Đề tài Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria

Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 1 MỤC LỤC Lời nói đầu 1. Giới thiệu 1 1.1 Probiotic 1 1.1.1 Lịch sử, khái niệm và các loài Bifidobacteria 1 1.1.2 Nguyên tắc phân loại 2 1.2 Bifidobacteria 2 1.2.1 Khái niệm và các chủng của loài Bifidobacteria 2 1.2.2 Các chủng có giá trị thương mại 8 1.2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi khuẩn 10 2. Quá trình công nghệ thu nhận probiotic bifidobacteria 12 2.1 Môi trường nuôi cấy và các điều kiện 12 2.1.1 Môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn 12 2.1.2 Môi trường nuôi cấy thay thế 13 2.2 Lên men 16 2.2.1 Các hình thức lên men 16 2.2.2 Canh trường tế bào lên men tự do truyền thống 20 2.2.3 Ảnh hưởng các tính chất công nghệ đến đặc tính của tế bào 22 2.3 Vi lọc 24 2.3.1 Mô hình sợi 24 2.3.2 Hệ thống thiết bị phản ứng sinh học membrane 25 2.4 Rửa và bổ sung phụ gia 25 2.5 Hình thành sản phẩm 26 2.5.1 Môi trường dạng lỏng 26 2.5.2 Môi trường dạng lạnh đông 26 2.5.3 Môi trường dạng sấy khô 27 3. Tiêu chuẩn chất lượng 29 4. Thành tựu công nghệ 30 4.1 Đánh giá chủng Bifidobacteria spp trong việc sản xuất các probiotic tiềm năng trên môi trường đồ uống malt – base 30 4.2 Đánh giá tính an toàn của probiotic bifidobacteria bằng cách phân tích hoạt tính thủy phân mucin và khả năng chuyển vị 32 5. Phụ lục 37 5.1 Tác dụng của probiotic đối với sức khỏe con người 37 5.2 Bảo quản sản phấm 40 5.3 Những sản phẩm công nghệ bổ sung probiotic bifidobacteria 42 6. Tài liệu tham khảo 47 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 2 DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Những tế bào Bifidobacterium trên biểu mô ruột 3 Hình 2. Mối quan hệ giữa các chủng của loài bifidobacteria 6 Hình 3. Bifidobacterium adolescentis 7 Hình 4. Bifidobacterium bifidum 8 Hình 5. Bifidobacterium breve 9 Hình 6. Bifidobacterium longum 10 Hình 7. Quá trình lên men liên tục hai giai đoạn để sản xuất probiotic thích ứng với stress. 19 Hình 8. Cấu tạo mô hình sợi 1 24 Hình 9. Cấu tạo mô hình sợi 2 24 Hình 10. Thiết bị phản ứng sinh học membrane 25 Hình 11. Sản phẩm Activia dạng chai và Activia yogurt 42 Hình 12. Sản phẩm Align 43 Hình 13. Sản phẩm Bifidus yogurt 43 Hình 14. Sản phẩm Good start natural cultures 44 Hình 15. Sản phẩm Nutrish 44 Hình 16. Pobiotic ice-cream, Nước giải khát probiotic whey, Bio-kefir 45 Hình 17. Sản phẩm Teddy 45 Hình 18. Sản phẩm Yo-plus yogurt 46 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 3 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người 2 Bảng 2. Các chủng của loài bifidobacteria 4 Bảng 3. Các nhà cung cấp vi sinh vật sản xuất probiotic 7 Bảng 4. Môi trường nuôi cấy chuẩn 12 Bảng 5. Ảnh hưởng các yếu tố sinh trưởng lên sự phát triển của Bifidobacterium trong môi trường whey bơ 15 Bảng 6. Dữ liệu sản xuất Bifidobacteria trong những hệ thống lên men và điều kiện môi trường khác nhau 20 Bảng 7. Một số phụ gia chống đông có thể sử dụng được 26 Bảng 8. Những tiêu chuẩn mong muốn và then chốt trong việc lựa chọn những probiotic trong ứng dụng thương mại 29 Bảng 9. Các thông số động lực cho sự phát triển của Bifidobacterium spp 31 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 4 1. Giới thiệu 1.1 Probiotic 1.1.1 Lịch sử, khái niệm và các tính chất 1.1.1.1 Lịch sử • Probiotic được dùng để chỉ những vi sinh vật có lợi cho người và động vật do Dr.Eli Metchinikoff, một nhà khoa học người Nga đạt giải Nobel năm 1908, đưa ra khi ông nghiên cứu về vai trò của những vi khuẩn có lợi trong đường ruột. • Cũng vào thời điểm đó, Henry Tissier, một bác sĩ khoa nhi người Pháp, đã quan sát trong phân những đứa trẻ bị tiêu chảy có một số lượng ít vi khuẩn lạ, hình Y, là những vi khuẩn “bifid” ngược lại chiếm số lượng lớn trong những đứa trẻ khỏe mạnh. Và ông cho rằng những con vi khuẩn này có khả năng chống lại bệnh tiêu chảy giúp khôi phục hệ thống vi sinh vật đường ruột khỏe mạnh. 1.1.1.2 Khái niệm • Có thể định nghĩa probiotic như sau: “Probiotic là một hay hỗn hợp nhiều vi khuẩn mà khi cung cấp cho người hay động vật thì mang lại những hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng cách tăng cường các đặc tính của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa”. • Đặc điểm cơ bản probiotic o Probiotic là những vi sinh vật sống. o Khi các probiotic được cung cấp với liều lượng thích hợp thì mang lại những hiệu quả mong muốn. 1.1.1.3 Vai trò
Thủy phân lactose, tăng sự hấp thu lactose.
Tăng “thành bảo vệ” miễn dịch, một số có khả năng kích thích cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, cùng với việc sinh ra S-IgA ở màng nhầy.
Kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus, nấm có hại.
Có khả năng chịu được acid dạ dày, muối mật, có khả năng xâm chiếm đường ruột, bám vào màng nhầy ruột do đó hạn chế sự có mặt của vi sinh vật có hại.
Sinh ra các chất chống lại vi sinh vật gây bệnh (như Samonella, E.coli, Clostridium…)
Phòng và chữa một số bệnh đường tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ dày…
Giảm triệu chứng dị ứng, triệu chứng không dung nạp được lactose.
Tổng hợp một số vitamin, giảm cholesterol Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 5
Ngăn chặn ung thư đường ruột, ung thư ruột kết. 1.1.2 Nguyên tắc phân loại Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterum, ngoài ra Enterococcus và Streptococus cũng được sử dụng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột. Một số chủng tiêu biểu bao gồm Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem là probiotic. Bảng 1: Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người Chủng Lactobacillus Chủng Bifidobacterium Các chủng vi khuẩn lactic khác Các loài vi sinh vật khác L. acidophilus L. amylovocus L. casei L. crispatus L. gallinarum L. gasseri L. johnsonii L. paracaseii L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus L. salivarius B. adolescentis B. alimalis B. bifidum B. breve B. infantis B. lactis B. longum Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Lactococus lactis Leuconostoc mesenteroides Pediococus acidilactici Sporolactobacillus inulinus Streptococus thermophilus Bacillus cereus Escherichia coli Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces boulardii (Taylor & Francis, 2004) 1.2 Bifidobacteria 1.2.1 Khái niệm và các loài bifidobacteria 1.2.1.1 Khái niệm Chủng bifidobacterium theo truyền thống được xếp chung với LAB, là hệ thống phát sinh liên quan đến LAB thật. Nó thuộc ngành Atinobacteria, lớp Actinobacteria, bô bifidobacteriales, họ bifidobacteriaceae. Họ hàng của nó là Aeriscardovia, Gardnerella, Parascardovia, và Scardovia. Những loài của chủng đó sử dụng con đường trao đổi chất để phân hủy hexoses nên được gọi là “bifid shunt”, đó là sự khác biệt với Lactobacillus và các chủng liên quan. Enzym được xem như là đặc tính phân loại của nhóm là fructose-6-phosphoketolase(EC 4.1.2.2). Chủng hiện tại bao gồm khoảng 30 loài. Thành phần GC trong hệ gen khác nhau từ 42-67%mol, thuộc nhóm vi khuẩn gram dương cao GC. Nhóm vi khuẩn có những đặc tính probiotic thuộc các loại Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 6 Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve và Bifidobacterium longum. Hình 1: Những tế bào bifidobacterium trên biểu mô ruột (Trích từ Centre of Excellence for Knowledge Transfer, Research and Education in Food and Health for Central and Eastern Europe) • Bifidobacteria có chủ yếu ở trong ruột kết của người và động vật, nhất là ở trẻ mới sinh được nuôi bằng sữa mẹ. Số lượng của chúng trong ruột kết khá ổn dịnh cho đến khi về già thì số lượng giảm đi. • Một số tính chất chung của các loài thuộc Bifidobacteria: o Gram dương, kị khí, không chuyển động, không sinh bào tử, catalase âm o Có nhiều hình dạng: que cong ngắn, hình gậy, hình chữ Y. o Sinh acid lactic, không tạo CO2 trừ quá trình phân giải gluconate. • Nhiệt độ và pH tối ưu o Nhiệt độ tối ưu cho Bifidobacteria phá triển: Topt: 37 – 41oC và không thể phát triển dưới 20oC và trên 46oC. Sự phát triển tại nhiệt độ là Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 7 45oC dường như có thể phân biệt rõ ràng giữa chủng Bifidobacteria từ người và từ vật. Chỉ trừ trường hợp của B. thermacidophilum có thể phát triển tại điều kiện nhiệt độ 49.5oC (ưa ấm). o Bifidobacteria là vi khuẩn đường ruột chịu được acid. pHopt vào khảng 6.5 -7.0, không phát triển tại khoảng pH được ghi nhận là dưới 4.5 (trừ B. thermacidophilum có thể sống ở pH xuống khoảng 4) và trên 8.5. Bifidobacteria là vi sinh vật kỵ khí tuy nhiên độ nhạy với oxy có thể khác nhau tùy loài. • Cho đến nay đã có 30 loài thuộc Bifidobacteria được phân lập. Bifidobacteria được sử dụng như các probiotic gồm Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium thermophilus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum… 1.2.1.2 Các chủng của loài bifidobacteria Bảng 2: Các chủng của loài bifidobacteria Loài Bifidobacteria Nguồn B. adolescentis Phân của trẻ em và người lớn, ruột thừa B. angulatum Phân người lớn B. animalis Phân của thỏ, chuột, gà, bê B. asteroids Mật ong B. bifidum Phân của trẻ em và người lớn B. boum Chất cặn trong dạ cỏ của động vật nhai lại B. breve Phân trẻ em B. catenulatum Phân trẻ em và người lớn B. choerinum B. coryneforme Mật ong B. cuniculi Phân thỏ B. denticolens Răng sâu của con người B. dentium Răng sâu của người, phân người lớn B. gallicum Phân người trưởng thành B. gallinarium Phân gà B. infantis Phân trẻ em B. inopinatum Răng sâu của người B. lactis Sữa đã lên men B. longum Phân người lớn và trẻ em B. magnum Phân thỏ B. merycicum Dạ cỏ động vật nhai lại B. minimum Nước cống B. pseudocatenulatum Phân trẻ em B. pseudolongum ssp. Phân của chuột, gà, bê, dạ cỏ của động vật nhai lại Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 8 B. psychraerophilum Manh tràng của heo B. pullorum Phân gà B. ruminantium Dạ cỏ của động vật nhai lại B. saeculare Phân thỏ B. scardovii Phân người trưởng thành B. subtile Nước cống B. suis B. thermacidophilum Kỵ khí trong hệ tiêu hóa B. thermophilum Phân gà, bê, dạ cỏ của động vật nhai lại B. thermacidophilum ssp. porcinum Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 9 Hình 2: Mối quan hệ giữa các chủng của loài Bifidobacteria Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 10 1.2.1.3 Các nhà cung cấp vi sinh vật sản xuất probiotic Bảng 3: Các nhà cung cấp vi sinh vật sản xuất probiotic Nhà sản xuất Chủng probiotic Cargill (Minneapolis, Mỹ) Bifidobacterium animalis subsp. Lactis Bf-6 Bifidobacterium bifidum BF2 Bifidobacterium breve BR2 Bifidobacterium infantis BT Bifidobacterium lactis BL2 Cell Biotech Europe (Copenhagen, Đan Mạch) Bifidobacterium longum BG3 Chr Hansen (Hφrsholm, Đan Mạch) Bifidobacterium lactis BB12 Bifidobacterium animalis subsp. Lactis B-420 Danisco (Copenhagen, Đan Mạch) Bifidobacterium lactis HN019 DSM (Heerlen, Hà Lan) Bifidobacterium LAFTI B94 Bifidobacterium breve M16V Bifidobacterium infantis M-63 Bifidobacterium longum BB536 Morinaga (Tokyo, Nhật Bản) Bifidobacterium pseudolongum M-602 1.2.2 Các loài có giá trị thương mại 1.2.2.1 Bifidobacterium adolescentis Thuộc nhóm được tách ra từ phân của người lớn, trẻ em và ruột thừa. Hệ thống phân nhóm liên quan đến Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium merycicum, Bifidobacterium pseudocatenulatum and Bifidobacterium ruminantium và rất khó khăn để phân biệt kiểu hình của nó với Bifidobacterium dentium. Nó được đặc trưng bởi thành phần gen GC khoảng 58% trong khi amino acid thành tế bào chứa amino acid Lys (Orn) – D-Asp. Chủng được tách từ ruột người là ATCC 15703T (= DSM 20083T = LMG 10502T). Hình 3: Bifidobacterium adolescentis Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 11 1.2.2.2 Bifidobacterium animalis Mô tả chủng này dựa vào sự phân lập từ phân của các loài động vật khác nhau. Ở một số tài liệu thì nó được mô tả như Bifidobacterium lactis, được tách ra từ các sản phẩm bơ sữa. Quá trình tách subsp. Lactis thì chịu áp lực oxy nhiều hơn subsp. Animalis và điều đó có lợi trong ứng dụng của probiotic, nó cho phép chúng có thể tồn tại trong điều kiện không kị khí của sản phẩm thương mại, và điều khác biệt nữa giữa 2 chủng là sự sinh trưởng của chúng trong sữa. Bifidobacterium animalis thuộc nhóm Bifidobacterium pseudolongum, bao gồm Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium gallicum và Bifidobacterium pseudolongum. Thành phần DNA G+C của loài này chiếm 61%. Một loại Bifidobacterium animalis subsp. animalis là ATCC 25527T (= LMG 10508T = DSM 20104T), tách từ phân chuột, một loại B. Animalis subsp. lactis là LMG 18314T (=DSM 10140T), được tách từ sữa đã lên men. 1.2.2.3 Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium Bifidum cực kì kị khí. Nó là một trong số những loài được nhận biết dựa vào dấu hiệu quá trình lên men và nó khác hoàn toàn so với những loài khác trong nhóm bifidobacteria. Trong điều kiện đặc biệt những tế bào có hình dáng riêng giống “amphora” và cũng thường xuất hiện như một nhánh que. Loài này được phân lập từ phân của cả người lớn và trẻ em, phân động vật, nhưng nó được sử dụng trong những sản phẩm của quá trình lên men bơ sữa cho mục đích probiotic. Một loại của chủng này là ATCC 29521T (= DSM20239T = LMG 10645T), tách ra từ phân của em bé nuôi bằng sữa mẹ. • B. bifidum là vi khuẩn chiếm đa số ở ruột già người. • Bảo vệ cơ thể chống sự phá hoại của rotavirus gây tiêu chảy, và điều chỉnh lại hệ vi sinh vật đường ruột • Tăng miễn dịch cơ thể, đặc biệt liên quan đến sức khoẻ đường ruột, ngăn chặn ung thư, không gây hiệu ứng phụ. • Chống các viêm loét, bảo vệ cơ thể chống lại các vi sinh vật gây bệnh như Samonella, hạn chế hoạt động của E.coli • Giảm đáng kể lượng nội độc tố trong ruột tạo thành từ các thành Hình 4: Bifidobacterium bifidum Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 12 1.2.2.4 Bifidobacterium breve Loài này được đặc trưng bởi kích thước ngắn, có hay không có sự rẽ nhánh, với lysine và glycine như là amino acid trong peptidoglycan và có thành phần gen GC chiếm 58%. Loài này được tách ra từ ruột người, nước cống và trong hệ thống loài thì liên quan đến Bifidobacterium longum. Loại chủng này là ATCC 15700T (=DSM20213T = LMG 11042T). Hình 5: Bifidobacterium breve 1.2.2.5 Bifidobacterium longum Khác với Bifidobacterium breve, tế bào của loài này có hình dạng dài và mỏng, ít phân nhánh. Nó kị khí và được xem là một trong những loài phổ biến của bifidobacteria, được tách ra từ phân của người lớn và cả phân của động vật. Loài gần nó nhất trong hệ thống phân loài là Bifidobacterium breve. Thành phần gen GC của nó chiếm 60% và sự hiện diện của nhiều plasmid, tính chất duy nhất trong số những bifidobacteria tách ra từ phân. Một loại của subsp. longum là ATCC 15707T (=DSM 20219T = LMG 13197T), tách ra từ phân của người lớn. • Giảm lượng nitrate sinh ra trong quá trình tiêu hóa thức ăn. • Ngăn chăn hoạt động của các vero cytotoxin sinh ra bởi một số chủng thuộc E.coli, gây bệnh viêm, xuất huyết đường ruột do có khả năng sinh ra các hợp chất kết hợp với các vero cytotoxin. • Ngoài ra, Bifidobacterium longum còn hiệu quả trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm Samonella typhimurium. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 13 Hình 6: Bifidobacterium longum 1.2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi khuẩn 1.2.3.1 Về mặt sản xuất − Có thể phát triển nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men đơn giản và rẻ. − Có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện kị khí hoặc vi hiếu khí. − Có thể sống sót qua quá trình ly tâm, lọc, đông lạnh hoặc sấy lạnh mà không mất số lượng đáng kể. − Có khả năng hoạt hóa nhanh sau khi được sử dụng. − Có thể sống sót dưới những điều kiện biến đổi khác nhau trong chế biến thực phẩm bao gồm cả các quá trình nhiệt độ cao trên 450C cũng như chịu đựng được nồng độ ethanol và sodium cloride cao. 1.2.3.2 Khả năng sống sót trong ruột − Khả năng chịu được các dịch tiêu hoá: acid trong dạ dày và muối mật. − Khả năng cư trú trong ruột: khả năng bám chặt và làm giảm số lượng mầm. bệnh bám trên bề mặt thành ruột. 1.2.3.3 Đặc tính riêng − Có khả năng sử dụng prebiotic (oligosaccharides, inulin, tinh bột) để phát triển. − Khả năng tổng hợp hay sử dụng vitamine (Nhóm B, folate, vitamin K). − Có khả năng ngăn chặn các mầm bệnh: Samonella typhimurium, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Escherichia coli, Candida albicans… − Có hoạt tính β– galactosidase. − Có khả năng tổng hợp acid, hydrogen peroxide, các bacteriocin. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 14 − Khả năng sinh D-lactic acid. − Có thể sử dụng kết hợp với các vi sinh vật khác. 1.2.3.4 Tính an toàn − Không gây độc, không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe. - Kiểm tra bằng liều gây chết trên động vật. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 15 2. Qui trình công nghệ thu nhận probiotic bifidobacteria 2.1 Môi trường nuôi cấy và các điều kiện 2.1.1 Môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn Bảng 4: Môi trường nuôi cấy chuẩn Môi trường Tên Chất thêm vào MRS De Man Rogosa Sharpe TPY Tryptone Phytone Yeast BL Glucose Blood-Liver CLB Columbia LCL Liver Cysteine Lactose (Blaurock) RCM Reinforced Clostridia Medium mMRS Modified MRS L-cysteine HCL, 0.05% mMRS + máu Modified MRS L-cysteine HCL, 0.05% máu cừu 10 ml X-a-Gal MRS X-a-Gal mBL Modified BL without blood L-cysteine HCL, 0.05% mRCM Modified RCM Lactose 1.0% máu người 50ml RCPB RCM Prussian Blue 0.03% 2.1.1.1 Môi trường MRS (g/l) + Peptone 10.0g + Baptist Meat extract 8.0g + Baptist yeast powder 4.0g + Glucose 20.0g + K2HPO4 2.0g + Diammonium hydrogen citrate 2.0g + Sodium 5.0g + MgSO4 0.2g + Manganese sulfate 0.04g + Agar 14.0g + PH 5.7 +/- 0.2 2.1.1.2 Môi trường TPY (g/l) + Hydrolyzed casein 10.0g + Soya Peptone 5.0g + Baptist yeast powder 2.0g + Glucose 5.0g Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 16 + L-cysteine 0.5g + K2HPO4 2.0g + Magnesium chloride 0.5g + Zinc sulfate 0.25g + Calcium chloride 0.15g + Ferric chloride 1.0ug + Agar 20.0g + Soil temperature 80 1.0g + PH 6.5 +/- 0.1 2.1.1.3 Môi trường BL (g/l) + Baptist liver powder 4.0g + Peptone 5.0g + Baptist Meat extract 3.0g + Baptist yeast powder 2.0g + Enzymatic digest of casein 5.0g + Soluble starch 0.5g + L-cysteine 0.5g + Glucose 10.0g + KH2PO4 1.0g + K2HPO4 1.0g + Soya Peptone 3.0g + MgSO4 0.2g + Ferrous sulfate 0.01g + NaCl 0.01g + Agar 20.0g + Manganese sulfate 0.0067g + Tween 80 1.0g + PH 7.2 +/- 0.1 2.1.2 Môi trường nuôi cấy thay thế Môi trường tổng hợp và bán tổng hợp có chứa lactose( 3-7%), proteins, amino acid, vitamin B, casein trong hệ tiêu hóa bò đang được phát triển để nuôi cấy bifidobacteria. Ngoài ra còn có thể nuôi cấy bifidobacteria trên môi trường sữa có bổ sung chất dinh dưỡng. Môi trường nuôi cấy thương mại như MRS, TPY thì rất mắc tiền vì vậy môi trường nuôi cấy dựa trên thành phần chủ yếu nước whey được đề ra. Vi sinh vật: Bifidobacteria bifidum Chuẩn bị chủng : B.bifidum được phát triển trong môi trường nước thịt MMRS có bổ sung casein-HCl 0.05% ở 370C tr