Đề tài Quy trình nhân giống dâu tây in vitro

LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài 2. Đặt vấn đề Cây dâu tây còn có tên khoa học là Fragaria thuộc chi Fragaria, trên thế giới có khoảng 20 loài. Tại nước ta cây dâu tây chủ yếu được trồng tại Đà Lạt (Lâm Đồng). Cây dâu tây được coi như là cây trồng tiềm năng tại Đà Lạt. Dâu tây được trồng khá lâu ở Đà Lạt. Tuy nhiên những năm gần đây diện tích dâu tây giảm dần do thoái hóa giống, đồng thời thiếu nguồn cung cấp giống dâu tây ổn định và sạch bệnh. Do vậy cần phát triển nhân giống cây dâu tây theo công nghệ là vấn đề bức thiết đặt ra. Việc áp dụng nghành công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào công nghệ nhân giống dâu tây, đã và đang được các nhà khoa học áp dụng. Mang lại những kết quả khả quan cho việc cải thiện diện tích dâu tây ở Đà Lạt. 3.Tình hình nghiên cứu Cây dâu tây là cây có nhiều nguồn lợi kinh tế, chính vì nguồn lợi kinh tế đó mà việc đầu tư cho những nghiên cứu tại các Cơ quan nghiên cứu nhiều tiêu biểu trong đó có Phân viện sinh học Tây nguyên, Trung tâm nghiên cứu Khoai tây rau và hoa, trung tâm nghiên cứu và ứng dụng nông nghiệp Lâm Đồng… Dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống và cung cấp cây giống dâu tây sạch bệnh, số lượng lớn cho các vùng trồng dâu tây trong tỉnh Lâm Đồng” do Viện Sinh học Tây Nguyên chủ trì đã đặt ra mục tiêu: Hoàn thiện công nghệ nhân giống và trồng dâu tây, tạo ra cây giống dâu sạch bệnh có chất lượng tốt đồng thời, xây dựng một số mô hình trong dân. Do PGS.TS Dương Tấn Nhựt - Phó Viện trưởng Viện Sinh học Tây Nguyên chủ nhiệm. Qua dự án này dựa trên trên công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật làm nền tảng thu hút nhiều quan tâm của các nhà khoa học tại đây. Sau nhiều năm thực hiện dự án việc tạo giống dâu bằng mô tế bào đã thành công. Không chỉ vậy, phân viện sinh học Tây Nguyên ngày càng phát triển qui mô nhân giống cây dâu tây. Cũng như Phân viện sinh học Tây Nguyên việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào quá trình công nghệ sản xuất giống. Nhằm cung ứng giống dâu tây sạch cho nông dân trong vùng. Ngoài ra dưới sự chỉ đạo của TS Phạm Xuân Tùng (Nguyên giám đốc Trung Tâm Nghiên cứu Khoai tây Rau và Hoa Đà Lạt) những năm 2007-2008 dự án “Giữ quĩ gene giống dâu sạch bệnh tại Đà Lạt” tại Trung Tâm nghiên cứu Khoai Tây, rau và Hoa (Trực thuộc Viện khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam). Tại trung tâm, giống dâu tây được xem là nguồn giống quan trọng, trung tâm đã phát triển nhiều giống dâu nhưng chủ yếu là các giống như: Mỹ đá, Langbiang, New Zealand.. Biện pháp nhân giống in vitro được thực hiện cho thấy thu lại hiệu quả không nhỏ những năm sau đó.Hiện tại Trung Tâm là địa chỉ đáng tin cậy trong việc cung cấp giống dâu tây in vitro. Cây dâu tây được xây dựng nhiều dự án tại trung tâm ứng dụng kỹ thuật nông nghiệp lâm đồng như các dự án “Xác lập qui trình nhân giống dâu tây mới ở Đà Lạt”, hay dự án “Nâng cao tỷ lệ sống cây dâu tây giai đoạn sau ống nghiệm” dưới sự chỉ đạo của giám đốc Trần Thị Kim Duyên, và sự tham gia của các kỹ sư tại trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng kỹ thuật nông nghiệp Lâm Đồng nhằm mục đích phát triển nhân giống dâu tây nhằm chuyển giao công nghệ cho nông dân tại Đà Lạt và Lạc Dương thuộc tỉnh Lâm Đồng. 4. Mục đích nghiên cứu Tìm hiểu qui trình nhân giống cây dâu tây in vitro . Khảo sát điều kiện sinh trưởng của cây dâu tây trong qui trình trong phòng thí nghiệm. 5. Nội dung nghiên cứu: Tiến hành khảo sát các bước nhân giống in vitro cây dâu tây từ bước nhập mẫu cho đến lúc ra vườn ươm xuất giống. 6. Phương pháp nghiên cứu: Theo dõi tỷ lệ sống xót của cây ở nồng độ khử trùng và thời gian khác nhau. Khảo sát sự phát triển của chồi ở nồng độ BA khác nhau. Khảo sát khả năng ra rễ cây khi bổ sung NAA ở nồng độ khác nhau. 7. Kết quả đạt được: Theo dõi nồng độ và thời gian thích hợp để phát triển cây dâu tây. Chọn môi trường bổ sung chấ thích hợp quá trình nhân chồi và phát triển của cây. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro 1.2.1.Giới thiệu Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho pháp tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến sinh học, sinh hóa học di truyền và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loại cây quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con người. 1.1.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công. Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống của việc nuôi cấy tế bào cà chua. Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hoàn chỉnh. Sau đó có rất nhiều nhà khoa học đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được nuôi cấy. Năm 1951, Skoog và Miler đã phát hiện ra hợp chất để điều khiển sự nhân chồi. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay. Năm 1960- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy điỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên thương mại hóa.Từ đó dến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều và được ứng dụng thương mại hóa. Hình 1.1. Cây lan mô trong phòng thí nghiệm 1.1.3. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp thực tiễn sản xuất và đời sống. 1.1.3.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản. Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, ta có thể so sánh đặc tính cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra những tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho pháp tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh chồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa là mô sẹo, từu mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ưu thế mà các nhà khoa học sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việc của mình. Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các qui luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể nghiên cứu mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ. Như vậy rõ ràng nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó tìm ra những cơ chế miễn dịch của thực vật giúp cho việc phòng bệnh cây tốt hơn và đỡ tốn kém hơn. 1.1.3.2. Về mặt thực tiễn sản xuất Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để đảm bảo và nhân nhanh các cây quí, có kinh tế giá trị cao. Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trong công tac cây giống cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cây mô, trong thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối lớn có họat chất: sinh khối tạo ra vẫn giữ nguyên thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid. Glycosid dùng trong y học, chất dinh dưỡng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh truởng của các vi sinh vật trong nông nghiệp. Hình 1.2. Qui trình nhân giống cây chuối trong ống nghiệm 1.2. Các thiết bị cơ bản trong phòng nuôi cấy in vitro 1.2.1. Phòng rửa và cất nước - Máy cất nước một lần. - Máy cất nước 2 lần. 1.2.2. Phòng hấp sấy - Nồi hấp Autoclave. - Tủ sấy: 60oC-200oC. 1.2.3. Phòng chuẩn bị môi trường - Cân phân tích (chính xác đến 0.0001). - Cân kỹ thuật (chính xác 0.001). - Máy đo pH. - Tủ lạnh. - Lò vi sóng. 1.2.4. Phòng thí nghiệm và nuôi cấy - Tủ cấy vô trùng. - Quạt thông gió. - Đèn tử ngọai treo trên tường. Hình 1.3. Phòng nuôi cấy mô (Phòng này để phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền). Kính hiển vi hai mắt (độ phóng đại 1000 lần). Kính lúp hai mắt (độ phóng đại 75 lần). Hệ thống đèn chiếu. Máy phổ kế… 1.2.5. Phòng chứa mẫu Kệ chất mẫu. Bóng đèn, ổn áp… Hình 1.4. Phòng chất cây 1.3. Nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh 1.3.1. Nuôi cấy nốt đơn thân 1.3.1.1. Phương pháp Sử dụng chồi ngọn hoặc chồi mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ được kích thích tăng trưởng thành cây nguyên vẹn. Chồi được thu từ chồi ngọn hoặc ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trường dinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng. Chồi mới tăng trưởng mang nhiều lá và tiếp tụ nhân nhanh để đạt đến số lượng cần thiết. Chồi sẽ được cảm ứng cho ra rễ để thành cây hoàn chỉnh và được chuyển ra đất trồng. 1.3.1.2 . Những điểm chú ý trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân - Phương pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp như hoa hồng (như cúc đồng tiền) và khi mẫu cấy có khả năng nhiễm cao. Đối với những cây này phải sử dụng phương pháp nhân chồi đỉnh. - Để giảm khả năng nhiễm, nên chọn những ngọn còn khép kín. Nền cây bị nhiễm từ bên trong thì tốt nhất là sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. - Tốc độ nhân giống phụ thuộc vào sồ lượng chồi có sẵn. Chồi tăng trưởng tạo ra càng nhiều lá thì số lượng chồi bên càng nhiều dẫn đến sự tăng tốc độ nhân giống. - Các chồi được trẻ hóa, đặc biệt là các chồi thân gỗ, tăng trưởng nhiều hơn so với chồi trưởng thành. - Sự tạo rễ trên các chồi trưởng thành khó thực hiện vì vậy cần trẻ hóa chồi để cảm ứng sự ra rễ. Phương pháp này đã thực hiện thành công trên một số đối tượng: cây măng tây, khoai tây,lê, cà chua,dưa chuột... 1.3.2. Nuôi cấy chồi bên Về nguyên tắc phương pháp tương tự nuôi cấy nốt đơn thân. Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi thông thường là cytokinin là yếu tố phát triển. Trong phương pháp nhân nhanh chồi bên, chồi được cô lập trong môi trường dinh dưỡng và các chồi bên của lá nách phát triển dưới ảnh hưởng của cytokynin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn đề cho các chồi bên phát triển. Các chồi bên này tiếp tục chuyển sang môi trường mới chứa cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục tạo ra... Sau đó các chồi được đưa ra môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi rễ đã dược hoàn chỉnh. Thực tế, cả hai phương pháp này thường được áp dụng chung: Đầu tiên chồi tăng trưởng bình thường, sau đó bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy kích thích chồi bên. Phương pháp nhân giống chồi bên được tiến hành đầu tiên trên cẩm chướng, dâu tây, cúc đồng tiền... Hiện nay, phương pháp này được áp dụng nhiều loài thực vật phổ biến là cây ăn trái. 1.3.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nhiễm virus là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đặc biệt, virus chuyển sang cac thế hệ kế tiếp trong quá trình thực vật sinh sản hữu tính và ngay cả vô tính in vitro. Trong đỉnh sinh trưởng của mô thực vật có dự cạnh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo tế bào con. Ở vùng mô phân sinh trong suốt quá trình phân chia tế bào, khả năng sinh tổng hợp nucletic acid được tận dụng để phân chia tế bào sẽ gây bất lợi cho quá trình tăng sinh của virus. Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch virus làm nguồn mẫu cho nuôi cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này. Nếu đỉnh sinh trưởng cô lập đang ở trạng thái hoạt động thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn. Nếu như đỉnh sinh trưởng được cô lập có kích thước lớn thì cơ hội thu được cây sạch bệnh thấp. Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng những cây trồng cây trồng quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily... Một số cây thân gỗ như anh đào, mâm xôi, nho... cũng được nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy sạch bệnh. 1.3.4. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật tạo cây đơn bội kép (DH, double haploid). Phương pháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao đặc biệt là nếu được kết hợp với các biện pháp tạo biến dị di truyền khác như lai hữu tính gây đột biến nhân tạo. Đây là kỹ thuật không phức tạp nhưng có hiệu quả trong chọn lọc cây trồng, nhất là với cây trồng có hạt như lúa. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã được phát triển thành phương pháp chọn tạo giống đơn bội. Sử dụng phương pháp này các nhà chọn tạo giống lúa đã rút ngắn thời gian và cũng giảm bớt chi phí về lao động, không cần thiết tạo ra các dòng thuần. 1.4. Một số hệ thống nuôi cấy mới 1.4.1. Nuôi cấy lỏng sục khí- Bioreactor Hiện nay, hầu hết các hệ thống vi nhân giống được thực hiện trên những hệ thống bình nuôi cấy khác nhau nhưng đều có điểm chung mẫu cấy phát triển trên môi trường đặc. Nuôi cấy trên môi trường đặc chủ yếu trên những thiết bị nuôi cấy có kích thước nhỏ nên môi trường không đủ đáp ứng cho sự phát triển lâu dài của mẫu cấy. Hơn nữa nuôi cấy trên môi trường đông đặc, môi trường bị lãng phí do cây không hấp thu hết các chất dinh dưỡng ở đáy bình nuôi cấy. Các hệ thống nuôi cấy trong môi trường lỏng trên máy lắc ban đầu dựa trên mô hình cấy vi sinh và tế bào động vật nhằm phục vụ cho nghiên cứu nuôi cấy và thu nhận các hợp chất thứ cấp. Mẫu cấy trong môi trường lỏng có khả năng tăng trưởng nhanh hơn môi trường đông đặc. Có thể do mẫu cấy tiếp xúc hoàn toàn trong môi trường. Ngày nay, hệ thống bioreactor với cấu trúc của các bình lên men và các cánh khuấy bằng kim loại được thay bằng silicon sục khí, có thể điều khiển được tốc độ dòng khí để hạn chế những tương tác bất lợi của mẫu cấy, hạn chế sự tổn thương của mẫu. Vì thế, hệ thống bioreactor được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như: nuôi cấy chồi và phôi thực vật, chồi hoa thu hải đường, nhân củ khoai tây in vitro, hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc cấy thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học như nuôi cấy rễ nhân sâm. 1.4.2. Nuôi cấy quang tự dưỡng Nuôi cấy quang tự dưỡng Đã được giáo sư Kozai và các cộng sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90. Từ đó đến nay có rất nhiều nghiên cứu thành công trong ứng dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng vào sản xuất cây trồng. Phương pháp vi nhân quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp truyền thống. Nó thúc đẩy sự tăng trưởng cây in vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và đồng thời làm hạ giá thành cây in vitro. Phương pháp này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy (ion, sự khuyếch tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con trong bình cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, độ ẩm, nhiệt độ và tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy,...) thay vì chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của môi trường cấy như độ đường, muối khoáng, vitamin hay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật mà các nhà nuôi cấy quan tâm. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Nói đúng hơn sử dụng chất hữu cơ bao gồm cả chất điều hòa sinh trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào môi trường. Điều này dựa trên cơ sở tự nhiên tất cả các cây xanh chứa diệp lục tố đều có khả năng quang hợp để tồn tại và phát triển. Tất cả các cơ quan dùng trong môi trường nuôi cấy mô có diệp lục tố đều có khả năng quang hợp. Chúng đều có thể nhận CO2 không khí làm nguồn trong carbon trong quá trình quang hợp mà không cần đường và vitamin trong quá trình nuôi cấy. Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn carbon cho chính quá trình tăng trưởng và phát triển của cây. Sự loại bỏ đường trong môi trường nuôi cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn trong quá trình nuôi cấy giảm. Điều này đem lại ý nghĩa rất lớn trong sản xuất vì chi phí công lao động sẽ giảm đáng kể song song với việc giảm nguyên vật liệu. Theo khái niệm về nuôi cấy mô quang tự dưỡng thì hộp chứa cây cấy được xem như là nhà kính thu nhỏ. Với phương pháp này sự tăng trưởng phát triển của cây in vitro phần lớn chịu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý trong môi trường nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ CO2 sự trao đổi khí. Nồng độ CO2 và ánh sáng là hai nhân tố chính quan trọng nhất trong nuôi cấy quang tự dưỡng cùng với cơ quan có diệp lục tố, sự gia tăng khác biệt giữa nồng độ CO2 bên trong và bên ngoài hộp cấy và sự gia tăng của ánh sáng làm cho hiệu quả quang hợp tăng lên. 1.5. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Hệ số nhân giống cao: Từ một mẫu vật sạch bệnh ban đầu, bằng con đường nuôi cấy mô có thể nhân nhanh và cung cấp một lượng giống lớn trong thời gian ngắn trên một quy mô mặt bằng hạn chế. Đối với khoai tây chẳng hạn, từ một cây sạch bệnh trong ống nghiệm (in vitro) trong vòng một năm có thể nhân lên hàng ngàn cây trong phòng thí nghiệm. Chất lượng giống tốt: Mẫu cây ban đầu (có thể sạch hoặc không sạch bệnh) được nhập in vitro và nhân nhanh. Khi đạt một số lượng nhất định cần thiết, mẫu được kiểm tra bệnh virus bằng các phương pháp huyết thanh (ELISA, ngưng kết antigene – antibody), hoặc cây chỉ thị. Mẫu không nhiễm tiếp tục được nhân nhanh cho mục đích sử dụng (sản xuất giống hoặc phục vụ các nghiên cứu lai tạo giống). Mẫu đồng nhất về mặt di truyền, dòng cây mong muốn, có khả năng ra hoa và tạo quả sớm. Khả năng chủ động trong nhân giống: Trong điều kiện phòng thí nghiệm có kiểm soát, kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép nhân giống quanh năm. Vì vậy, hoàn toàn có thể chủ động trong việc lập kế hoạch sản xuất, cung cấp giống 1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trinh nuôi cấy mô tế bào thực vật Các nhân tố trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có 3 nhân tố chính: Đảm bảo điều kiện vô trùng Chọn đúng môi trường và chuẩn bị đúng cách Chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp với trước và sau khi cấy. 1.6.1. Yếu tố vô trùng 1.6.1.1. Ý nghĩa của việc nuôi cấy vô trùng tế bào nuôi cấy mô tế bào thực vật - Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật chứa đường, các chất khoáng, vitamin… là điều kiện thuận lợi để các vi sinh vật phát triển mạnh mẽ. - Do tế bào nấm và vi khuẩn hơn nhiều so với tế bào thực vật nên chỉ cần nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn, thì chúng nhanh chóng phủ đầy trên toàn bề mặt môi trường, bề mặt mô tế bào thực vật. Các vi sinh vật lấn áp tế bào nuôi cấy mô thực vật sẽ làm cho mô thực vật phát triển chậm lại và chết dần. 1.6.1.2. Nguồn tạp nhiễm Có 3 nguồn tạp nhiễm chính: Dụng cụ, nút đậy, môi trườn nuôi cấy không được vô trùng tuyệt đối. Trên bề mặt mô có chứa các sợi nấm, bào tử nấm và bào tử vi khuẩn. Trong quá trình thao tác làm nhiễm các bào tử nấm hoạc vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy. 1.6.2. Kỹ thuật vô trùng 1.6.2.1. Vô trùng thuỷ tinh, nút đậy, môi trường Dụng cụ thuỷ tinh: thông thường dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các phòng thí nghiệm bằng dung dịch sulfocromate một lần trước khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ cần rửa sạch để