Đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp Cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung thư

viện hoá học viện khoa học và công nghệ việt nam 18 Đ−ờng Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: "nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th−" GS. TSKH. Trần Văn Sung 6500 10/9/2007 Hà Nội, 4 - 2006 Bản quyền 2006 thuộc VHH - VAST Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện tr−ởng VHH - VAST trừ tr−ờng hợp sử dụng cho mục đích nghiên cứu. viện hoá học viện khoa học và công nghệ việt nam 18 Đ−ờng Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: "nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th−" GS. TSKH. Trần Văn Sung Hà Nội, 4 - 2006 Bản thảo viết xong 1/ 2006. Tài liệu này đ−ợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà n−ớc, mã số KC 10. 25 Danh sách cán bộ tham giathực hiện đề tài Họ và tên Cơ quan công tác Chủ nhiệm đề tài 1. GS.TSKH. Trần Văn Sung Viện Hoá học, Viện KH và CNVN Cán bộ tham gia nghiên cứu 1. PGS. TS. Nguyễn Hữu Định Khoa Hoá Tr−ờng ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội 2. ThS. Nguyễn Việt Thắng nt 3. ThS. Trần Văn Lộc Viện Hoá học, Viện KH và CNVN 4. ThS. Trần Văn Chiến nt 5. ThS. Trần Đức Quân nt 6. CN. Phạm Thị Ninh nt 7. TS. Trịnh Thị Thuỷ nt 8. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh nt 9. TS. Nguyễn Thanh Đạm Bệnh Viện K Hà Nội 10. ThS. Nguyễn Tuyết Mai nt 11. DS. Lê Tiến Dũng XN D−ợc phẩm TW I 12. TS. Phùng Thị Vinh Viện Kiểm nghiệm Mục lục Tr 1. Bài tóm tắt 1 2. Phần chính báo cáo 3 2.1. Phần tổng quan 3 2.1.1. Cyclophosphamide 3 2.1.1.1. Cơ chế tác dụng của cyclophosphamide 3 2.1.1.2. Tổng hợp cyclophosphamide 5 2.1.1.3. Tiêu chuẩn của cyclophosphamide đ−ợc mô tả trong các D−ợc điển 9 2.1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sử dụng cyclophosphamide tại Việt Nam 11 2.1.1.5. Các dạng sản phẩm chính của cyclophosphamide và nhu cầu về thuốc cyclophosphamide 13 2.1.2. Trích dẫn nội dung thuyết minh của Đề tài 14 2.2. Các kết quả nghiên cứu của Đề tài 19 2.2.1. Nghiên cứu quy trình tổng hợp cyclophosphamide 19 Quy trình tinh chế sản phẩm cyclophosphamide 28 2.2.2. Nghiên cứu khẳng định cấu trúc hoá học của sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp đ−ợc 29 2.2.3. Kiểm nghiệm sản phẩm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn D−ợc điển Anh, BP 2001 32 2.2.4. Nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của sản phẩm cyclophosphamide 33 2.2.5. Nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide pha tiêm 36 2.2.6. Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng thuốc cyclophosphamide pha tiêm 39 2.2.6.1. Đề c−ơng nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng 39 2.2.6.2. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng 42 2.2.7. Nghiên cứu độ bền của cyclophosphamide 48 2.2.7.1. Nghiên cứu độ bền của nguyên liệu cyclophosphamide 48 2.2.7.2. Nghiên cứu độ bền của cyclophosphamide ở trong dung dịch n−ớc 49 2.2.8. Các kết quả khác 50 3. Kết luận và kiến nghị 51 Báo cáo quyết toán tài chính Lời cảm ơn Tài liệu tham khảo 55 1 1. Bài tóm tắt 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay Việt Nam vẫn phải nhập khẩu một l−ợng lớn thuốc cyclophosphamide để điều trị ung th− và một số bệnh khác có nguyên nhân tự miễn. Theo dự tính, hàng năm số tiền để nhập khẩu cyclophosphamide riêng cho nhu cầu chữa bệnh ung th− là khoảng 26 tỉ đồng. Đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th−" có mã số KC 10.25 đặt ra các mục đích sau đây: • Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide có tính khả thi, và tính kinh tế cao. • Nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của cyclophosphamide; Kiểm nghiệm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn D−ợc điển Anh BP 2001. • Nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide pha tiêm trên dây chuyền GMP. Thuốc bào chế xong phải đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm của D−ợc điển Anh BP 2001. • Nghiên cứu đánh giá lâm sàng giai đoạn I thuốc cyclophosphamide tổng hợp đ−ợc trên bệnh nhân ung th−. 1.2. Nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu: 1.2.1. Nguyên liệu: Các hoá chất đ−ợc sử dụng có độ tinh khiết P. A. của hãng Merck, CHLB Đức. 1.2.2. Ph−ơng pháp nghiên cứu: • Các ph−ơng pháp dùng để phân tích cấu trúc của cyclophosphamide tổng hợp đ−ợc là hiện đại và phù hợp nh− phổ MS, LC/MS, IR và NMR (1H -, 13C - NMR) đ−ợc thực hiện tại Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. • Các ph−ơng pháp tổng hợp đ−ợc dựa theo patent của Đức, Liên minh Châu Âu, Mỹ có kết hợp với các tài liệu tham khảo khác, đ−ợc thực hiện tại tr−ờng ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội và Viện Hoá học, Viện KH và CNVN. 2 • Các ph−ơng pháp nghiên cứu về y d−ợc đ−ợc sử dụng là những ph−ơng pháp quy chuẩn của Bộ Y tế, đ−ợc thực hiện tại các cơ quan khoa học do Bộ Y tế chỉ định nh− Viện Kiểm nghiệm, xí nghiệp D−ợc phẩm TW I và bệnh viện K Hà Nội. 1.3. Các kết quả đã đạt đ−ợc: • Đã tiến hành nghiên cứu và đề ra đ−ợc quy trình khả thi có hiệu quả kinh tế và ứng dụng quy trình này để tổng hợp 4250 gam cyclophosphamide. • Đã đ−a ra đ−ợc bộ phổ chuẩn của cyclophosphamide tổng hợp đ−ợc gồm: IR, MS, LC/ MS, 1H -, 13C - NMR. • Sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp ra đã đ−ợc nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán cấp, đ−ợc phân tích, kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn D−ợc điển Anh BP 2001. Tất cả các tiêu chí đều đạt. • Cyclophosphamide đã đ−ợc bào chế thành thuốc bột pha tiêm trên dây chuyền GMP của xí nghiệp D−ợc phẩm TW I. Thuốc và n−ớc cất pha tiêm đạt tiêu chuẩn BP 2001. • Thuốc cyclophosphamide đã đ−ợc nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I đối với bệnh nhân ung th− tình nguyện tại bệnh viện K Hà Nội. Kết quả: Với liều 750 mg/ m2 da cơ thể các bệnh nhân đều có đáp ứng một phần. Liều 750 mg/ m2 da cơ thể là liều sử dụng an toàn. 1.4. Kết luận và kiến nghị • Đề tài đã hoàn thành tốt các mục tiêu đã đề ra và theo đúng tiến độ. • Thanh quyết toán tài chính theo đúng dự toán và quy định của nhà n−ớc. • Đề nghị Bộ Khoa học và Công nghệ xem xét phê duyệt giai đoạn tiếp theo của Đề tài để nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II và III nhằm đánh giá hiệu quả chống ung th− của thuốc và đ−a ra sản xuất, đáp ứng nhu cầu trong n−ớc, thay thế thuốc nhập khẩu. 3 2. Phần chính báo cáo 2.1. Phần tổng quan 2.1.1. Cyclophosphamide Cyclophosphamide có tên khoa học là (RS)-2-[bis(2-chloroethyl) amino] tetrahydro-2H-1,3,2-oxazo phosphorine 2-oxide hoặc N,N-bis-[2-chloroethyl] N,O- trimethylendiamidophosphat (I); công thức tổng là C7H15Cl2N2O2P. H2O, khối l−ợng phân tử là 279,1. Công thức cấu tạo là: HN P O O N H2C H2C Cl Cl . H2O I Tinh thể cyclophosphamide có màu trắng hoặc gần trắng, tan trong n−ớc, rất dễ tan trong cồn, tan vừa phải trong ete. 2.1.1.1. Cơ chế tác dụng của cyclophosphamide Cyclophosphamide đ−ợc sử dụng nhiều trong lâm sàng với một phổ tác dụng rộng và hiệu quả đối với các bệnh ung th− ở ng−ời. Ngoài lý do về tác dụng điều trị, cyclophosphamide còn có cơ chế tác dụng rất độc đáo và tính chọn lọc trong điều trị. Hiện nay cyclophosphamide là loại thuốc chống ung th− đ−ợc sử dụng nhiều nhất trong điều trị hoá chất liều cao với tổng liều l−ợng dùng là 500 -700mg/m2 da ng−ời trong 1 đến 4 ngày. Là một loại hoạt chất dễ mất nitơ, cyclophosphamide đóng vai trò ankyl hoá ADN làm cho ADN không tháo rời đ−ợc, do vậy không tạo thành ARN do đó dẫn tới việc tái sản xuất tế bào bị kìm hãm, tr−ớc hết là đối với 4 các hệ tế bào phát triển nhanh nh− các tuyến tiết, da, tuỷ x−ơng và đặc biệt là các u ác tính [1,2]. Các hợp chất có tính ankyl hoá sẽ tấn công vào quá trình trao đổi chất của a xít nucleic và kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt những tế bào bị bệnh. Tuy nhiên, chúng cũng tấn công cả tế bào lành và ở liều hiệu dụng chúng cũng có độc tính đáng kể. Theo tác giả Charlotte le Roux và cộng sự thì cơ chế alkyl hoá của cyclophosphamide đ−ợc lý giải nh− sau [6]: NH P O O N CH2 CH2 Cl Cl -H + +H + H2N P O O N CH2 CH2 CH2 CH2 Cl Cl - Cl - H2N P O O N CH2 CH2 Cl H2N P HO O N CH2 CH2 CH2 CH2 Cl Cl H2N P O O N CH2 CH2 CH2 CH2 Nu Nu H2N P O O N CH2 CH2 Nu + Nu -+ Nu - H2N P O O N CH2 CH2 Cl CH2 CH2 Nu - Cl - Cyclophosphamide (I) (A) (B) Trong cơ thể cyclophosphamide giải phóng ra chất phosphoramidat (A) một tác nhân alkyl hoá có hoạt tính sinh học. Hoạt tính sinh học của chất (A) đ−ợc giải thích qua dãy phản ứng bao gồm: đóng vòng nội phân tử; mở vòng nucleophil. Quá trình này lặp lại hai lần dẫn đến sản phẩm cuối cùng đ−ợc alkyl hoá hai lần (B). Tuy nhiên, cơ chế chính xác của quá trình alkyl hoá của chất (A) vẫn là vấn đề còn ít đ−ợc biết. Các b−ớc theo trình tự trên bao gồm các chất azinidin trung gian đã đ−ợc minh chứng bằng các thí nghiệm đơtêrô hoá. Nh−ng liệu chất (A) sẽ tham gia phản ứng alkyl hoá nguyên vẹn hay liên kết P-N sẽ bị cắt tr−ớc khi alkyl hoá thì hiện vẫn còn tranh cãi [6]. Theo nguyên lý về ''dạng vận chuyển" (transport) và '' dạng hoạt tính '' (active form) của một biệt d−ợc đối với các chất có tác dụng ankyl hoá thì một hoạt chất cần đ−ợc đ−a vào cơ thể ở ''dạng vận chuyển'' tức là ở dạng ch−a có hoạt tính. Dạng này sẽ chuyển thành ''dạng hoạt tính'' trong cơ thể và nếu có thể thì ngay tại vị trí 5 cần điều trị có nghĩa là làm tăng độ chọn lọc của thuốc. Ví dụ: Đối với các chất dễ bị loại nitơ thì hợp chất chứa nhóm oxit nitơ (N→O) là một '' dạng vận chuyển'' thực thụ. Nguyên lý này đã đ−ợc áp dụng với loại thuốc chữa ung th− tiền liệt tuyến là stilbeoestroldiphosphate. Nh− đã biết thì trong cơ thể ng−ời bệnh, tại bộ phận bị ung th− có tồn tại một enzym dạng phosphamidasa và phosphatasa có thể thuỷ phân đ−ợc liên kết phosphamide và este của axit phosphoric. Với ý t−ởng là: độ chọn lọc của thuốc sẽ tăng đáng kể, nếu ''dạng hoạt tính'' đ−ợc tạo thành trực tiếp tại vị trí cần điều trị, ng−ời ta đã tổng hợp ra chất phosphamide este II để nghiên cứu động d−ợc học của cyclophosphamide. N P NH O O R2 R1H2C H2CCl Cl II 2.1.1.2. Tổng hợp cyclophosphamide Cyclophosphamide đã đ−ợc Arnold, Bourseaux và Hirsch [3,4] tìm ra lần đầu tiên năm 1956 trong phòng nghiên cứu của nhà máy Asta với ký hiệu là B518. Việc tổng hợp ra chất này là kết quả của sự mong muốn áp dụng nguyên lý ''dạng vận chuyển" và '' dạng hoạt tính ''. Cyclophosphamide đ−ợc sử dụng trong điều trị ung th− từ năm 1958 hoặc 1970 [1]. Ngoài ra, cyclophosphamide còn đ−ợc sử dụng nh− một chất ức chế miễn dịch để điều trị các bệnh tự miễn nh− nh−ợc cơ, thấp khớp, lupút ban đỏ và đặc biệt để chống thải ghép trong các ca ghép tạng [19, 24, 25]. Arnold, Bourseaux và Brock [7] đã nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính kháng ung th− của hợp chất này. Kết quả thu đ−ợc ở chất cyclophosphamide là rất khả quan về mặt d−ợc lý và lâm sàng [4]. Cơ chế biến đổi của cyclophosphamide trong cơ thể đã đ−ợc C.L. Roux và cộng sự tiếp tục nghiên cứu [6]. 6 Một dẫn xuất khác của cyclophosphamide có nhóm thế ở mạch vòng cũng đã đ−ợc tổng hợp để nghiên cứu hoạt tính chống ung th− [7, 8, 25]. Cyclophosphamide còn đ−ợc sử dụng làm độc tố cho sơn chống hà dùng cho các tàu biển [9]. Trong những năm gần đây, tính chất d−ợc lý của cyclophosphamide vẫn còn đ−ợc tiếp tục nghiên cứu [10,11,12]. Kể từ khi tìm ra cyclophosphamide vào năm 1956 và bản quyền sáng chế (patent) đầu tiên đ−ợc chấp nhận vào năm 1957 [26] cho đến nay vẫn luôn có các bản quyền sáng chế mới về tổng hợp cyclophosphamide đ−ợc đăng ký. Bản quyền sáng chế gần đây nhất mà chúng tôi có đ−ợc là của Ulf Niemeyer và cộng sự vào cuối năm 2001 [28]. Nhìn chung các patent về tổng hợp cyclophosphamide đều dựa theo sơ đồ nh− sau: Y + N OH R4 R3 Y + POCl3 Triethylamin dung môi N P O R3 O N R1 R2 HN R1 R2 1 2 3 với R1 và R2 là chloroethyl, R3 và R4 là H. Ng−ời ta th−ờng áp dụng giải pháp kỹ thuật tiên tiến đ−ợc gọi là "phản ứng hai b−ớc trong cùng một nồi phản ứng" (two- stage one-pot reaction). Lợi thế của giải pháp kỹ thuật này là: − Hiệu suất tổng của phản ứng cao − Không phải tách sản phẩm trung gian − Chi phí cho thiết bị phản ứng thấp − Giảm thời gian sản xuất − Tiêu thụ ít nguyên liệu đầu − Không phải chạy sắc ký hoặc các b−ớc tinh chế khác − Giảm l−ợng chất thải gây độc hại tới môi tr−ờng Để thực hiện kỹ thuật này, ng−ời ta cho phosphoryl halogenid và hai chất amin là bis 2- chloroethyl amin và n- propylamin- 3- ol tác dụng với nhau trong một dung môi hữu cơ trơ với một chất kiềm hỗ trợ, tránh sự có mặt của n−ớc và alcol, 7 không cần tách các sản phẩm trung gian. Các tác nhân đ−ợc cho lần l−ợt vào bình phản ứng. Điều đặc biệt quan trọng ở đây là hạn chế tối đa ảnh h−ởng của n−ớc hoặc hơi ẩm đối với các tác nhân, đặc biệt là POCl3. Nếu có mặt n−ớc trong môi tr−ờng phản ứng thì sẽ có nhiều sản phẩm phụ và hiệu suất thu đ−ợc cyclophosphamide bị giảm nhanh chóng. Và nh− vậy sản phẩm chỉ kết tinh đ−ợc sau khi phải có thêm b−ớc tinh chế ví dụ chạy sắc ký cột. Những quy trình tổng hợp cyclophosphamide tr−ớc năm 2001 ch−a đánh giá đ−ợc hết mức độ ảnh h−ởng của n−ớc đối với phản ứng này. Ngoài n−ớc ra, thì các alcol cũng không đ−ợc có mặt trong môi tr−ờng phản ứng. Ng−ời ta đã chứng minh đ−ợc rằng: sự có mặt l−ợng vết methanol hoặc ethanol trong dung môi sẽ tạo ra nhiều phản ứng phụ và làm giảm hiệu suất. Phản ứng đ−ợc thực hiện trong một dung môi hoặc một hỗn hợp dung môi hữu cơ trơ. Có thể sử dụng các dung môi nh−: dichlorometan, 1,2- dichloroetan, chloroform, dioxan, acetonitril, tetrahydrofuran và toluen. Nồng độ của hỗn hợp phản ứng, tức là tỷ lệ giữa các chất 1, 2, 3, với thể tích dung môi có thể dao động từ 0,1 đến 6 mol/ lit. Các amin 1 và 2 đ−ợc sử dụng theo tỷ lệ mol t−ơng đ−ơng nhau. Nếu amin 2 ít hơn amin 1 5% hoặc nhiều hơn 20% cũng không có vấn đề gì. Chất kiềm hỗ trợ (để kéo axit ra khỏi hỗn hợp phản ứng) có thể là triethylamin, pyridin, hoặc natri cacbonat. Nhìn chung, tỷ lệ mol giữa các amin với chất kiềm là t−ơng đ−ơng nhau. Ví dụ: Nếu amin 2 (n- propylamin- 3- ol) tham gia phản ứng ở dạng muối thì cần hai đ−ơng l−ợng chất kiềm hỗ trợ, còn nếu nó ở dạng kiềm tự do thì chỉ cần một đ−ơng l−ợng chất kiềm hỗ trợ là đủ. Phản ứng ng−ng tụ của POCl3 với amin là phản ứng toả nhiệt. Để kiểm soát đ−ợc nhiệt độ phản ứng ta phải cho các tác nhân vào từ từ và phải làm lạnh hỗn hợp 8 phản ứng. Có nhiều cách khác nhau khi cho các tác nhân vào bình phản ứng đ−ợc mô tả trong các bản quyền sáng chế. Ví dụ: Có thể nhỏ giọt từ từ POCl3 vào một amin ở dạng kiềm tự do; hoặc chất kiềm hỗ trợ nh− triethylamin đ−ợc cho từ từ vào hỗn hợp gồm POCl3 và một amin ở dạng muối. ở giai đoạn đầu của phản ứng nhiệt độ nhìn chung đ−ợc giữ trong khoảng từ - 40 oC đến 20 oC, trong nhiều tr−ờng hợp ng−ời ta giữ phản ứng ở nhiệt độ giữa - 20 oC đến ± 10 oC. Nhiệt độ có thể tăng tới 100 oC sau khi đã phản ứng đ−ợc một nửa, hoặc tăng đến nhiệt độ sôi của dung môi nếu cần thiết bằng cách đun nóng. Trong một tr−ờng hợp khác ng−ời ta cũng có thể tiến hành nh− sau: • B−ớc một: Cho chất bis- 2- chloroethylamin vào bình, sau đó cho từ từ n- propylamin- 3- ol cùng với chất kiềm hỗ trợ (ví dụ: triethylamin) vào bình. Chất n- propylamin- 3- ol có thể đ−a vào bình phản ứng ở dạng muối và trong dung môi; chất bis- 2- chloroethylamin và kiềm hỗ trợ sẽ lần l−ợt đ−ợc đ−a từ từ vào bình, hoặc cũng có thể đ−ợc cho chảy cùng một lúc vào bình từ hai ngả sao cho chất kiềm hỗ trợ luôn luôn d− so với bis- 2- chloroethylamin. • B−ớc hai: POCl3 có thể đ−ợc cho từ từ cùng với chất kiềm hỗ trợ vào hỗn hợp phản ứng của b−ớc một, hoặc ng−ợc lại, hỗn hợp của b−ớc một đ−ợc cho từ từ vào dung dịch POCl3 và chất kiềm hỗ trợ. Nhằm giảm thiểu tối đa l−ợng n−ớc trong hỗn hợp phản ứng thì tất cả các hoá chất và thiết bị phản ứng đều phải khô tuyệt đối. Ví dụ: phải sấy nóng thiết bị phản ứng để loại hơi n−ớc, làm khan dung môi và các tác nhân tr−ớc lúc phản ứng. POCl3 phải cất lại trong điều kiện khô tr−ớc khi dùng. Hàm l−ợng n−ớc tr−ớc lúc phản ứng không đ−ợc v−ợt quá 0,5%, tốt hơn cả là trong khoảng từ 0,001% đến 0,1%. Các sản phẩm phụ sẽ đ−ợc hạn chế nếu hỗn hợp phản ứng đ−ợc xử lý với các chất phụ gia tr−ớc khi phản ứng. Các chất phụ gia này có thể là: Rây phân tử; oxit nhôm ở các dạng khác nhau, chlorua canxi (dạng khan hoặc ngậm n−ớc), P2O5 và 9 MgCl2. L−ợng chất phụ gia nhìn chung dao động trong khoảng 5 đến 150 gam/ mol chất bis- 2- chlor ethylamin. Hỗn hợp phản ứng có thể ở dạng dung dịch hoặc huyền phù và th−ờng đ−ợc khuấy từ 2 1 cho đến 3 giờ tr−ớc lúc phản ứng ng−ng tụ đ−ợc bắt đầu bằng việc cho thêm chất kiềm hỗ trợ hoặc POCl3 vào bình. Sau khi phân tử chlor thứ nhất hoặc thứ hai của POCl3 đã phản ứng, ng−ời ta có thể lọc tách muối tạo thành hoặc rửa hỗn hợp phản ứng, sau đó cho phản ứng tiếp tục bằng cách bổ sung thêm amin và chất kiềm hỗ trợ. Xử lý hỗn hợp phản ứng sau khi phản ứng kết thúc đ−ợc bắt đầu bằng việc lọc tách muối, hoặc/ và rửa với n−ớc ở các độ pH khác nhau. Cần chú ý tránh sự thuỷ phân hoặc tan vào n−ớc của sản phẩm bằng cách cho thời gian tiếp xúc với pha n−ớc ngắn và làm lạnh hỗn hợp. Có thể xử lý hỗn hợp phản ứng theo ph−ơng pháp khan, nghĩa là trung hoà hỗn hợp phản ứng bằng khí HCl cho tới pH = 4 - 6. Ngoài ra, sử dụng các axit yếu nh− axit acetic, axit oxalic cũng đem lại kết quả. 2.1.1.3. Tiêu chuẩn của cyclophosphamide đ−ợc mô tả trong các D−ợc điển • Trong D−ợc điển Việt Nam, lần xuất bản thứ 3, Nhà xuất bản Y học, năm 2002 chúng tôi không thấy có cyclophosphamide. • Trong D−ợc điển Anh BP 2001 trang 510, những tiêu chuẩn chính của cyclophosphamide đ−ợc mô tả nh− sau: − Cyclophosphamide có hàm l−ợng không d−ới 98,0% và không quá đ−ơng l−ợng của 102,0% (RS)- 2- [bis (2- chloroethyl) amino] tetrahydro- 2H- 1, 3, 2- oxaphosphorin- 2- oxit tính theo chất khan. − Là bột tinh thể màu trắng hoặc gần trắng, tan trong n−ớc, tan hoàn toàn trong cồn, tan ít trong ete. − Điểm nóng chảy 51 oC. Chênh lệch điểm nóng chảy không đ−ợc quá 2 oC. 10 − pH: Dung dịch của 0,50 gam cyclophosphamide trong 25 ml n−ớc đã khử CO2 sẽ có pH từ 4,0 đến 6,0, đo ngay sau khi pha. − Cl- (chlorid): Hoà tan 0,15 gam cyclophosphamide trong 15 ml n−ớc đã khử CO2. Hàm l−ợng ion Cl- của dung dịch vừa pha chế không đ−ợc v−ợt quá 330 ppm. − PO43- (phosphat): Hoà tan 0,10 gam cyclophosphamide trong 100 ml n−ớc đã khử CO2. Hàm l−ợng ion phosphat của dung dịch không đ−ợc v−ợt quá 100 ppm. − Kim loại nặng: Không đ−ợc quá 20 ppm tính theo chì. − N−ớc: Từ 6,0 đến 7,0% xác định với l−ợng 0,300 gam cyclophosphamide theo ph−ơng pháp bán vi l−ợng. • D−ợc điển châu Âu (EP 1997) trang 697: cũng đ−a ra các ph−ơng pháp xác định và các tiêu chuẩn của cyclophosphamide t−ơng tự nh− D−ợc điển Anh BP 2001. • D−ợc điển Mỹ (USP 25) trang 491 năm 2002: − Cyclophosphamide có hàm l−ợng không d−ới 97,0% và không nhiều quá 103,0% tính theo sản phẩm khan. − L−u ý: Rất thận trọng khi làm việc với cyclophosphamide vì đó là chất gây độc tế bào mạnh. − Đóng gói và bảo quản: Bảo quản trong thùng kín, ở nhiệt độ trong khoảng từ 2 oC đến 30 oC. − pH: nằm giữa 3,9 và 7,1 trong một dung dịch (1 trong 100), đo 30' sau khi pha. − N−ớc: Từ 5,7 đến 6,8%. 11 − Kim loại nặng: Hoà tan 1,0 gam cyclophosphamide trong 25 ml n−ớc, nếu cần thiết thì lọc lại dung dịch. Hàm l−ợng kim loại nặng không đ−ợc v−ợt quá 0,002%. • D−ợc điển Nhật Bản JP XIII trang 314: − Cyclophosphamide có hàm l−ợng không d−ới 97,0% − Tinh thể trắng hoặc bột tinh thể. − Tan rất tốt trong axit acetic băng, tan hoàn toàn trong cồn, trong anhydrit acetic và trong CHCl3, tan trong n−ớc và ete. − Điểm nóng chảy 45 oC - 53 oC. − Màu sắc dung dịch: Hoà tan 0,20 gam cyclophosphamide trong 10 ml n−ớc, dung dịch phải trong suốt và không màu. − Cl-: Kiểm tra với dung dịch của 0,40 gam cyclophosphamide ở nhiệt độ không quá 20 oC. Du