Đề tài Phân lập và nghiên cứu về chủng Streptomyces 40.16

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ADN : axit Deoxyribonucleic B.cereus : Bacillus cereus ATCC 9946 B.pumilus : Bacillus pumilus ATCC 10441 B.subtilis : Bacillus subtilis ATCC 6633 D : Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Dmhc : Dung môi hữu cơ E.Coli : Escheriachia Coli ATCC 25922 P.aeruginosa: Pseudomonas Nhiễm sắc thể aeruginosa VM 201 P.mirabilis : Proteus mirabilis BV 108 S(Spiral) : Xoắn lò xo s : độ lệch chuẩn đã hiệu chỉnh S.typhi : Salmonella typhi DT220 S.flexneri : Shigella flexneri DT 122 S.lutea : Sarcina lutea ATCC 9314 Sm(smooth) : Nhẵn S.aureus : Staphylococus aureus ATCC 1228 VSV : Vi sinh vật ISP : Chương trình Streptomyces Quốc tế MT : Môi trường dd : Dung dịch VK : Vi khuẩn ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin thì công nghệ sinh học cũng được coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế giới. Trong đó phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin và các hoạt chất ứng dụng trong y học cũng như các lĩnh vực khác phục vụ đời sống con người đang có những phát triển vượt bậc. Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình. Trong số hơn 10.000 chất kháng sinh được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra còn khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp hơn 60%. Các công trình nghiên cứu đã chứng minh Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn. Đặc biệt một số loài trong chi này có khả năng tổng hợp các chất chống ung thư và điều trị HIV-AIDS. Tuy nhiên có một vấn đề gây lo âu lớn đối với các nhà nghiên cứu, đó là sự xuất hiện của các vi sinh vật kháng kháng sinh và các chất hóa trị liệu khác. Do đó các nhà khoa học và các chuyên gia y tế đã không ngừng tìm kiếm những phương sách để chống lại hiện tượng này. Tại bộ môn Vi sinh và Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi tiến hành phân lập và nghiên cứu về chủng Streptomyces 40.16 với các mục đích sau: + Từ chủng Streptomyces đã được phân lập, chọn giống sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất bằng chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến, + Nghiên cứu môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men tối ưu, + Nghiên cứu đặc điểm, hình thái và sinh lý nhằm xác định tên khoa học của chủng Streptomyces 40.16 theo khóa phân loại ISP, + Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết, tách sản phẩm và các đặc tính của kháng sinh do xạ khuẩn Streptomyces 40.16 tổng hợp lên. PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.1. VÀI NẪT VỀ KHÁNG SINH [5][6][8][11] 1.1.1.LỊCH SỬ Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Fleming trong khi nghiên cứu tụ cầu khuẩn ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp peptri nuôi tụ CẦU TẠO THàNH VŨNG VỤ KHUẨN. HIỆN Tượng kỠ LẠ NàY đÓ được Fleming nghiên cứu và phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là Penicillium notatum một chủng tạo ra penixilin. Năm 1941 penixilin được nghiên cứu sản xuất phục vụ điều trị cho thương binh trong đại chiến thế giới thứ II và kỷ nguyên của chất kháng sinh được thừa nhận. Cho đến nay người ta đÓ PHỎT HIỆN Và MỤ TẢ KHOẢNG Hơn 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn. Thuật ngữ kháng sinh (antibiotic) được Waksman N.A gọi từ 1944 KHI ỤNG PHỎT MINH RA STREPTOMYCIN TỪ MỤI trường nuôi cấy STREPTOMYCES GRISEUS 1.1.2 Định nghĩa KHỎNG SINH Là NHỮNG HỢP CHẤT HOỎ HỌC DO VI SINH VẬT TIẾT RA CÚ TỎC DỤNG ỨC CHẾ SỰ PHỎT TRIỂN HAY TIỜU DIỆT MỘT CỎCH CHọn lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus) hay cả tế bào ung thư ở nồng độ thấp. 1.1.3.Cơ chế tác dụng của kháng sinh. Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất. Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: Tác dụng LỜN THàNH TẾ BàO, TỎC DỤNG LỜN MàNG NGUYỜN SINH CHẤT, TỎC DỤNG LỜN QUỎ TRỠNH TỔNG HỢP ADN, TỎC DỤNG LỜN QUỎ TRỠNH TỔNG HỢP PROTEIN, TỎC DỤNG LỜN SỰ TRAO đổi chất hô hấp và cuối cùng là tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian. 1.1.4.PHÕN LOẠI KHỎNG SINH PHân loại kháng sinh có thể theo nhiều cách, nhưng theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất.Bảng 1 giới thiệu một số nhóm kháng sinh quan trọng. Bảng 1: Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hoá học PHÕN LOẠI NHÚM KHỎNG SINH KHỎNG SINH CỤ THỂ 1. Các kháng sinh có chứa đường trong phân tử AMINOGLYCOSID ORRTHSOMYCIN N-GLYCOSID C-GLYCOSID GLYCOLIPID STREPTOMYCIN, NEOMYCIN EVERNINOMYCIN STREPTOTHRICIN VANCOMYCIN MOENOMYCIN 2. KHỎNG SINH CHỨA VŨNG LACTON LỚN (MACROCYCLIC LACTON) KHỎNG SINH MACROLID KHỎNG SINH POLYEN ANSAMYCIN MACROTETROLID ERYTHROMYCIN CANDICIDIN, NISTATIN RIFAMICIN TETRANACTIN 3. QUINON Và CỎC KHỎNG SINH CỰNG HỌ ANTHRACYCLIN NAPHTHOQUINON BENZOQUINON CỎC TETRACYCLIN ADRIAMYCIN ACTINORHODIN MITOMYCIN TETRACYCLIN, TERAMYCIN 4. CỎC KHỎNG SINH AMINOACID Và PEPTID DẪN XUẤT AMINOACID KHỎNG SINH BETALACTAM KHỎNG SINH PEPTID CHROMOPEPTID DEPSIPEPTID CYCLOSERIN PENICILIN, CEPHALOSPORIN BACITRAXIN, POLYMYCIN ACTINOMYCIN VALINOMYCIN 5. KHỎNG SINH DỊ VŨNG CHỨA NITơ CỎC KHỎNG SINH NUCLEOSID POLYOXIN 6.KHỎNG SINH DỊ VŨNG CHỨA OXY CỎC KHỎNG SINH POLYETHER MONENSIN 7. Các Kháng sinh nhân thơm DẪN XUẤT benzen, các ête thơm CLORAMFENICOL NOVOBIOCIN 1.1.5 KHỎI NIỆM VỀ KHỎNG KHỎNG SINH Kháng kháng sinh là hiện tượng VSV mất đi tính nhậy cảm ban đầu của nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hoá trị liệu. Kháng sinh chủ yếu mất tác dụng theo 3 cơ chế: Thay đổi vị trí đích, giảm tính thấm của thuốc hoặc do tác động của eNZYM LàM MẤT HOẠT TỚNH CỦA KHỎNG sinh. Tính kháng kháng sinh được di truyền cho các thế hệ tiếp theo. Bản chất di truyền tính kháng thuốc được khẳng định nhờ tác nhân gây đột biến và plasmid. CỎC QUỎ TRỠNH NàY lan truyền tính kháng thuốc ngoài nhiễm sắc thể xảy ra ở mức độ phân tử, tải nạP NHỜ bACTERIOPHAGE Và BIẾN NẠP VàO VI KHUẨN và tiếp hợp. 1.1.6 Sơ đồ mô tả quy trỠNH SẢN XUẤT KHỎNG SINH Hình 1. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 1.1.7 ỨNG DỤNG CỦA KHỎNG SINH Kháng sinh được sử dụng trong y học từ 1940 (penixilin) sau đó một loạt các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh ra và nhanh chóng được sử dụng để diều trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo. BẢNG 2 :MỘT VàI KHỎNG SINH QUAN TRỌNG CÚ GIỎ TRỊ KINH TẾ CAO TỜN KHỎNG SINH VI SINH VẬT SẢN XUẤT KHỎNG SINH HOẠT PHỔ PENICILIN G PENICILLIUM CHRYSOGENUM KHỎNG KHUẨN STREPTOMYCIN S. GRISEUS KHỎNG lao TETRACYCLIN S. AUREOFACIENS KHỎNG KHUẨN CHLORAMFENICOL S. VENEZUELA KHỎNG KHUẨN OXYTETRACYCLIN STR. RIMOSUS KHỎNG KHUẨN CEPHALOSPORIN C CEPHALOSPORIUM ACREMONIUM KHỎNG KHUẨN ACTINOMYCIN D S. ANTIBIOTICUS Kháng ung thư BLEOMYCIN S. VERTICILLUM Kháng ung thư DAUNORUBICIN S. PEUCETIUS Kháng ung thư MITOMYCIN C STREPTOMYCES SP Kháng ung thư KANAMYCIN S. KANAMYCETICUS KHỎNG KHUẨN NISTATIN S. NOURSEI KHỎNG NẤM FUMAGILLIN ASPERGILLUS FUMIGATUS KHỎNG PROTOZOA GRISEOFULVIN PENICILLIUM GRISEOFULVUM KHỎNG NẤM NISIN STREPTOCOCCUS SP. BẢO QUẢN THỰC PHẨM NATAMYCIN STREPTOCOCCUS SP. BẢO QUẢN THỰC PHẨM RIFAMYCIN NOCARDIA MEDITERANEI. KHỎNG LAO POLYMYXIN B BACILLUS POLYMYXA KHỎNG KHUẨN GENTAMYCIN MICROMONOSPORA PURPUREA. KHỎNG KHUẨN KHỎNG SINH CŨN được sử dụng trong thú y để điều trị các bệnh nhiễm trùng của động vật như viêm phổi ở trâu bŨ, TỤ HUYẾT TRỰNG Ở LỢN, V.V…TRONG CHăn nuôi kháng sinh được sử dụng làm chất bổ sung vào thức ăn nhằm kích thích tăng trọng. Rất nhiều chẩt kháng sinh được ứng dụng với mục đích này (các kháng sinh nhóm tetracyclin, monenzin,…). KHỎNG SINH CŨN được ứng dụng trong nông nghiệp trước hết để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụi ở lúa (validamyin, blasticidin S, kasugamyxin, v.v…), bệnh thối cổ rễ ở các cây có củ,v.v…Kháng sinh cŨN KỚCH THỚCH NẨY MẦM CỦA HẠT. THường ngâm hạt trong dung dịch kháng sinh trước khi gieo vừa để kích thích nẩy mầm, vừa tiêu diệt mầm bệnh trong đất. KHỎNG SINH CŨN được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp.Nếu dùng kháng sinh thực phẩm đóng hộp sẽ bảo quản được lâu hơn, khử trùng ở nhiệt độ thấp hơn nên chất lượng thực phẩm giữ được tốt hơn(ví dụ NIZIN). 1.2.ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN [1][9][11][14][15] 1.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn * Đặc điểm chung của xạ khuẩn: (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) có cấu tạo sợi như nấm (nấm tia) nhưng lại có khích thước và cấu tạo tế bào gần giống vi khuẩn, chúng phân bố rộng rÓI TRONG TỰ NHIỜN: TRONG đất, nước và trong các chất hữu cơ. - Những đặc điểm đặc trưng của xạ khuẩn : + Kích thước của xạ khuẩn nhỏ bé tương tự như vi kích thước vi khuẩn + NHÕN CỦA XẠ KHUẨN là nhân không điển hình + MàNG TẾ BàO XẠ KHUẨN KHỤNG CHỨA XENLULO Và KITIN + SỰ PHÕN CHIA TẾ BàO CỦA XẠ KHUẨN THEO KIỂU CỦA VI KHUẨN + XẠ KHUẨN KHỤNG CÚ GIỚI TỚNH - TUY VẬY XẠ KHUẨN LẠI CÚ HỠNH thái, cẤu TẠO SỢI, PHỎT TRIỂN BẰNG PHÕN NHỎNH THàNH NHỮNG SỢI NHỎ, DàI GỌI Là KHUẨN TI (HIPHA), MỖI KHUẨN TI DO MỘT TẾ BàO HỠNH THàNH, TẬP HỢP CỦA CỎC KHUẨN TI NàY GỌI Là HỆ KHUẨN TI. * Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn : - Đường kính khuẩn ti xạ khuẩn khoảng 0,2 - 3,0 M - MàU SẮC CỦA KHUẨN TI khí sinh rất phong phú: màu trắng, vàng, đỏ, lục, tía, nâu, đen… - THàNH TẾ BàO DàY TỪ 7,5-10,0 NM, KHỤNG CÚ XENLULO Và KITIN - PHÕN CHIA TẾ BàO THEO KIỂU PHÕN BàO VỤ TỚNH. * PHÕN LOẠI: Actinomycetales Actinoplanaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae NOCARDIA STREPTOMYCES MICROMONOSPORA Hình 2: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 1.2.2.Đặc điểm hỠNH THỎI Và SINH LỚ CỦA XẠ KHUẨN chi Streptomyces * Đặc điểm hỠNH THỎI: - KHUẨN LẠC TẠO THàNH TỪNG CỤM, BỀ MẶT KHỤ RỎP, XỰ XỠ, DẠNG PHẤN , KHỤNG TRONG SUỐT, CÚ CỎC NẾP TOẢ RA THEO HỠNH PHÚNG XẠ. - Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi CẤY. - Khẩn ty cơ chất tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố hoà tan trong nước, có sắc tố chỉ hoà tan trong dung môi hữu cơ. + Khuẩn ty cơ chất mọc trong môi trường nuôi cấy, không phân cách trong suốt quá trỠNH PHỎT TRIỂN - KHUẨN TY khí SInh: khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh và có đường kính từ 1,0-1,4 M. + Chuỗi bào tử: được hỠNH THàNH TỪ KHUẨN TY KÝ SINH, CÚ NHIỀU HỠNH DẠNG KHỎC NHAU: thẳng, MÚC CÕU, XOẮN, UỐN CONG. + Bào tử trần: được hỠNH THàNH DO SỰ PHÕN CẮT CỦA SỢI BàO TỬ, Là Cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bào tử trần có thể hỠNH CẦU, HỠNH ELIPSOID, HỠNH QUE, HỠNH TRỤ. CỎC BàO TỬ TẬP HỢP VỚI NHAU THàNH CHUỖI 3- 50 BàO TỬ HOẶC NHIỀU Hơn. Bề mặt của bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (SM), XỰ XỠ (WA), CÚ GAI (SP), HOẶC CÚ TÚC (HA). * Đặc điểm sinh lý: - STREPTOMYCES là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hoá cao. Để phát triển chúng phân giải các hydrat cacbon làm nguồn thức ăn cung cấp vật chất và nguồn năng lượng đồng thời thuỷ phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột. Chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit. - STREPTOMYCES Là VI SINH VẬT CÚ THàNH TẾ BàO KIỂU CW1 CÚ CHỨA L-DAP (DIAMINOPIMELAT) Và GLYCIN. - STREPTOMYCES Là LOàI XẠ KHUẨN HỤ hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của chúng thường là 25-300C, một vài loài có thể mọc ở nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu thường từ 6,8-7,5. - Khả năng tạo sắc tố của STREPTOMYCES: SẮC TỐ TẠO THàNH TỪ STREPTOMYCES được chia thành bốn loại: sắc tố hoà tan, sắc tố khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố khuẩn lạc. 1.2.3.PHÕN LOẠI STREPTOMYCES CHI STREPTOMYCES bao gồm một số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp ra các kháng sinh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau .Việc phân loại và xác định TỜN XẠ KHUẨN Là RẤT QUAN TRỌNG. CÚ RẤT NHIỀU KHOỎ PHÕN LOẠI STREPTOMYCES KHỎC NHAU: PHÕN LOẠI THEO KRASILLKOW, WAKSMAN, GAUZE, SHIRLING & GOTTLIEB, NGOàI RA CŨN CÚ THỂ PHÕN LOẠI THEO KIỂU GEN. HỘI NGHỊ "VI SINH VẬT THẾ GIỚI LẦN X" (được tổ chức tại Mexico vào năm 1970) chọn khoá phân loại của E.B.Shirling & Gottlieb làm khoá phân loại chính để phân loại chi STREPTOMYCES và đặt tên quốc tế là International STREPTOMYCES PROJECT (ISP) Khoá phân loại dựa vào các đặc điểm: - Đặc điểm hỠNH THỎI HỌC CỦA XẠ KHUẨN : + Màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí SINH, + HỠNH DẠNG CHUỖI BàO TỬ, + BỀ MẶT BàO TỬ. - Đặc điểm sinh lí học: + Khả năng tạo sắc tố hoà tan, + Khả năng tạo sắc tố melanoid, + Khả năng sử dụng các nguồn đường của xạ khuẩn. 1.2.4 Khả năng sINH TỔNG HỢP KHỎNG SINH CỦA STREPTOMYCES MỘT SỐ KHỎ LỚN KHỎNG SINH DO các LOàI STREPTOMYCES SINH TỔNG HỢp, rất đa dạng, có trong hầu hết các nhóm phân loại kháng sinh. 1.3 CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT [1][5][8][10][11][15] 1.3.1.Mục đích Trong thực tế không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng VSV có khả năng tạo chất kháng sinh mong muốn với hàm lượng đủ để thỏa mãn yêu cầu của sản xuất công nghiệp. Các VSV phân lập từ cơ chất tự nhiên thường có hoạt tính thấp đồng thời trong quá trình nuôi cấy, hoạt tính của chúng thường giảm dần. Vì vậy việc cải tạo giống VSV bằng nhiều biện pháp khác nhau nhằm thu được những chủng có hoạt tính cao, ổn định là một trong những điều kiện quan trọng và cần thiết ở quy mô phòng thí nghiệm trước khi đưa ra công nghiệp hóa. 1.3.2.Phân lập giống xạ khuẩn Người ta thường lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ruộng, bùn, nước cống… để phân lập xạ khuẩn sinh kháng sinh. Từ các mẫu trên đem phân lập khiết những xạ khuẩn sinh kháng sinh bằng các phương pháp đặc trưng và trên các môi trường chọn lọc. Các phương pháp phân lập giống xạ khuẩn: phương pháp cấy dịch chiết trên bề mặt thạch, phương pháp cấy đất trực tiếp trên bề mặt thạch đã chứa sẵn VSV kiểm định, phương pháp làm giàu đất, phương pháp thêm kháng sinh vào môi trường phân lập, phân lập VSV sinh kháng sinh chống ung thư. 1.3.3. Các phương pháp cải tạo giống A. Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn lọc tự nhiên hay còn gọi là sàng lọc ngẫu nhiên là tuyển chọn lấy những dạng chủng có những đặc tính sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất, xuất hiện ngẫu nhiên do sự tác động của các điều kiện ngoại cảnh. B.Đột biến nhân tạo Đột biến nhân tạo là quá trình xử lý tế bào bằng các tác nhân gây đột biến (lý, hóa, sinh học…). Các tác nhân này khi sử dụng với liều lượng thích hợp sẽ giết chết hầu hết các VSV, những cá thể sống xót sẽ có sự biến đổi ở NST, gây ra đột biến gen liên quan đến cấu trúc gen làm thay đổi 1 hay nhiều nucleotit trong trình tự mã hóa gọi là đột biến điểm. Đây là loại đột biến có ý nghĩa trong công nghiệp kháng sinh, làm thay đổi tính trạng cũng có thể dẫn đến làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính), hay tăng cường. *Ánh sáng UV khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV có kích thước nhỏ (0,3-3m) thì nó có thể xuyên thấu tới nhân. Vì vậy được dùng phố biến trong đột biến cải tạo giống. *Cơ chế: Tia UV tác dụng lên ADN và mạnh nhất ở vùng 260nm gây dime hóa thymin (do làm đứt các liên kết hyđro trong mạch kép ADN của tế bào VSV). Mà thymin gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C5 và C6. Hậu quả là sao chép bị sai lầm vì ADN polymeraza dễ lắp 1 nucleotit không chính xác vào vị trí trên. Đồng thời trên sợi AND cũng xuất hiện một dimepyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4. Ở đây C6 của 5’ (thymin hoặc cytozin) được liên kết với C4 của 3’ (thường là Cytozin). Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên bởi ánh sáng UV. *Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết vầ tần số phát sinh đột biến: -Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi 3 yếu tố là thời gian chiếu, khoảng cách chiếu, độ pha loãng bào tử. Thực nghiệm cho thấy những đột biến dương thường xuất hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót bào tử từ 0,1-1%, còn đột biến âm thường xuất hiện ở liều lượng chiếu cao hơn. -Ánh sáng thường: Sau khi đột biến bằng tia tử ngoại, nếu đem chiếu ánh sáng thường (bước sóng =320-480nm) trở lại thì sẽ có khoảng 50-80% tế bào được phục hồi do tác dụng của men photolyase. Hiện tượng này gọi là quang phục hoạt. Ngoài ra, các yếu tố nhiệt độ, pH, môi trường nuôi cấy, trạng thái sinh lí của vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng UV. 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn. Các giống vi sinh vật rất rễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất. Vì vậy việc bảo quản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng không chỉ ở các trung tâm giữ giống quốc gia mà ngay cả ở phòng thí nghiệm cũng rất cần thiết. Nhiệm vụ của công tác giữ giống vi sinh vật là thực hiện các thao tác kĩ thuật cần thiết để giữ cho giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền ổn định và không bị tạp nhiễm bởi các VSV khác. Có rất nhiều phương pháp giữ giống VSV khác nhau. Tùy vào loại VSV để chúng ta chọn phương pháp giữ giống cho phù hợp. Đối với giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng để trong tủ lạnh 20C. 1.4. DINH DƯỠNG VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY [5] Trong quá trình sống, tế bào VSV luôn luôn phải trao đổi chất với môi trường xung quanh. Tế bào VSV tuy rất nhỏ nhưng vì hấp thu các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cường độ trao đổi chất của chúng là rất lớn. Các chất dinh dưỡng qua màng vào tế bào và được chuyển hóa thành những chất riêng biệt cho việc xây dựng tế bào. Nhờ quá trình đồng hóa và dị hóa các tế bào mới có thể phát triển, sinh trưởng, đồng thời tạo ra các sản phẩm trao đổi chất. Những VSV dùng trong công nghiệp vi sinh kháng sinh đều là các VSV dị dưỡng. Để phát triển VSV cần một lượng đầy đủ các nguyên tố C, H, O, N, P… và một trong những nguyên tố vi lượng là Mn, Mo, Zn, Cu… Môi trường dinh dưỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng và tạo thành sản phẩm của VSV. Thông thường các môi trường nuôi cấy sử dụng nước máy thì không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng vì các chất này đã có đủ trong các cơ chất dinh dưỡng ở dạng tạp chất. Trong quá trình lên men người ta có thể thêm một số nguyên tố vi lượng đặc biệt hoặc tiền chất là chất đặc hiệu cho sản phẩm tạo thành như tiền chất axít phenoxyacetic trong quá trình lên men sản xuất penicillin V. Ở đây cũng cần lưu ý, một môi trường nuôi cấy thuận lợi cho sự phát triển của một VSV không nhất thiết sẽ là môi trường đảm bảo cho sản xuất sản phẩm trao đổi chất tốt nhất. Môi trường lên men tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn và chi phí thấp với chủng VSV cho trước. Thành phần môi trường và chế độ tối ưu hóa được xác định theo hai cách: tối ưu hóa kinh điển và sử dụng phương pháp toán học quy hoạch thực nghiệm. 1.5. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH [2][5][8] 1.5.1. Bản chất của quá trình lên men Lên men thực chất là phản ứng ôxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc tác của các enzim do VSV tự tổng hợp với mục đích cung cấp năng lượng và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men. 1.5.2. Giống vi sinh vật Trong lên men công nghiệp, kỹ thuật chỉ là công cụ tác động và điều khiển lên quá trình sinh học còn giống vẫn là khâu quan trọng, quyết định giá trị kinh tế của quá trình sản xuất. Giống VSV dùng trong quá trình lên men phải là các tế bào sinh dưỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hóa vật chất cao nhất. Do đó trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống. Giống VSV được tạo ra qua các cấp nhân giống kế tiếp nhau, trên máy lắc tròn hoặc bình nón, rồi đến bình giống. 1.5.3. Các phương pháp lên men * Phương pháp lên men bề mặt: Lên men bề mặt là quá trình nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường rắn, đặc hay lỏng. VSV hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng ôxi không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường dinh dưỡng. Vì vậy yêu cầu của công nghệ lên men bề mặt là bề mặt môi trường phải đủ rộng, lớp môi trường không quá sâu (5-10cm), đồng thời phải g