Đề tài Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum

LỜI CẢM ƠN Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Tuân, thầy đã hướng dẫn em suốt quá trình thực hiện đề tài này. Trong quá trình làm việc cùng với thầy, em đã học hỏi được nhiều điều bổ ích, không chỉ là những kiến thức chuyên môn mà còn cả những kinh nghiệm khi làm việc. Khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài, thầy đã kịp thời hướng dẫn, chỉ bảo tận tình. Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thị Ngọc Anh, những lời truyền đạt của cô thật sự bổ ích cho em trong quá trình em làm luận văn tại trường. Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô đã giúp đỡ chúng em về mặt hóa chất phục vụ cho việc thực hiện đề tài. Em cảm ơn cô Thùy Dương - bộ môn Công nghệ Sinh học của trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em về nguồn vi sinh vật sử dụng trong đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất về mọi mặt giúp chúng em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp. Tôi cũng muốn bày tỏ sự cảm ơn đến tất cả các bạn bè của tơi, họ đã giúp đỡ, đặc biệt là cho tôi thấy được sự gắn bó, sự chia sẻ, sự cảm thông cũng như là những giây phút thư giãn trong khi làm việc. Tôi xin cảm ơn với tất cả lòng chân thành. Tp. HCM, ngày 07 tháng 01 năm 2008 Phan Anh Tuấn TÓM TẮT LUẬN VĂN Acetobacter xylinum (A. xylinum) là một vi khuẩn Gram âm, có thể sản xuất một loại polysaccharide ngoại bào được gọi là cellulose vi khuẩn. Cellulose vi khuẩn có khả năng được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và các lĩnh vực khác. Để ứng dụng cellulose vi khuẩn một cách rộng rãi, đòi hỏi có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào và ổn định. Gần đây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm đã được phát hiện và ứng dụng thực tế. Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện tĩnh, chúng tôi thực hiện khảo sát các yếu tố sau: Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên môi trường Hestrin-Schramm (HS). Cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum. Để khảo sát sự sinh tổng hợp cellulose, A. xylinum được nuôi cấy dưới điều kiện tĩnh trên môi trường HS ở các điều kiện khác nhau nhằm rút ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho chủng A. xylinum có sẵn. Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với quá trình tạo cellulose của vi khuẩn A. xylinum được tiến hành và thấy rằng, trong khoảng pH từ 4,0 đến pH 5,5, hiệu suất tổng hợp cellulose của chủng A. xylinum này là thích hợp nhất, lượng cellulose đạt được có thể ~5,2 gl-1. Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon bằng cách thay đổi nguồn carbon trong thành phần môi trường nuôi cấy, chọn được nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng A. xylinum sinh tổng hợp cellulose là mannitol. Lượng cellulose đạt được ~7,4 gl-1. Để chọn ra nguồn nitơ tốt nhất cho sự tổng hợp cellulose, một thí nghiệm được thực hiện với nguồn carbon là mannitol, nguồn nitơ được thay đổi, kết quả cho thấy cao nấm men cho kết quả tạo cellulose tốt nhất. Lượng cellulose đạt được ~8 gl-1 g. Khi khảo sát ảnh hưởng đồng thời của mannitol và cao nấm men lên quá trình tổng hợp cellulose của A. xylinum, hàm lượng cellulose thu được có thể đạt được ~8,5 gl-1 khi thành phần môi trường HS được điều chỉnh với hàm lượng mannitol 15,5 gl-1 và hàm lượng cao nấm men là 6,5 gl-1, pH môi trường được chỉnh xung quanh giá trị 5,0. Với kết quả thu được trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum có tại Phòng Thí nghiệm Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh với mục đích thu nhận cellulose nên bao gồm các thành phần sau: 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5,0 gl-1 Na2HPO4; 1,115 gl-1 acid citric; pH được điều chỉnh về 5,0 là thích hợp cho quá trình nuôi cấy. Các kết quả quả thí nghiệm này cung cấp những thông tin hữu ích cho sự phát triển khả năng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC VIẾT TẮT viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn 4 Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) 6 Hình 2.3: SEM của A. xylinum 8 Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum 11 Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 12 Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A. xylinum 13 Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và có khuấy đảo 15 Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo 16 Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của A. xylinum 35 Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH tại các ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7 36 Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum 39 Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn carbon thay đổi 42 Hình 4.5: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn nitơ thay đổi 44 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose 7 Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC 16 Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC của A. xylinum IFO 13693 17 Bảng 2.4: Aûnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của 23 Bảng 2.5: Các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cellulose vi khuẩn. 26 Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon và nguồn nitơ 33 Bảng 3.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 34 Bảng 4.1: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu 47 Bảng 4.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 47 DANH MỤC VIẾT TẮT Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo) A. xylinum: Acetobacter xylinum A. xylinus: Acetobacter xylinus ATP: adenosine triphosohate BASYC®: bacterial synthesised cellulose Cel-: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose. cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc CS: cellulose synthase CSL: corn steep liquor DAP: diamon phosphate DP: degree of polymerization FK: Fructosekinase FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate Fru-6-P: Fructose-6-phosphate GK: Glocosekinase G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase Glc-6-P: Glucose-6-phosphate Glc-1-P: Glucose-1-phosphate HS: Hestrin-Schramm HR/MAS 1H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear magnetic resonance. PGI: Phosphoglucoisomerase PGM: Phosphoglucomutase PTS: Phosphatransferase PGA: Phosphogluconic acid S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích SEM: Scanning electronic microscopy St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh) SA: Sulfate amon UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase UDPG: Uridine diphosephoglucose YPM: Yeast extract Peptone Mannitol YE: Yeast extract – cao nấm men MỞ ĐẦU Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đến với vai trò là bộ khung xương quan trọng trong cơ thể thực vật. Không những cellulose được tổng hợp bởi thực vật, mà cellulose còn được tổng hợp nên bởi vi sinh vật, với tên gọi là cellulose vi khuẩn. Một trong những loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose rất tốt đó là A. xylinum. Cellulose vi khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường… Gần đây, khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng được nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới (Otomo et al., 2000). Trong công nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, một ứng dụng của cellulose vi khuẩn mới được phát hiện gần đây là khả năng ứng dụng làm màng bao thực phẩm chống vi sinh vật rất hiệu quả (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993). Việc ứng dụng cellulose vi khuẩn vào sản xuất công nghiệp nói chung và làm màng bao thực phẩm nói riêng đòi hỏi phải có được các nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn định, và phù hợp với tính chất của các ứng dụng. Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo thì hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum sẽ cao hơn khi nuôi cấy tĩnh. Tuy nhiên, với mục đích sử dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật trong công nghệ thực phẩm, yêu cầu cellulose thu được phải ở dạng màng. Với mục đích đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh với mong muốn thu được các kết quả hữu ích cho các nghiên cứu trong tương lai. Trong nội dung thực hiện, chúng tôi tập trung khảo sát các yếu tố sau: Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum trên môi trường HS. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men thu nhận cellulose vi khuẩn nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum. Với kết quả thu được, phần nào sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo, đầy đủ hơn để có thể ứng dụng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn. Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum lần đầu tiên được báo cáo bởi Brown et al. (1986). Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic, Brown đã phát hiện và quan sát thấy một khối rắn mà theo ông lúc đó khối rắn này không nằm trong các kết quả nghiên cứu ông dự định trước. Khối rắn này khó bị phân hủy và giống với mô động vật. Hợp chất đó sau này được xác định là cellulose và vi khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum (Brown et al., 1986). Đến nửa thế kỷ XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều về cellulose vi khuẩn. Đầu tiên, Hestrin et al. (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum. Ông đã chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng đường để tổng hợp cellulose. Sau đó, Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP. Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cấu trúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Saxena (1990) đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của A. xylinum bằng việc giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose. Ông đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa. Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng… của cellulose vi khuẩn. Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1,5 nm. Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loài thực vật. Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 3 – 4 nm, và chiều dài 130 – 177 nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải siêu mịn của cellulose vi khuẩn có chiều dài từ 1 µm đến 9 µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al., 2001) Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000) Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization - DP) Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hoá khác nhau. DP của cellulose thực vật khoảng 13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 – 6000. Tuy nhiên, trong một số trường hợp DP của cellulose vi khuẩn có thể đạt 16000 đến 20000 phân tử glucose (Watanabe et al., 1998). Đường kính của bacterial cellulose chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (Bielecki et al., 2001) (hình 2.2). Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn. Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúc của cellulose vi khuẩn. Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định được kích thước và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn. Những kỹ thuật khác như phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose (Bielecki et al., 2001). Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi hai loại cấu trúc tinh thể riêng biệt, cellulose Iα và Iβ. Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993). Trong khi hầu hết tinh thể Iβ tinh khiết thu được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn này. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A. xylinum chứa nhiều tinh thể Iα hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60%. Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường (Yamamoto & Horii, 1994). Ngược lại Iβ chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành nên thành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai. Ở đó, cellulose Iα chỉ chiếm khoảng 20%. Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tố quan trọng trong việc xác định các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có rất ít các nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng biệt của cellulose được thực hiện. Tính chất của cellulose vi khuẩn (El-Saied et al., 2004; Bielecki et al., 2001) Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao. Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I. Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc. Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và hemicellulose. Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể phục hồi. Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt. Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao. Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian. Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ. Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Từ đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose. Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001) Vi sinh vật tổng hợp cellulose. Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A. xylinum được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau. Sau đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose. Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose (Jonas et al., 1998) Vi sinh vật Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học Acetobacter Lớp màng ngoại bào Dải cellulose Để giữ vi khuẩn trong môi trường hiếu khí Achromobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải Aerobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải Agrobacterium Sợi ngắn Tham gia vào mô thực vật Alcaligenes Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải Pseudomonas Các sợi không tách biệt Sự kết bông trong nước thải Rhizobium Sợi ngắn Tham gia vào hầu hết thực vật Sarcina Cellulose dị hình Không rõ Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc Sự kết bông trong nước thải Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản xuất cellulose. Đặc biệt là A. xylinum vì những đặc điểm ưu việt của nó như: năng suất tạo cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng… Phân loại A. xylinum A. xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia. Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter xylynus. A. xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau như từ nước quả (Kahlon & Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ (Faparusi et al., 1974), từ giấm (Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa (Bernado et al., 1998), từ nấm Kombucha và trà (Hermann et al., 1928). Đặc điểm hình thái của A. xylinum. A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi. Nếu A. xylinum phát triển trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chúng biến đổi thành dạng có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính một cách đáng kể. Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. Hình 2.3: SEM của A. xylinum (Forge & Preston,