Đề tài Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho chẩn đoán viêm não Nhật bản

Bộ Y tế đề tài KY 01 – 04 Đề tài nhánh của KY 01 – 04 Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho chẩn đoán viêm n∙o Nhật bản Chủ nhiệm đề tài nhánh KY 01 – 04 TS. Phan Thị Ngà 6612 27/10/2007 Hà nội 1991 - 1993 1 Mục B Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm Mac-elisa Dùng cho chẩn đoán viêm n∙o nhật bản (VNNB) I. Đặt vấn đề: Thử nghiệm miễn dịch enzym phát hiện kháng thể IgM kháng virut VNNB (IgM antibody Capture ELISA gọi tắt là MAC-ELISA) đ−ợc Bundo, K. và Igarashi, A. nghiên cứu và đ−a vào áp dụng trong chẩn đoán nhanh, sớm và đặc hiệu bệnh VNNB. Đây là một ph−ơng pháp chẩn đoán huyết thanh học mới có nhiều −u điểm nổi bật nh−: - Huyết thanh sử dụng cho thử nghiệm không phải xử lý mà vẫn tránh đ−ợc d−ơng tính giả với yếu tố thấp khớp. - Chẩn đoán sớm bệnh ngay sau khi mắc 2 - 4 ngày đầu. Chẩn đoán bệnh bằng một mẫu huyết thanh đơn. - Chẩn đoán đặc hiệu, có độ nhạy và chính xác cao. Chính vì vậy mà ph−ơng pháp chẩn đoán huyết thanh này nhanh chóng đ−ợc áp dụng ở nhiều n−ớc có l−u hành bệnh VNNB để xác định căn nguyên. Để áp dụng thử nghiệm MAC-ELISA trong chẩn đoán nhanh và sớm bệnh VNNB, thì việc sử dụng sinh phẩm d−ới dạng những bộ sinh phẩm là rất thuận tiện cho việc áp dụng thử nghiệm này. Do vậy mục đích nghiên cứu của chúng tôi là: Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho chẩn đoán nhanh bệnh VNNB. II. Vật liệu: 1. Vật liệu để chế tạo sinh phẩm: 1.1. Động vật thí nghiệm: - Chuột nhắt trắng giống Swiss loại 2 - 3 ngày tuổi. - Chuột nhắt trắng giống Swiss 11 - 13 gam. Do trung tâm nghiên cứu và sản xuất động vật thí nghiệm Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Học Hà Nội cung cấp. 2 1.2. Các hoá chất: - Sucroza - axeton. - axit Boric - Albumin bò. - Tá d−ợc Freund - Horse - Raddish - Peroxidaza - Sephacryl S200 - O-Phenylene Diamine (OPD) - Các muối: + axit citric + axit H2SO4 + KCl + NaH2PO4 + H2O2 + Na2CO3 + NaHCO3 + Na2HPO4. 12H2O. + O-Phenylene diamine + Twcen 20 1.3. Dụng cụ: - Bơm tiêm 1 ml, 2ml, 5ml. - Pipet 1 ml, 2ml, 5ml, 10ml. - Tấm nhựa làm ELISA đáy bằng 96 giếng, - Pipet man loại 20 àl, 100 àl, 1000 àl - Pipet man 8 kênh 50-250 àl - Đầu típ cho các loại pipet man trên - Các dụng cụ thuỷ tinh trung tính và các đồ dùng phòng thí nghiệm cần thiết khác. 3 1.4. Thiết bị phòng thí nghiệm - Buồng vô trùng - Máy nghiền não - Máy li tâm lạnh 40C (10.000 v/p) - Tủ lạnh 40C, - 200C, - 700C - Tủ ấm 370C - Tủ xấy - Máy đo pH - Cân chính xác - Máy hút chân không - Máy quay điện từ - Máy đọc ELISA - Máy đông khô sinh phẩm 2. Sinh phẩm 2.1. Các sinh phẩm chuẩn - Kháng nguyên VNNB chủng Nak. Biken Nhật Bản - IgG chuột kháng virut VNNB chủng Nak. gắn Peroxydaza của Viện Biken, Nhật Bản. - Kháng IgM ng−ời đặc hiệu chuỗi à của cappel USA. sản xuất. 2.2. Các sinh phẩm tạo bộ sinh phẩm MAC-ELISA. - Kháng nguyên VNNB do phòng thí nghiệm Viêm não sản xuất - Huyết thanh mẫu chứng d−ơng và chứng âm do phòng thí nghiệm Viêm não cung cấp. - IgG chuột kháng virut VNNB gắn Peroxydaza do phòng thí nghiệm Hoá sinh và phòng thí nghiệm Viêm não sản xuất. - Kháng IgM ng−ời đặc hiệu chuỗi à của Cappel USA. 3. Mẫu bệnh phẩm cho kiểm tra bộ sinh phẩm: - Các mẫu bệnh phẩm đ−ợc lấy từ những bệnh nhân có hội chứng não cấp ch−a rõ căn nguyên ở mọi lứa tuổi (bệnh nhân điều trị tại các bệnh viện hoặc các ổ dịch và nghi là VNNB) 4 - Thời gian lấy mẫu: Sau khi mắc bệnh 1 - 2 ngày cho đến 60 ngày sau. - Bệnh phẩm: Huyết thanh bệnh nhân lấy 0,1 ml - 1ml. III. Ph−ơng pháp. 1. Quy trình sản xuất kháng nguyên VNNB Nakayama theo ph−ơng pháp SUCROZA-AXETON: - Não chuột ổ nhiễm virut VNNB đ−ợc nghiền đồng nhất 20% trong sucroza 8,5% bằng máy nghiền Nissei - Nhật Bản 2000 v/p trong 5 phút. - Cho một thể tích hỗn dịch virut này vào 20 thể tích axêton lạnh. - Ly tâm 1.800 v/p trong 15 phút loại bỏ n−ớc nổi. - Làm tan cặn này bằng một thể tích axeton lạnh nh− trên để 40C/60 phút. - Ly tâm 1.800 v/p trong 15 phút loại bỏ n−ớc nổi. Hoà cặn này bằng axeton lạnh cho vào trong tube ly tâm 1.800 v/p trong 15 phút loại bỏ n−ớc nổi. - Trải rộng cặn trong tube và làm khô bằng máy hút chân không từ 1 - 2 giờ. - Làm tan cặn bằng đệm Borat pH.9 có 0,4% Albumin bò để 40C qua đêm. - Ly tâm 10.000 v/p trong 60 phút ở 40C lấy n−ớc nổi kiểm tra hiệu giá bằng phản ứng ng−ng kết hồng cầu (kháng nguyên dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA hiệu giá phải đạt >1/256). - Xác định hiệu giá thích hợp dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA. - Đông khô kháng nguyên, kiểm tra lại hiệu giá sau đông khô. 2. Quy trình sản xuất kháng thể virut VNNB gắn HRPO: 2.1. Quy trình sản xuất kháng thể kháng virut VNNB (Nak): - Cách gây miễn dịch cho chuột Swiss 11- 13 gam: + Số lần gây miễn dịch: 5 lần, mỗi lần cách nhau 7 ngày. + Liều gây miễn dịch: 0,2 ml hỗn dịch virut (văcxin VNNB) với tá d−ợc Freund theo tỷ lệ 1/1 + Đ−ờng tiêm: Tiêm vào phúc mạc. - Lấy máu tim để kiểm tra hiệu giá kháng thể (ít nhất là 3 con chuột) sau mũi tiêm thứ 4. - Kiểm tra hiệu giá bằng phản ứng ngăn ng−ng kết hồng cầu hoặc bằng kỹ 5 thuật trung hoà trên tế baò nếu kết quả đạt: + Phản ứng ngăn ng−ng kết hồng cầu hiệu giá > 1/1.000 + Kỹ thuật trung hoà trên tế bào hiệu giá > 106 - Lấy máu tách huyết thanh: Lấy máu cho vào tube để nghiêng ở nhiệt độ phòng cho đông, đề vào 370C/60p. Rồi để ở 40C qua đêm để tách lấy huyết thanh. 2.2. Quy trình sản xuất kháng thể IgG kháng virut VNNB gắn HRPO: 2.2.1. Tinh chế IgG kháng virut VNNB. a. Pha loãng kháng thể virut VNNB trong PBS theo tỷ lệ 1/2. b. Cho 1 thể tích loãng dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà vào 1 thể tích kháng thể đã pha loãng trên. c. Quay điện từ ở phòng thí nghiệm 20 phút. d. Ly tâm 10.000 v/p trong 20 phút loại bỏ n−ớc nổi. e. Làm tan cặn bằng PBS và thêm dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà để có nồng độ cuối cùng là 39%. f. Quay điện từ ở phòng thí nghiệm ít nhất 20 phút. g. Ly tâm 10.000 v/p trong 20 phút. h. Loại bỏ n−ớc nổi và làm tan cặn với PBS (làm nhắc lại nh− các b−ớc e, f, g, thêm 2 lần nữa. i. Hoà tan cặn với một l−ợng PBS nhỏ nhất, thẩm tích trong PBS loại bỏ (NH4)2SO4 ở 4 0C qua đêm. 6 k. Cho qua cột trao đổi Ion Sephacryl: S200) để chọn các mẫu có chứa IgG kháng virut VNNB. l. Hộn các mẫu có chứa IgG, cô đặc bằng áp lực chân không. Kháng thể tinh chế này dùng để làm cộng hợp enzym. 2.2.2. Gắn IgG kháng virut VNNB tinh khiết với HRPO: Quay điện từ ở phòng thí nghiệm trong 2 giờ (tránh ánh sáng). Để ở 40C t rong 2 giờ không quay điện từ. Cho qua cột trao đổi Ion (Sephacryl: S200). Thu các mẫu và đo ở b−ớc sóng 280nm, 403nm. Tính tỷ số mật độ quang học (OD) của b−ớc sóng 403/280. Hộn các mẫu có tỷ số trong khoảng 0,3 - 0,6. Thêm 0,1% Albumin bò (chất làm bền vững). Xác định hiệu giá thích hợp dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA Đông khô. 3. Chọn mẫu huyết thanh chứng d−ơng và chứng âm: 3.1. Chọn mẫu huyết thanh d−ơng tính: - Huyết thanh bệnh nhân có hội chứng não cấp nghi VNNB đ−ợc làm xét Thẩm tích IgG (100mg) trong dung dịch 0,01M Carbonat pH 9,6 ở 40C qua đêm 30 mg HRPO pha trong 12,3 ml n−ớc cất cho 2,5ml 0,1M NaIO quay điện từ 20 phút ở phòng thí nghiệm. Thẩm tích trong dung dịch 1M Acetat pH 4,5 ở phòng thí nghiệm qua đêm Điều chỉnh pH tới 9,5 bằng dung dịch 1M Cacbonat pH 9,6 + 7 nghiệm bằng kỹ thuật HI chọn mẫu xác định d−ơng tính có hiệu giá >1/80. Kiểm tra lại bằng thử nghiệm MAC-ELISA từng mẫu huyết thanh riêng (có đối chiếu với huyết thanh mẫu d−ơng chuẩn của Viện Nagasaki Nhật Bản). - Những mẫu huyết thanh thoả mãn hai điều kiện: - Hiệu giá HI > 1/80 - MAC - ELISA d−ơng tính (OD mẫu thử/OD chứng âm >2). 3.2. Chọn mẫu huyết thanh âm tính: - Huyết thanh ng−ời lành ở vùng không có l−u hành dịch VNNB đ−ợc làm xét nghiệm kiểm tra bằng kỹ thuật HI và MAC-ELISA xác định âm tính (có đối chiếu với huyết thanh mẫu âm chuẩn của Viện Nagasaki). 4. Pha các dung dịch đệm cho bộ sinh phẩm. 4.1. Dung dịch phủ bản pH. 9,6: Na2CO3 1,59 g NaHCO3 2,93 g NaN3 0,2 g N−ớc cất vừa đủ 100 ml 4.2. Dung dịch 0,05M Citrat phopat pH 5,0 đặc 10 lần: axit Citric 5,04 g Na2HPO412H2o 17,90 g 4.3. Pha dung dịch 0,05M Citrat phophat pH.5,0 đặc 10 lần có H2O2: 1 ml dung dịch Citrat phophat pH.5,0 đặc 10 lần 0,003 ml H2O2 4.4. Pha dung dịch axit dừng phản ứng: H2SO4 đậm đặc 10,6 ml (Chú ý cho từ từ axit đậm đặc vào n−ớc) 8 4.5. PBS tinh thể: NaCl 8,0 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g (Khi dùng pha trong 1.000 ml n−ớc cất) * Các dung dịch đệm và hoá chất đ−ợc đóng lọ đủ dùng cho từng bộ sinh phẩm 96 thử nghiệm. 5. Cố định kháng thể IgG kháng IgM ng−ời đặc hiệu chuỗi à trên phiến nhựa 96 ghiếng: - Chuẩn độ hiệu giá kháng thể kháng IgM ng−ời theo ph−ơng pháp của Bundo, K. và Igarashi, A. để xác định hiệu giá thích hợp. - Pha kháng thể kháng IgM ng−ời trong dung dịch phủ bản pH 9,6 - Cho vào các giếng của bản nhựa mỗi ghiếng 100 àl, để 40C qua đêm. - Rửa bản nhựa bằng dung dịch PBS-T 5 lần - Các bản nhựa đã cố định kháng thể IgG đ−ợc bọc kín bằng giấy bạc bảo quản ở 40C hoặc -200C. 6. Nguyên lý thử nghiệm MAC-ELISA: Nguyên lý: Thử nghiệm Miễn dịch enzym phát hiện kháng thể IgM kháng virut viêm não Nhật Bản (IgM Antibody Capture ELISA gọi tắt là MAC-ELISA) là một thử nghiệm miễn dịch gián tiếp để xác định sự có mặt của kháng thể IgM kháng virut VNNB trong huyết thanh hoặc n−ớc não tuỷ bệnh nhân. 9 Tóm tắt sơ đồ: Nguyên lý kỹ thuật MAC-ELISA Pha rắn 1 2 3 4 5 1. IgG thỏ kháng IgM ng−ời đặc hiệu chuỗi à. 2. Kháng thể IgM có trong máu hoặc dịch não tuỷ. 3. Kháng nguyên VNNB (Nak) 4. IgG chuột kháng vi rút VNNB gắn Peroxydaza. 5. Cơ chất hiện màu OPD. Tiêu chuẩn nhận định d−ơng tính đọc bằng máy đọc ELISA ở b−ớc sóng 492 nm. OD chứng d−ơng ------------------------------------- ≥ 2 OD chứng âm OD mẫu thử ------------------------------------- ≥ 2 OD chứng âm IV. Kết quả. Bảng 1. So sánh hiệu giá các sinh phẩm sản xuất: Sinh phẩm Viện BiKen Viện VSDT Hiệu giá - kháng nguyên > 1/2000 > 1/2000 Hiệu giá - Cộng hợp enzym > 1/2000 > 1/2000 10 Bảng 2. Theo dõi điều kiện và thời gian bảo quản sinh phẩm: Thời gian bảo quản Sinh phẩm Hình thức 400C - 200C 1. Tấm nhựa 96 giếng Đã gắn kháng IgM ng−ời 3 tháng 1 năm 2. Kháng nguyên VNNB Đông khô 3 tháng 3 năm 3. Huyết thanh âm Đông khô 3 tháng 3 năm 4. Huyếnt thanh d−ơng Đông khô 3 tháng 3 năm 5. IgG chuột kháng virut VNNB gắn HRPO Đông khô 3 tháng 3 năm 6. O-Phenylene diamine Tinh thể 3 tháng 1 năm 7. Đệm pha cơ chất có H2O2 (đặc 10 lần) Dung dịch 3 tháng 8. PBS (pha 1 lít) Tinh thể 12 tháng 9. Tween 20 Dung dịch 12 tháng 10. H2SO44N Dung dịch 12 tháng 11. N−ớc cất 2 lần 12 tháng Bảng 3. So sánh độ nhậy của 2 thử nghiệm HI và MAC-ELISA đối với 173 mẫu máu sớm (Lấy sau khi mắc bệnh 1 - 5 ngày, trong vụ dịch 1988) Kết quả Số mẫu MAC-ELISA HI 37 71 60 5 (+) (+) (-) (-) Có kháng thể (-) (-) Có kháng thể Tổng số 108/173 (62,42%) 42/173 (24,27%) 11 Bảng 4: Kết quả ứng dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA trong chẩn đoán và giám sát bệnh Dengue và VNNB Kết quả Loại mẫu bệnh phẩm Số mẫu Kháng nguyên VNNB (NaK) Kháng nguyên Dengue (D2) Máu ng−ời lành 1992 4 3 245 (+) (-) (-) (-) (+) (-) Máu bệnh nhân - Có chẩn đoán lâm sàng nghi VNNB - Sốt cao không rõ căn nguyên 40 2 (+) (-) (-) (+) Bảng 5: Sự phân bố VNNB đ−ợc xác định bằng MAC-ELISA theo lứa tuổi (1989 - 1991) Nhóm tuổi 0 - 4 5 - 9 10 - 14 15 - 19 > 19 Tổng số Xác định VNNB 174 169 38 2 18 401 43,39 42,14 9,48 0,50 4,49 100 % 85,53 9,48 4,99 100 12 Bảng 6: Những địa ph−ơng có bệnh nhân VNNB đã đ−ợc xác định bằng MAC-ELISA (1989 - 1991) Địa ph−ơng Chẩn đoán lâm sàng Xác định VNNB Nội thành 20 8 Hà Nội Ngoại thành 138 77 Hà Bắc 118 68 Hà Sơn Bình 117 64 Hải H−ng 104 66 Hà Nam Định 30 19 Thái Bình 2 2 Vĩnh Phú 28 14 Thanh Hoá 5 3 Lạng Sơn 4 3 Bắc Thái 12 9 Quảng Ninh 2 1 Không xác định 213 67 Tổng số 793 401 13 Bảng 7: Những địa ph−ơng có bệnh nhân VNNB đã đ−ợc xác định bằng MAC - ELISA 1992 Tỉnh/ thành phố Số mẫu xét nghiệm MAC - ELISA (+) Nội thành 7 5 Hà Nội Ngoại thành 29 24 Thái Bình 52 25 Ninh Bình 5 5 Thanh Hoá 2 2 Nam Hà 28 25 Hà Bắc 69 64 Vĩnh Phú 30 25 Hải H−ng 60 51 Bắc Thái 4 3 Quảng Ninh 1 1 Hà Tây 58 50 Hoà Bình 4 3 Nghệ An 2 0 Hà Tĩnh 1 1 Lai Châu 1 0 Lạng Sơn 3 2 Tuyên Quang 2 1 Yên Bái 4 1 Sơn La 1 0 Quảng Trị 1 1 Huế 28 11 Không rõ địa chỉ 138 39 Tổng số 530 339 14 V. Nhận xét và bàn luận 1. Các sinh phẩm sản xuất đạt hiệu giá cao, tinh khiết để sử dụng cho thử nghiệm MAC - ELISA hiệu giá kháng nguyên (kiểm tra bằng phản ứng ng−ng kết hồng cầu - HA) >1/2000, hiệu giá công hợp enzym >1/2000 (Bảng 1) 2. Qua theo dõi điều kiện bảo quản sinh phẩm đã xác định thời gian bảo quản sinh phẩm. - ở 40C trong 3 tháng - ở - 200C trong 3 năm 3. ứng dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA trong chẩn đoán nhanh và sớm bệnh VNNB thấy có những −u điểm nổi bật nh−: - Chẩn đoán bệnh với một mẫu huyết thanh, huyết thanh không phải xử lý, tránh đ−ợc d−ơng tính giả, chẩn đoán sớm bệnh. Trong 173 mẫu máu đơn (lấy sau khi mắc 1 - 5 ngày) thử nghiệm MAC-ELISA. Xác định d−ơng tính là 108/173 (62,42%) trong khi đó thử nghiệm HI chỉ xác định đ−ợc 42/172 (24,27%) mẫu có kháng thể. - Điều tra tình trạng nhiễm ẩn virut Dengue và virut VNNB trong 252 mẫu máu lấy ở ng−ời bình th−ờng tại Hải H−ng 6/1992. Bằng thử nghiệm MAC- ELISA có 245 mẫu âm tính với cả kháng nguyên Dengue và VNNB. Nh−ng có 4 mẫu d−ơng tính với kháng nguyên VNNB và âm tính với kháng nguyên Dengue, có 3 mãu d−ơng tính với kháng nguyên Dengue và âm tính với kháng nguyên VNNB. (Bảng 4) ứng dụng thử nghiệm MAC-ELISA chẩn đoán xác định bệnh cũng cho kết quả t−ơng tự, không có sự chéo giữa kháng nguyên viêm não và kháng nguyên Dengue. Nh− vậy MAC-ELISA là một thử nghiệm đặc hiệu, không chéo với kháng nguyên cùng nhóm Flavi virut, nó rất có ý nghĩa trong chẩn đoán, giám sát bệnh ở những nơi có l−u hành cả virut Dengue và virut VNNB nh− ở n−ớc ta. 4. Từ những kết quả chẩn đoán bệnh bằng thử nghiệm MAC-ELISA đã xác định một số đặc điểm dịch tễ về VNNB. 15 - Dịch th−ờng xảy ra về mùa hè đỉnh cao của dịch th−ờng là tháng 6, tỷ lệ xác định d−ơng tính vào thời điểm này là 216/295 (hình 1). - Tỷ lệ mắc VNNB cao nhất ở nhóm tuổi 0 - 9 (85,53%) bảng 5 - Kết quả xác định VNNB tại các tỉnh và thành phố không phản ánh đ−ợc thực chất tình hình bệnh VNNB tại các nơi đó, nh−ng nó có ý nghĩa trong việc xác định sự có mặt của virut VNNB tại các địa ph−ơng đó (bảng 6 và bảng 7). VI. Kết luận: Qua các kết quả đạt đ−ợc chúng tôi nhận thấy: 1. Các sinh phẩm sản xuất đạt hiệu giá cao và độ tinh khiết dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA - Kháng nguyên VNNB hiệu giá <2000 (phản ứng HA) - Cộng hợp enzym hiệu giá >2000 (ELISA) 2. Thời gian và điều kiện bảo quản sinh phẩm - ở điều kiện 40C bộ sinh phẩm có hạn dùng trong 3 tháng - ở điều kiện - 200C bộ sinh phẩm có hạn dùng 12 tháng. 3. Bộ sinh phẩm MAC - ELISA đ−ợc ứng dụng trong chẩn đoán bệnh VNNB cho kết quả nhanh, sớm chính xác.