Đề tài Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM)

B ộ K H C N V iệ n T h ú y B ộ K H C N V iệ n T h ú y Bộ khoa học, công nghệ và môi tr−ờng Viện Thú Y 86, Đ−ờng Tr−ờng Chinh - Đống Đa – Hà Nội Báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.06: Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nh−ợc độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM) Chủ nhiệm đề tài: TS. Tô Long Thành 6102 19/9/2006 Hà Nội – 2005 Bản quyền 2005 thuộc Viện Thú y. Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện tr−ởng Viện Thú y trừ tr−ờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu. Bộ KH CN Viện Thú y Mục lục Trang Các đề tài nhánh của đề tài kc.04.06 2 Danh sách cán bộ tham gia 3 Danh sách các đon vị tham gia, phối hợp 5 tóm tắt Báo cáo 6 Những từ viết tắt 13 Lời nói đầu 14 Ch−ơng I Tổng quan tài liệu 24 1.1. Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 24 1.1.1. Vài nét về lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng 24 1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trên thế giới 24 1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam 25 1.1.2. Tóm l−ợc về nghiên cứu vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng 26 1.1.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida 27 1.1.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn P. multocida 27 1.1.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn 27 1.1.3.3. Tính chất bắt màu của vi khuẩn. 28 1.1.3.4. Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn P. multocida 28 1.1.3.5. Đặc tính sinh hoá của Pasteurella multocida 31 1.1.3.6. Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida 32 1.1.3.7. Độc tố của Pasteurella multocida 32 1.1.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 33 1.1.4.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen). 33 1.1.4.2. Kháng nguyên thân (O) - Somatic antigen. 34 1.1.5. Các type huyết thanh học của P. multocida. 35 1.2. Bệnh và vấn đề an toàn, vệ sinh thực phẩm do vi khuẩn Salmonella spp gây ra ở gia cầm. 37 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella. 37 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong n−ớc. 39 1.2.3. Đặc điểm của Salmonella. 41 1.2.4. Tình trạng ngộ độc thức ăn do Salmonella. 41 1.2.5. Biện pháp phòng bệnh. 42 1.2.6. vắc-xin chống Salmonella cho gà 43 1.2.6.1. Một số loại vaccine chống Salmonella 43 1.2.6.2. Sơ l−ợc về kháng nguyên roi của S. typhimurium 44 1.2.6.3. Kháng nguyên roi của Salmonella typhimurium có khả năng bảo hộ cho gà chống Salmonella. 45 1.2.6.4. Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein flagellin 46 1.3. Bệnh Lở mồm Long móng 47 1.3.1. Bệnh Lở mồm Long móng và tình hình nghiên cứu về bệnh trong, ngoài n−ớc. 47 1.3.1.1. Bệnh Lở mồm Long móng, tình hình bệnh trên thế giới và ở Việt Nam. 47 1.3.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới. 49 1.3.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trong n−ớc. 51 1.3.2. Vi rút gây bệnh LMLM. 52 1.3.2.1. Hình thái học. 52 1.3.2.2. Sức đề kháng của vi rút. 52 1.3.2.3. Đặc tính nuôi cấy. 52 1.3.3. Các ph−ơng pháp chẩn đoán. 53 1.3.3.1. Chẩn đoán lâm sàng. 53 1.3.3.2. Đại c−ơng về chẩn đoán trong phòng thí nghiệm. 53 1.3.3.3. Chẩn đoán huyết thanh học. 54 1.3.3.3.1. Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) 54 1.3.3.3.2. Phản ứng trung hoà vi rút. 55 1.3.3.3.3. Phản ứng ELISA. 55 1.3.3.3.4. Các phản ứng huyết thanh học khác 56 1.3.3.4. Chẩn đoán vi rút học. 56 1.3.3.5. Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR. 56 Ch−ơng II: Nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu 58 A. Nguyên liệu 58 2.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao. 58 2.1.1. Động vật thí nghiệm. 58 2.1.2. Vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng. 58 2.1.3. Dụng cụ máy móc thí nghiệm. 58 2.1.4. Môi tr−ờng, hoá chất 58 2.2. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 59 2.2.1. Động vật và sản phẩm động vật. 59 2.2.2. Các loại môi tr−ờng thông th−ờng. 59 2.2.3. Các loại môi tr−ờng chuyên biết. 60 2.2.4. Các trang thiết bị phòng thí nghiệm cần thiết khác. 62 2.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp. 62 2.3.1. Chủng vi sinh vật. 62 2.3.2. Động vật. 62 2.3.3. Plasmid. 62 2.3.4. Môi tr−ờng nuôi cấy. 63 2.3.5 Các dung dịch. 63 2.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR. 64 2.4.1. Bệnh phẩm. 64 2.4.2. Nguồn bệnh phẩm. 64 2.4.3. Dung dịch bảo quản bệnh phẩm. 64 2.4.4. Tế bào BHK- 21 và môi tr−ờng nuôi cấy tế bào. 65 2.4.5. Hoá chất, vật liệu và thiết bị để tiến hành phản ứng RT-PCR. 65 2.4.5.1. Mẫu ARN chuẩn. 65 2.4.5.2. Các hoá chất, vật liệu cần thiết tiến hành phản ứng RT- PCR. 65 2.4.5.3. Các hóa chất, vật liệu cần thiết cho việc tách dòng (cloning). 65 2.4.5.4. Thiết bị, máy móc. 66 2.4.5.5. Các cặp mồi đặc hiệu với vi rút LMLM type O, A , C hoặc Asia-1. 66 B. Ph−ơng pháp nghiên cứu 66 3.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao. 66 3.1.1. Kiểm tra giống vi khuẩn dùng để nghiên cứu và sản xuất vacxin. 66 3.1.2. Xác định đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hoá của vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò chủng IR. 67 3.1.3. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn đối với chuột nhắt trắng. 69 3.1.4. Sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có chất bổ trợ keo phèn – Saponin. 71 3.1.5. Kiểm nghiệm vắc xin 72 3.1.5.1. Kiểm tra vô trùng vắc xin. 72 3.1.5.2 Kiểm tra an toàn vacxin 72 3.1.5.3. Kiểm tra hiệu lực của vacxin. 72 3.1.5.3.1. Kiểm tra hiệu lực của vacxin trong phòng thí nghiệm. 72 3.1.5.3.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của vacxin đối với trâu, bò. 72 3.1.6. Ph−ơng pháp xử lý số liệu. 76 3.1.6.1. Ph−ơng pháp tính chỉ số miễn dịch. 76 3.1.6.2. Ph−ơng pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê. 76 3.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 77 3.2.1. Các ph−ơng pháp vi sinh vật học thông th−ờng. 77 3.2.2. Các ph−ơng pháp sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin. 77 3.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp. 78 3.3.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn. 78 3.3.2. Ph−ơng pháp tổng hợp chuỗi (PCR). 78 3.3.3. Xử lý ADN bằng enzym hạn chế. 78 3.3.4. Phản ứng nối ghép gen. 79 3.3.5. Biến nạp vào E. coli. 79 3.3.6. Tách chiết ADN plasmid từ E. coli. 80 3.3.7. Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp. 81 3.3.8. Biến nạp plasmid vào nấm men P. pastoris bằng xung điện. 82 3.3.9. Western Blot, ELISA. 83 3.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR. 84 3.4.1. Các ph−ơng pháp chẩn đoán, định typ vi rút LMLM của Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế. 84 3.4.2. Ph−ơng pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm. 84 3.4.3. Ph−ơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định type vi rút LMLM. 86 3.4.3.1. Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô. 86 3.4.3.2. Tạo cADN bằng phản ứng sao chép ng−ợc. 86 3.4.3.3. Phản ứng PCR. 86 3.4.3.5. Kiểm tra sản phẩm PCR. 87 3.4.4. Tách dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho serotype O của vi rút gây bệnh LMLM phân lập tại Việt nam. 88 3.4.4.1. Lai sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCRR2.1 và biến nạp vào tế bào khả biến (competent E. coli cells). 88 3.4.4.2. Tách chiết Plasmid. 89 3.4.4.3. Cắt bằng enzym giới hạn. 89 3.4.5. Ph−ơng pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút gây bệnh LMLM. 90 3.4.5.1. Ph−ơng pháp nuôi tế bào BHK-21 (Baby Hamster Kidney - 21). 90 3.4.5.2. Ph−ơng pháp tách tế bào bám dính. 90 3.4.5.3. Ph−ơng pháp gây nhiễm vi rút LMLM lên tế bào BHK-21. 90 Ch−ơng III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 92 4.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao. 92 4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ trâu bò chết của các địa ph−ơng. 92 4.1.2. Tính t−ơng đồng kháng nguyên giữa vi khuẩn P. multocida chủng IR với đại diện các chủng P. multocida phân lập đ−ợc. 95 4.1.3. Kết quả xác định liều kháng nguyên thích hợp kích thích khả năng sản sinh miễn dịch tốt nhất trên trâu bò. 96 4.1.4. Kết quả xác định công thức bổ trợ thích hợp và theo dõi độ dài miễn dịch của vắc xin keo phèn-saponin. 97 4.1.5. Kết quả chế vắc xin tụ huyết trùng trâu bò keo phèn- saponin chủng IR. 98 4.1.6. Tính t−ơng đồng kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida chủng IR với các chủng P. multocida khác đang sử dụng chế vắc xin THT trâu bò tại Việt Nam. 99 4.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 99 4.2.1. Kết quả điều tra một vài đặc điểm dịch tễ tại 4 cơ sở chăn nuôi gà giống. 99 4.2.2. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. 100 4.2.3. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Salmonella phân lập đ−ợc. 102 4.2.4. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập đ−ợc trên chuột nhắt trắng. 104 4.2.5. Kết quả thử khả năng mọc của các chủng Salmonella trên các loại môi tr−ờng dinh d−ỡng khác nhau. 105 4.2.6. Kết quả thử đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella 106 4.2.7. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập đ−ợc 106 4.2.8. Kết quả xác định LD 50 của các chủng Salmonella phân lập đ−ợc 107 4.2.9. Sản xuất thử nghiệm vacxin S. enteritidis và S. Typhimurium vô hoạt keo phèn 108 4.2.10. Kết quả thử thuần khiết vacxin 108 4.2.11. Kết quả thử vô trùng của vacxin 108 4.2.12. Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trắng 109 4.2.13. Kết quả thử an toàn trên gà mái hậu bị 110 4.2.14. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 110 4.2.15. Kết quả thử nghiệm hiệu lực của vác xin trên gà 111 4.2.16. Thí nghiệm xác định liều sử dụng của vacxin 111 4.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp 113 4.3.1. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 113 4.3.1.1. Đ−a gen vào vectơ pCR2.1 113 4.3.1.1.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn 113 4.3.1.1.2.Nhân đoạn gen fliC3, gm3, sef14 từ hệ gen S. typhimurium, S. enteritidis 114 4.3.1.1.3. Đ−a sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1 115 4.3.1.2. Đ−a gen vào vectơ biểu hiện pET22b(+) 119 4.3.1.3. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 120 4.3.2. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong nấm men P. pastoris 122 4.3.2.1. Nhân các gen bằng PCR 122 4.3.2.2. Đ−a gen vào vectơ tách dòng pCR2.1 123 4.3.2.3. Đ−a gen vào vectơ biểu hiện pPIC9 123 4.3.2.4. Biểu hiện gen trong nấm men P. pastoris 125 4.3.3. Thử đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên tái tổ hợp Flic3 126 4.3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp FliC 126 4.3.3.2. Gây miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp FliC và kháng nguyên toàn phần trên gà hậu bị 127 4.3.3.3. Western blot và ELISA 127 4.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp GM3 131 4.3.5. Nghiên cứu khả năng bảo hộ của protein tái tổ hợp Flic3 và Gm3 132 4.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR 134 4.4.1. Khái quát tình hình dịch bệnh LMLM tại Việt Nam trong vòng 5 năm trở lại đây thời gian gần đây 134 4.4.2. Diễn biến lâm sàng của bệnh trên bò và lợn 136 4.4.3. Thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh 138 4.4.3.1. Thu thập bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 138 4.4.3.2. Vận chuyển bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139 4.4.3.3. Bảo quản mẫu bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139 4.4.4. Thiết lập ph−ơng pháp RT–PCR để phát hiện vi rút gây bệnh LMLM bằng mẫu ARN đã biết 140 4.4.5. Chẩn đoán định type các mẫu bệnh phẩm thu thập tại tỉnh Qủang Trị 143 4.4.6. Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi dùng trong chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM. 145 4.4.7. Kết quả ứng dụng ph−ơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định typ vi rút LMLM từ các bệnh phẩm thu thập từ thực địa 147 4.4.8. Tách dòng và giải trình trình tự đoạn gene mã hoá cho serotype O của vi rut LMLM thu thập tại tỉnh Qủang Trị 149 4.4.8.1. Tách dòng đoạn gene đặc hiệu chung để nhận biết các type O, A, C, và asia-1 và đoạn gene đặc hiệu cho typ O 149 4.4.8.2. Kết quả giải trình trình tự nuclêotide 151 4.4.9. Kết quả phân lập vi rút trên tế bào dòng BHK-21 153 4.4.9.1 Điều kiện làm việc với vi rút LMLM 153 4.4.9.2. Kết quả nuôi cấy và duy trì tế bào BHK-21 153 4.4.9.3. Kết quả gây nhiễm bệnh phẩm nghi có chứa vi rút LMLM lên tế bào BHK-21 155 4.4.9.4. So sánh chẩn đoán vi rút LMLM bằng RT-PCR từ bệnh phẩm biểu mô và từ bệnh phẩm biểu mô đã cấy chuyển trên tế bào 156 4.4.10. So sánh ph−ơng pháp ELISA và RT-PCR để chẩn đoán- định typ virut LMLM 158 4.4.11. Nhận xét tổng quan về ph−ơng pháp RT-PCR trong chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM 160 Ch−ơng IVKết luận và đề nghị 163 Kết luận 163 I. Các chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm 163 II. Về nội dung và ph−ơng pháp sử dụng 163 III. Về giải pháp khoa học công nghệ 164 IV. Các sản phẩm cụ thể 165 Đề nghị 165 Lời cảm ơn 166 Tài liệu tham khảo 167 2 Các đề tài nhánh của đề tài kc.04.06 TT Mã số Tên đề tài nhánh Cơ quan của chủ nhiệm đề tài nhánh 1 KC.04.06.01 Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao ThS. Hoàng Xuân Nghinh Viện Thú y 2 KC.04.06.02 Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhi murium bằng công nghệ vi khuẩn. TS. Trần Thị Hạnh Viện Thú y 3 KC.04.06.03 Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhi murium bằng vi khuẩn biến nạp. TS. Tr−ơng Nam Hải Viện Công nghệ Sinh học 4 KC.04.06.04 Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR). TS. Tô Long Thành Viện Thú y 3 Danh sách cán bộ tham gia TT Họ và Tên Học vị chuyên môn Cơ quan công tác 1 Tr−ơng Văn Dung PGS. TS Viện Thú y 2 Hoàng Xuân Nghinh Th.S Viện Thú y 3 Đỗ Tuấn C−ơng BSTY Viện Thú y 4 Trần Ngọc ánh Th.S Viện Thú y 5 Nguyễn Lại Hoàn TS Viện Thú y 6 Tr−ơng Thị Hồng Hoa BSTY Viện Thú y 7 Lê Văn Phan BSTY Viện Thú y 8 Nguyễn Thị Bích BSTY Viện Thú y 9 Đặng Vũ Hoàng BSTY Viện Thú y 10 Trần Thị Thanh Hà BSTY Viện Thú y 11 Trần Thu Hiền Th.S Công Ty Hanvet 12 Nguyễn Thị Nguyệt Th.S Công Ty Hanvet 13 Nguyễn Lê Văn Th.S Viện Chăn nuôi 14 Trần Thị Hạnh TS Viện Thú y 15 Nguyễn Tiến Thành BSTY Viện Thú y 16 Đặng Thị Thanh Sơn BSTY Viện Thú y 17 Ngô Chung Thủy BSTY Viện Thú y 18 Trịnh Phú Ngọc TS Viện Thú y 19 Đặng Đình Th−ởng BSTY Viện Thú y 4 20 Thái Kim Thanh KTV Viện Thú y 21 Hoàng Quang Thỏa Th.S TT Thú y vùng Hà Nội 22 Lê Thị Thi BSTY Phân Viện TY NT 23 Lâm Minh Thuận BSTY ĐH Nông lâm Thủ Đức 24 Nguyễn Thị Hoa Lý TS Trung tâm kiểm tra Vệ sinh Thú y TW2 25 Tr−ơng Nam Hải TS Viện Công nghệ SH 26 Nguyễn Thanh Thuỷ CN Viện Công nghệ SH 27 Đỗ Thị Huyền Th.S Viện Công nghệ SH 28 Trần Ngọc Tân CN Viện Công nghệ SH 29 Nguyễn Hồng Thanh CN Viện Công nghệ SH 30 Nguyễn Thị Trung Th.S Viện Công nghệ SH 31 Nguyễn Thành Trung SV Đại học KH TN 32 Nguyễn Thị Thu Hằng SV Đại học KH TN 33 Nguyễn Minh Giang SV Đại học SP Hà Nội 34 Bùi Thị Tố Nga SV Đại học NN I 35 Nguyễn Ph−ơng Giang SV Đại học NN I 36 Nguyễn Thị H−ơng SV Đại học NN I 37 Đinh Duy Kháng TS Viện Công nghệ SH 38 D−ơng Hồng Quân CN Viện Công nghệ SH 5 Danh sách các đơn vị tham gia, phối hợp TT Đơn vị 1 Viện Thú y 2 Viện Công nghệ Sinh học 3 Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng 4 Trung tâm Thú y vùng Thành phố Hồ Chí Minh 5 Chi Cục Thú y tirnh Lạng Sơn 6 Chi Cục Thú y tỉnh Phú Thọ 7 Chi Cục Thú y tỉnh Bắc Giang 8 Chi Cục Thú y tỉnh Thái Bình 9 Chi Cục Thú y tỉnh Ninh Thuận 10 Chi Cục Thú y tỉnh Thừa Thiên Huế 11 Chi Cục Thú y tỉnh Quảng Trị 12 Chi Cục Thú y tỉnh Daklak 13 TT Thú y vùng Hà Nội 14 Phân Viện TY NT 15 ĐH Nông lâm Thủ Đức 16 Trung tâm kiểm tra Vệ sinh Thú y TW2 6 tóm tắt Báo cáo Đề tài: Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nh−ợc độc vô hoạt phòng bệnh cho giá súc, gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gen xác định loại vi rut Lở mồm Long móng (LMLM) Mã số: KC.04.06. Thuộc Ch−ơng trình Khoa học Công nghệ cấp Nhà n−ớc KC.04 “nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ sinh học” giai đoạn 2001-2005. Theo tinh thần của Hợp Đồng "Nghiên cứu Khoa học và Phát triển Công nghệ số: 06/2001/HĐ - ĐTCT – KC – 04.06 ký ngày 24 tháng 10 năm 2001 giữa Ban Chủ nhiệm Ch−ơng trình KC-04 - đại diện cho Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi tr−ờng với Viện Thú y – là cơ quan Chủ trì Đề tài và Chủ nhiệm Đề tài, Đề tài KC.04.06 có ba mục tiêu nh− sau: - Tạo công nghệ sản xuất vắc xin nh−ợc độc biến nạp gen phòng bệnh cho gà. - Tạo chủng vi khuẩn tụ huyết trùng để sản xuất vắc xin. - Định type vi rut LMLM để lựa chọn vắc xin phù hợp. Đề tài đ−ợc thực hiện từ tháng 11 năm 2001 và kết thúc vào tháng 12 năm 2004 với tổng số kinh phí là 2700 triệu đồng trong đó kinh phí từ ngân sách nhà n−ớc là 2600 triệu đồng. Để thực hiện các mục tiêu của Đề tài theo nh− Hợp đồng đã yêu cầu, chúng tôi đã lựa chọn; với sự chấp thuận của Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi Tr−ờng, 4 đề tài nhánh (xem Bảng 1) với các nội dung nghiên cứu khác nhau nhằm đ−a ra các công nghệ sản xuất thích hợp để có đ−ợc các loại vắc xin sẽ đ−ợc sử dụng trong phòng chống bệnh Tụ huyết trùng trâu bò – là bệnh gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi trâu bò của n−ớc ta và vấn đề ô nhiễm thực phẩm do Salmonella enteritidis và Salmonella typhi 7 murium gây ra ở các sản phẩm của từ gia cầm – đây là những mầm bệnh có tầm quan trọng về y tế, đặc biệt liên quan đến vấn đề an toàn thực phẩm. Đối với bệnh Lở mồm Long móng (LMLM) – là một bệnh đặc biệt nguy hiểm của động vật guốc chẵn, mục tiêu của đề tài là thiết lập ph−ơng pháp chẩn đoán-định type vi rút gây bệnh LMLM bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR). Một trong những ứng dụng thực tiễn của ph−ơng pháp này là xác định type vi rút gây bệnh LMLM một cách nhanh chóng và chính xác để lựa chọn và sử dụng vắc xin thích hợp. Bảng 1. Phân công chủ đề nghiên cứu và Chủ trì các Đề tài nhánh TT Mã số nhánh Đề tài nhánh Chủ trì Cơ quan 1 KC.04.06.01. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao Hoàng Xuân Nghinh Viện TY 2 KC.04.06.02. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhi murium bằng công nghệ vi khuẩn Trần Thị Hạnh Viện TY 3 KC.04.06.03. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhi murium bằng vi khuẩn biến nạp Tr−ơng Nam Hải Viện CNSH 4 KC.04.06.04. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR Tô Long Thành Viện TY Đề tài bắt đầu đ−ợc thực hiện vào cuối tháng 10 năm 2001 và kết thúc vào tháng 12 năm 2004 theo nh− thời l−ợng cho phép của Hợp đồng. Nhìn chung, theo kế hoạch nghiên cứu đã đ−ợc xác định cho từng năm, các đề tài nhánh đều hoàn thành công việc đúng tiến độ. Kết quả của từng đề tài nhánh mà chúng tôi tập hợp sau đây sẽ chứng minh điều đó. Tuy nhiên, Ban Chủ nhiệm đề tài của Viện Thú y cũng nh− Ban Chủ 8 nhiệm ch−ơng trình KC-04 đã thống nhất đánh giá và ghi nhận những cố gắng đã đạt đ−ợc của các đề tài nhánh thực hiện trên đối t−ợng gia cầm nhằm hoàn thành các nội dung của đề tài theo đúng tiến độ đề ra. Chúng ta đều biết trong thời gian thực hiện đề tài, dịch cúm gia cầm do vi rút H5N1 nổ ra vào cuối năm 2003 và vẫn âm ỉ cho đến hiện nay đã gây ảnh h−ởng không nhỏ đến việc thực hiện các thực nghiệm trên bản động vật. Cho đến thời điểm chúng tôi tổng kết Đề tài này, các đề tài nhánh đều hoàn thành các nội dung công việc đã đ−ợc ký với Ban Chủ nhiệm Ch−ơng trình. 1. Đề tài nhánh KC.04.06.01: Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao. Bằng việc phân lập vi khuẩn P. multocida gây bệnh Tụ huyết trùng trâu bò từ trâu bò bị bệnh tại một số địa ph−ơng trong n−ớc và so sánh tính t−ơng đồng kháng nguyên của chúng với các chủng vi khuẩn hiện đang đ−ợc sử dụng để chế tạo vắc xin, các tác giả đã lựa chọn c