ bị rụng quả [12]. Cà chua có thân tròn, phân nhánh nhiều, cao 0.6 - 1m, toàn thân có lông mềm và lông tuyến, đặc tính của cây cà chua là bò lan ra xung quanh hoặc mọc thành bụi. Lá kép lông chim phân thuỳ, số lượng thuỳ không cố định. Lá chét hình trứng thuôn dài 7-12cm, rộng 2-5 cm, đầu nhọn hoặc tù, gốc lệch, mép khía, răng thô, cuống dài 2-3cm [6]. Hoa màu vàng, mọc thành chùm ở kẽ lá, mỗi chùm 5-8 hoa hoặc nhiều hơn. Khi gặp những điều kiện bất lợi như quá lạnh, quá nóng, quá khô hạn, quá ẩm ướt hoặc thiếu dinh dưỡng, sâu bệnh gây hại,...thì sẽ làm cho hoa và quả dễ bị rụng. Thường người ta sử dụng chất kích thích sinh trưởng 2,4D để ngăn cản hiện tượng này [3]. Quả cà chua có hình tròn hoặc hơi dẹt, cũng có giống quả hình trứng, hình quả lê,... Khi quả chín, tuỳ thuộc vào đặc điểm của giống mà có màu sắc khác nhau như màu đỏ, màu vàng, màu vàng hồng,... Chất màu chủ yếu của cà chua là carotinoit, chlorophyll, theo mức độ chín, lượng chlorophyll giảm, lượng carotinoit tăng. Trong quả cà chua có chứa thịt quả, chất dịch chua ngọt và nhiều hạt dẹt hình thận [6]. Lớp thịt càng dày, buồng đựng hạt càng bé, chất lượng quả càng cao. ở độ chín hoàn toàn, lượng vitamin C và carotinoit đạt tỷ lệ cao nhất, lượng acid giảm, lượng đường tăng, thịt quả có vị ngọt hơn lúc còn xanh. Lượng protopectin giảm làm cho vỏ dễ tách ra và quả bị mềm. Dựa vào đặc điểm hình thái của quả mà người ta phân loại cà chua thành các nhóm khác nhau. ở nước ta, các giống cà chua đang được trồng chủ yếu thuộc ba nhóm chính là nhóm cà chua múi, nhóm cà chua hồng và nhóm cà chua bi (hay còn gọi là cà chua ta hoặc cà chua kiu) [15]. - Cà chua múi: Quả to, nhiều ngăn tạo thành múi. Quả có vị chua, nhiều hạt, ăn không ngon, nhưng cây mọc khoẻ, sai quả, chống chịu sâu bệnh tốt. Giống điển hình là cà chua múi Hải Phòng. - Cà chua hồng: Là loại cà chua được trồng phổ biến hiện nay. Quả có hình dạng như quả hồng, không có múi hoặc múi không rõ. Chất lượng ăn tươi cũng như lúc chế biến và nấu ăn cao do thịt quả đặc, nhiều bột, lượng đường cao. Phần lớn trong nhóm này là các giống được lai tạo, chọn lọc trong nước và một số giống nhập nội. Một số giống thường được trồng là PT18, HT7, HT14, VT3, HP1, MV1,... - Cà chua bi: Là giống địa phưong, gặp rải rác ở các vùng núi cao và ven biển miền trung, chúng có lượng acid cao, hạt nhiều, năng suất thấp do quả bé nhưng khả năng chống chịu tốt nên được sử dụng làm vật liệu tạo giống. Gần đây, nhiều vùng trong nước đã trồng các giống cà chua quả nhỏ nhập nội. Những giống này cho năng suất và chất lượng tốt, được sử dụng chủ yếu như một loại quả sau bữa ăn. Các giống có màu sắc và hình dáng rất đa dạng [23]. 1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng Cà chua là cây rau có giá trị kinh tế cao, được trồng rộng rãi trên thế giới. Cà chua có thể cho năng suất cao, sinh trưởng nhanh, bảo quản được tương đối dài hơn so với các loại rau khác, quả có khả năng vận chuyển được thuận lợi và đi xa [3]. Vì vậy trồng cà chua đã thực sự mang lai hiệu quả kinh tế cao. Theo FAO (1999), hiện có tới 158 nước trồng cà chua. Diện tích cà chua trên thế giới là 3 254 000 ha, năng suất là 27.77 tấn/ha, sản lượng 90.36 triệu tấn. Một số nước có năng suất cà chua cao trên 100 tấn/ha như Hà Lan (425 tấn/ha), Thụy Sĩ (383 tấn/ha), Thụy Điển (327 tấn/ha), Na Uy (291 tấn/ha), Ailen (201 tấn/ha),...[2]. Cà chua là loại rau cho hiệu quả kinh tế cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước. ở Mỹ (1997) tổng giá trị xuất khẩu một hecta cà chua cao hơn 4 lần so với lúa nước, 20 lần so với lúa mỳ [2]. ở Việt Nam, lịch sử trồng cà chua mới chỉ hơn 100 năm nay. Trong những năm gần đây ở nước ta diện tích trồng cà chua đang ngày một tăng. Điều kiện thiên nhiên, khí hậu và đất đai nước ta rất thích hợp cho cà chua sinh trưởng và phát triển. Vì vậy trên khắp nước ta từ bắc tới nam hầu hết đâu cũng trồng đuợc cà chua [3]. Diện tích trồng cà chua hàng năm khoảng 10 000 ha [15]. Cà chua là cây rau quan trọng của nhiều vùng chuyên canh, là cây trồng sau lúa mùa sớm cho hiệu quả kinh tế cao. Cà chua được trồng chủ yếu ở vùng đồng bằng sông hồng và trung du bắc bộ. ở Miền Nam có Đà Lạt (Lâm Đồng) là nơi sản xuất cà chua cho năng suất cao. Song trong cả nước chưa có vùng sản xuất lớn, cà chua đang được trồng rải rác ở nhiều nơi. Đây cũng là khó khăn trong việc quy hoặch vùng sản xuất cà chua cho mục đích xuất khẩu và chế biến. Quả cà chua có giá trị dinh dưỡng rất cao, thành phần dinh dưỡng gồm glucid, protein, P, Ca, caroten, Fe, các vitamin B1, B2, PP, C [6]. Vitamin C trong quả cà chua khi nấu chín vẫn giữ được phần lớn khối lượng, chỉ bị bay hơi tương đối ít vì trong quả cà chua có các acid xitric và acid táo là những loại acid vừa có tác dụng bảo vệ vitamin C vừa có tác dụng tiêu được các chất béo [3]. Cà chua chín cây có chất lượng tốt hơn so với cà chua chín trong thời gian bảo quản. Đặc biệt, quả cà chua cú chứa hàm lượng lycopen khỏ cao. Lycopen hoạt động như chất chống oxy húa cực mạnh trong cơ thể, chống lại tỏc hại của cỏc gốc tự do, khụi phục những tế bào bị tổn hại, tiờu diệt những phõn tử thoỏi húa, kiềm chế quỏ trỡnh oxy húa của DNA do đú cà chua cú tỏc dụng tốt đối với nhiều bệnh như: ung thư, tim mạch, chống lóo húa,… Do có thành phần dinh dưỡng phong phú nên cà chua đã trở thành món ăn thông dụng của nhiều nước trên 150 năm nay và là cây rau ăn quả được trồng rộng rãi khắp các châu lục [2]. Cà chua cũng là loại rau có nhiều cách sử dụng. Có thể dùng quả tươi, trộn salat, nước giải khát, xào nấu,...hoặc được chế biến thành nhiều loại sản phẩm khác nhau như: cà chua cô đặc, nước quả, nước sốt, tương, cà chua đóng hộp,...[19]. Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao nhưng ở một số vùng ở nước ta nó còn giữ giá trị thấp trong cơ cấu cây trồng. Hiện nay, các nghiên cứu trên đối tượng này chỉ dừng lại ở việc sử dụng hệ thống cây trồng hoàn chỉnh [13]. Sử dụng những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào đã thiết lập một công cụ hữu ích cho việc nghiên cứu và tạo thành công cây cà chua chuyển gen nhằm nâng cao năng suất, chất lượng của cà chua. 1.2. Công nghệ tế bào thực vật trong cải tạo giống cây trồng 1.2.1. Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật được hoàn thiện và phát triển mạnh từ những năm 60 của thế kỷ XX khi tìm ra môi trường nuôi cấy chuẩn và đặc biệt sử dụng các chất hormone sinh trưởng như auxin, gibberillin, cytokinin,...để kích thích sự phân bào và tăng trưởng tế bào cũng như tạo thành các mô và tái sinh cây toàn vẹn từ tế bào được nuôi cấy[1]. Ngày nay người ta có thể nuôi cấy bất kỳ cơ quan nào của cây (chồi, lá, thân, rễ, hoa,...) để tạo thành mô sẹo và từ đó điều khiển cho tế bào biệt hoá thành các mô khác nhau (rễ, thân, lá,...) và tái sinh thành cây trưởng thành. Trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thì môi trường dinh dưỡng để duy trì sự sống cho tế bào là rất quan trọng. Môi trường bao gồm các thành phần đa lượng như: NH4, NO3, SO4, Ca, Cl, K, Na,...Các chất vi lượng như: Fe, Mg, Mn, Zn, I, Bo, Mo, Cu, ... Ngoài ra còn phải bổ sung đường vào môi trường nuôi cấy vì cây nuôi cấy không hoàn toàn tự dưỡng [27]. Đường được sử dụng làm nguồn cacbon chủ yếu cung cấp năng lượng trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu cho môi trường nuôi cấy [25]. Các đường thường dùng trong nuôi cấy là đường glucose, hoặc sucrose. Cho đến nay, có rất nhiều môi trường dinh dưỡng khoáng được tìm ra như môi trường MS (1962), môi trường Knop (1974), môi trường Linsmainer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường VW (Vacine Went),... Trong đó môi trường MS là phù hợp nhất đối với đa số các loài thực vật [24]. Tuy nhiên, không phải loài nào cũng phù hợp với môi trường MS như cẩm chướng (Dianthus spp), hương nhu (Ocmum gratissmum) chỉ sinh trưởng được khi lượng khoáng giảm một nửa [26]. Ngoài chất dinh dưỡng thì các hormone sinh trưởng cũng đóng vai trò hết sức quan trọng trong định hướng cho quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [4]. Bên cạnh đó phải kể đến vai trò của các yếu tố ngoại cảnh như thời gian, độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ pH, ...Chúng gây ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và tái sinh của tế bào, mô sẹo và cây con [1]. 1.2.1.1. Cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở khoa học là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt đề xuất năm 1902: “Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật [4]. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể. Chính vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi một tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Để thực hiện được điều này tế bào thực vật phải trải qua hai quá trình là phản biệt hoá và tái biệt hoá [11]. - Phản biệt hoá là giai đoạn đưa tế bào từ trạng thái đã biệt hoá trở lại trạng thái chưa biệt hoá. Quá trình này biến tế bào đã biệt hoá thành những tế bào có hình thức giống như những tế bào ở đỉnh sinh trưởng (tế bào mầm phôi). Chúng có đặc điểm là tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ li ti hoặc không có, nhân to, kích thước tế bào lớn. Những tế bào như vậy coi như đã được phản biệt hoá xong và trong những điều kiện nuôi cấy nhất định chúng sẽ phát triển thành cơ thể mới. - Tái biệt hoá là giai đoạn đưa tế bào đã phản biệt hoá phát triển thành cây hoàn chỉnh. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào đã biệt hoá tham gia hình thành nên các tế bào phôi và hai loại tế bào khác là tế bào trung gian và tế bào khổng lồ có không bào rất lớn. Trong đó, chỉ có tế bào phôi và tế bào trung gian là phân chia còn các tế bào khổng lồ thì chết dần. Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh chỉ có ở trong các tế bào phôi, nhưng nếu trong quần thể không có các tế bào khổng lồ thì các tế bào phôi không thể phát sinh thành cơ thể mới được mà chỉ những quần thể nuôi cấy có đủ các loại tế bào khác nhau mới có khả năng tái sinh [11]. Sự tái biệt hoá và phản biệt hoá là quá trình hoạt hoá và ức chế hoạt động của các gen. Trong một giai đoạn nhất định của cây, một số gen nào đó đang ở trong trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá để cho ra một tính trạng biểu hiện mới. Ngược lại, một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt động. Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc hệ gen của tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể thực vật được hài hoà. Sự hoạt động hài hoà của của các tế bào và mô cơ quan còn phụ thuộc vào tế bào nằm trong khối mô, cơ quan của cơ thể. Khi tách riêng từng tế bào hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gen của tế bào [4]. 1.2.1.2. Một số yếu tố ảnh hưởng lên quá trình nuôi cấy mô tế bào + ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy. Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác động của các chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hoà sinh trưởng, loại mẫu nuôi cấy,...[20]. Các chất điều hoà sinh trưởng bao gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinin. Tỉ lệ, hàm lượng hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng này trong môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy khác nhau[5]. - Nhóm auxin: Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính. Một số loại auxin thường dùng trong nuôi cấy: IAA ( Indole acetic acid); IBA (Indole butyric acid); 2.4-D (2.4 - Dichlorophenoxy acetic acid) ; α-NAA (α-Naphthalene acetic acid). Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, phạm vi sử dụng từ 0.1 - 1mg tuỳ theo mục đích và vật liệu nuôi cấy. Auxin được thêm vào sẽ kết hợp với các auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ các quá trình sinh trưởng [18] .Tuỳ theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy... mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hoá sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo [20]. - Nhóm cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro. Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy. Vì thế, trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt auxin là cần thiết nhưng trong giai đoạn sau của phôi phải được nuôi cấy trên môi trường có cytokinin để biệt hoá chồi [21]. Một số loại cytokinin thường dùng trong nuôi cấy: zeatin; kinetin; BAP,…Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0.1-2.0mg/l. ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Ngược lại, ở nồng độ thấp hơn, cytokinin biểu hiện hiệu quả kích thích kém, dẫn đến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm. Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần cả hai. Còn đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tổ hợp tỉ lệ khác nhau [20]. Theo Bhojwani(1980) ở một số loài, môi trường nuôi cấy chỉ có một loại cytokinin cũng cho hệ số tạo chồi cực đại. Với các cây ngũ cốc sự phối hợp của hai hay nhiều loại cytokinin cho kết quả tốt hơn khi sử dụng cytokinin riêng rẽ. Tuy nhiên, muốn có tương quan sinh trưởng tối ưu thì phải có cân bằng hormone thích hợp. Sự biệt hoá cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo thành rễ, ngược lại sẽ đẩy mạnh sự biệt hoá chồi, còn nếu tỷ lệ đó là trung bình thì mô sẹo được hình thành. Đó là nguyên tắc chung, còn phản ứng của các loại mô là không giống nhau [25]. Vì thế mỗi loại mô ở từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì tổ hợp nồng độ giữa auxin và cytokinin là rất quan trọng. Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy người ta còn sử dụng thêm các chất điều hoà sinh trưởng khác như GA (thông dụng nhất là GA3), ABA, etylen,…Sự có mặt của GA3 trong môi trường