Đề tài Sản xuất GOS (hay Galacto-Oligosaccharides) từ enzyme β-galactosidase của các vi sinh vật khác nhau

1 MỤC LỤC: PHẦN 1: NGUYÊN LIỆU ĐƯỜNG LACTOSE: .............................................. 4 1.1. Công thức cấu tạo và tính chất vật lý : .................................................... 4 1.2. Sản phẩm lactose trên thị trường : .......................................................... 5 PHẦN 2: ENZYM β-GALACTOSIDASE ......................................................... 5 2.1. Giới thiệu chung: ..................................................................................... 5 2.2. Các phương pháp cố định enzyme: ......................................................... 8 2.3. Cố định enzym trên cotton ..................................................................... 11 PHẦN 3: QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ .............................................................. 14 3.1. Sơ đồ khối: ............................................................................................ 14 3.3 So sánh 2 qui trình: ............................................................................... 31 PHẦN 4: SẢN PHẨM .................................................................................... 32 4.1. Giới thiệu chung: .................................................................................. 32 4.2. Chỉ tiêu chất lượng: ............................................................................... 34 4.3. Chức năng và ứng dụng: ....................................................................... 35 4.4. Hướng phát triển ứng dụng của GOS trong công nghệ thực phẩm: ....... 36 PHẦN 5: THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ: .......................................................... 36 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................ 41 2 Danh mục hình: Hình 1.1: Công thức cấu tạo phân tử α-lactose và β-lactose ............................... 4 Hình 1.2: Lactose trên thị trường ........................................................................ 5 Hình 2.1: Cơ chế hoạt động của enzyme _galactosidase ................................... 6 Hình 2.2: Quá trình cố định enzym lên PEI ...................................................... 13 Hình 3.1: Sơ đồ khối Sản xuất GOS dùng enzyme β-galactosidase tự do có nguồn gốc từ A. oryzae ..................................................................................... 14 Hình 3.2: Sơ đồ khối sản xuất GOS dùng enzyme β-galactosidase cố định bằng bông vải có nguồn gốc từ A. oryzae ................................................................. 15 Hình 3.3: Thiết bị phản ứng .............................................................................. 17 Hình 3.4: Ảnh hưởng của hàm lượng lactose ban đầu đến sự tạo thành GOS. .. 18 Hình 3.5: Biến đổi của các chất theo thời gian. ................................................ 19 Hình 3.7: Thiết bị xử lý bằng than hoạt tính. .................................................... 20 Hình 3.8: Mô hình thiết bị membrane tubular module. ..................................... 22 Hình 3.9: Nguyên tắc hoạt động của SMB ....................................................... 24 Hình 3.10: Mô tả sự khác nhau của các vùng ................................................... 25 Hình 3.11: hệ thống cô đặc chân không nhiều nồi ............................................ 26 Hình 3.12: Nguyên lý thiết bị sấy phun ............................................................ 28 Hình 3.13: Thiết bị phản ứng ............................................................................ 29 Hình 4.1: Công thức cấu tạo Galactooligosaccharide ....................................... 33 Hình 5.1: Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến năng suất tạo GOS ................. 38 3 4 PHẦN 1: NGUYÊN LIỆU ĐƯỜNG LACTOSE: 1.1. Công thức cấu tạo và tính chất vật lý : Lactose là một disaccharide do một phân tử glucose và một phân tử galactose liên kết với nhau tạo thành . Đường lactose tồn tại dưới hai dạng : - Dạng α-lactose monohydrat C12H22O11.H2O - Dạng β-lactose anhydrous C12H22O11 Hình 1.1: Công thức cấu tạo phân tử α-lactose và β-lactose Tỷ lệ hàm lượng giữa α-lactose và β-lactose phụ thuộc vào giá trị pH và nhiệt độ . Bảng 1.1: Một số tính chất vật lý của lactose Đại lượng Đơn vị đo α-lactose monohydrat β-lactose anhydrous Phân tử lượng Nhiệt độ nóng chảy Độ hòa tan ở 150C Góc quay cực Da 0C g đường / 100gnước độ 360 202 7 +89,4 342 242 50 +35 Lactose là đường khử . Độ ngọt của lactose thấp hơn nhiều so với các disaccharide và monosaccharide thường gặp . Nếu như độ ngọt của saccharose được đánh giá với chỉ số là 100 , của mantose là 32 , glucose là 74 , của frutose là 173 thì độ ngọt của lactose chỉ đạt 16. Lactose có thể bị thủy phân tạo ra 2 monosaccharide là glucose và galactose bởi enzyme β- galactosidase . 5 1.2. Sản phẩm lactose trên thị trường : Hình 1.2: Lactose trên thị trường - Tính chất : sản phẩm ở dạng tinh thể màu trắng hoặc bột tinh thể , có vị ngọt , tỉ trọng 1,525 , dễ dàng tan trong nước , không tan trong cồn , cloroform và ether . - Thành phần :  Lactose ≥ 98%  Protein ≤ 0,1%  Tro 0,1-0,3%  Hàm lượng ẩm 4-5%  Salmonella không có  Coliform không có  Tổng hàm lượng vi sinh vật nhỏ hơn 2000 cfu/g PHẦN 2: ENZYM β-GALACTOSIDASE 2.1. Giới thiệu chung: - _galactosidase là một lactase. Các "enzyme lactase" từ lâu đã được sử dụng để thủy phân lactose trong sản xuất của một số sản phẩm từ sữa, trong y học dùng làm thuốc hỗ trợ đường tiêu hóa. Enzyme β-galactosidase có thể được thu nhận từ động vật, thực vật cũng như vi sinh vật. Enzym được sản xuất từ vi sinh vật có năng suất và hoạt tính cao hơn so với enzym từ động vật và thực vật. Đặc tính của enzym phụ thuộc vào nguồn thu nhận, enzym từ các nguồn khác nhau có pH, nhiệt độ tối thích khác nhau. Không phải tất cả các nguồn enzym đều an toàn khi sử dụng trong công nghệ thực phẩm, các lactases từ nấm men (Kluveromyces lactis), nấm mốc (Aspergillus oryzae) và vi khuẩn (Circulans Bacillus), ba lactases này đã được thương mại và được công nhận là an toàn cho sản xuất thực phẩm. - β- galactosidase là enzym xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β-1.4-D galactoside trong phân tử đường lactose tạo thành glucose và galactose. Sau đó người ta phát hiện ra 6 enzym cũng có thể tạo liên kết glycosidic giữa hai saccharide bằng cách loại bỏ nước trong phản ứng transgalactosylation. Vì thế enzym có thể tổng hợp các oligosaccharide . Ví dụ : GOS từ lactose. β- galactosidase thực hiện bằng cách cộng thêm galactose vào lactose. - Cơ chế phản ứng: E + S ES P + E - Trung tâm hoạt động của enzyme _galactosidase: Hình 2.1: Cơ chế hoạt động của enzyme _galactosidase 7 Bảng 2.1: Các nguồn β-galactosidase Vi khuẩn Escheridia coli Bacillus megaterium Thermus aquaticus Streptococcus lactis Streptococcus thermopillus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus helveticus Bacillus sp. Bacillus circulans Bacillus stearothermopillus Lactobacillus sporogenes Nấm mốc Neurospora crassa Aspergillus foetidus Aspergillus niger Aspergillus flavus Aspergillus oryzae Aspergillus phoenicis Mucor pucillus Mucor miehei Scopuloriopsis Alternari palmi Curvularia inaegualis Fusarium moniliforme Alternaria alternara Nấm men Kluyveromyces (Saccharomyces) lactis Kluyveromyces (Saccharomyces) fragilis Candida pseudotropicalis Wingea roberstii Thực vật Đào Mơ Hạnh nhân Hoa hồng dại Giống cỏ linh lăng Cà phê quả Động vật Ruột Não và các mô da 8 Bảng 2.2: Các điều kiện để sản xuất GOS từ β-galactosidase của các vi sinh vật khác nhau 2.2. Các phương pháp cố định enzyme: - Cố định enzym là giới hạn về mặt vật lý, định vị enzym trong một vùng không gian nhất định để duy trì hoạt động xúc tác của enzym mà có thể sử dụng nhiều lần và liên tục. - Cố định β-galactosidases có thể ảnh hưởng đáng kể đến tính chất của enzyme. Ví dụ : pH và nhiệt độ ổn định, các thông số động học … Nếu áp dụng đúng kỹ thuật cố định có thể cải thiện tính chất của β-galactosidases như tính ổn định ở pH và nhiệt độ họat động của enzyme. Enzyme cố định trong các hạt mang thường dẫn đến giảm 20-30% hoạt tính. - β-galactosidases có thể được cố định bởi một số phương pháp, như phương pháp liên kết cộng hóa trị, phương pháp cố định enzyme trong khuôn gel, phương pháp hấp phụ vật lý hoặc sự kết hợp của những phương pháp này. Vì mỗi phương pháp có những ưu điểm và 9 hạn chế riêng của nó, nên việc lựa chọn phương pháp thích hợp phụ thuộc vào các enzym, chất mang, phản ứng, điều kiện phản ứng …  Phương pháp liên kết cộng hóa trị: Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến. Trong phương pháp sử dụng 2 hoặc các hợp chất đa chức, có vai trò như là chất tạo liên kết cho các xúc tác sinh học. Các chất mang thường là polypeptide, polysaccharide, dẫn xuất của xenllulose… Các enzyme có thể liên kết cộng hóa trị với nhau tạo thành một đại phân tử không hào tan. Trong trường hợp cố định β-galactosidase, phương pháp này thường được sử dụng kết hợp với phương pháp cố định khác, chủ yếu là hấp phụ và cố định trong khuôn gel.  Phương pháp cố định enzyme trong khuôn gel: Phương pháp được dựa trên sự cố định của enzyme trong mạng gel của chất mang polyme hoặc membrane. Hạn chế chính là enzyme cố định có thể thất thoát trong quá trình sử dụng nhiều lần do kích thước phân tử nhỏ so với các mạng lưới chất mang. Nhược điểm tiếp theo là sự khuếch tán bị hạn chế. Phương pháp được phân thành năm loại chính: mạng gel, microcapsule, liposome, membrane, và đảo ngược micelle. Trong đó, phương pháp mạng gel là được sử dụng rộng rãi nhất. Những enzym này được cố định trong chất mang của các polyme tổng hợp hoặc tự nhiên. Alginate là một polysaccharide tự nhiên, được sử dụng kết hợp với gelatin để cố định β – galactosidase của A. oryzae. Tuy nhiên, các enzyme chỉ có 25% hoạt tính ban đầu.  Phương pháp hấp phụ vật lý: Đây là phương pháp đơn giản nhất và lâu đời nhất để cố định enzym lên chất mang. Phương pháp dựa trên tương tác giữa các enzym và chất mang, như liên kết hydro, tương tác kỵ nước, lực van der Waal, và sự kết hợp các liên kết. Ưu điểm: rẻ tiền, ít ảnh hưởng tới các enzym là protein hơn là hóa chất. 10 Bảng 2.3: Phương pháp cố định ß- galactosidase 11 2.3. Cố định enzym trên cotton 2.3.1. Nguyên liệu  Enzym β –galactosidase của A. oryzae: β-galactosidase từ Aspergillus oryzae có trọng lượng phân tử khoảng 90000 Dalton, hoạt tính enzym 106.742 LU /g (Tổng công ty phát triển enzyme New York, LU là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 mmol glucose mỗi phút từ lactose ở pH 4,5 ở 37oC).  Cotton: Vải bông là một vật liệu rẻ tiền và phổ biến rộng rãi trong vật liệu sợi. Nó có nhiều ưu điểm như diện tích bề mặt lớn, sức bền cơ học cao và độ xốp cao. Các miếng vải bông làm từ 100% cotton có cellulose từ 85-90%.  Polyethyleneimine (PEI): Polyethyleneimine [PEI; (C2H5N) n] là một polyamine tổng hợp với nhiều các nhóm amin. PEI đã được chấp nhận như là một chất mang trong công nghiệp cố định chất xúc tác sinh học. PEI có thể cố định cho các enzym hòa tan. Là một polymer tích điện dương tạo phức với các loại điện tích âm. PEI có thể được hấp thụ hay ghép đồng hóa trị. Khi liên kết đồng hóa trị, PEI tạo 2 hoặc nhiều liên kết chéo, thường là với glutaraldehyde. Khi PEI tạo phức, tương tác bị ảnh hưởng 12 bởi nồng độ muối, pH, và nồng độ các thành phần có thể kết tủa. Cục Quản lý dược thực phẩm (FDA) đã cho phép PEI như là một phụ gia thực phẩm trực tiếp trong thực phẩm cho con người. Trong bài này sử dụng PEI 50% (w / v) trung bình trọng lượng phân tử 750000 Dalton.  Glutaraldehyde (GA) Liên kết đồng hóa trị xảy ra ở những nhóm chức phản ứng như là nhóm cacbonyl của glutaraldehyde. Glutaraldehyde tương tác liên kết chéo với các nhóm amin. Hoạt tính tương đối của các enzyme mà không có liên kết chéo là 83%. Sau khi sử dụng lần đầu tiên hoạt tính tương đối giảm xuống còn 67.5% do sự thất thoát. Hoạt tính tương đối của enzyme liên kết chéo bằng glutaraldehyde không thay đổi (83%) và ổn định ngay cả sau khi sử dụng đến lần thứ tám. Trong bài này sử dụng GA 25% (w / v). 2.3.2. Phương pháp cố định Cố định enzym trên vải cotton có 3 bước chính: hấp phụ của PEI lên vải cotton, đưa enzym vào PEI-cotton, GA liên kết chéo với PEI-enzyme. Enzym cố định được giữ lạnh đông cho đến khi sử dụng. Cho 1 ml PEI có pH 8, nồng độ PEI 0.22% (w / v) được bổ sung vào 0.2 g các mảnh vải bông trong bình erlen 125 ml, PEI phân bố đồng đều đến chất mang. Sau khi hấp phụ PEI, cho 50 mg enzym vào bình (10 ml dung dịch enzyme 5 mg /ml). Khi bổ sung enzyme dung dịch có màu trắng đục. Sau đó được giữ ở nhiệt độ phòng trong 10-15 phút. Thông thường, sự ghép nối được hoàn thành khi màu trắng đục biến mất. Những miếng cotton PEI-enzyme cho vào GA 0.2% (w / v), pH 7.0 trong 5 phút. Sau đó được cho liên kết chéo với GA giữ trong thời gian 420 phút ở nhiệt độ phòng. Các miếng cotton có màu vàng ở cuối quá trình cố định. Cuối cùng, miếng cotton được rửa với nước cất. Phần đầu của cố định, phải nghiên cứu tìm các tỷ lệ PEI enzyme thích hợp bằng cách thay đổi nồng độ PEI và pH ban đầu, đó là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến mức độ enzyme cố định trên cotton, pH của PEI được điều chỉnh bằng NaOH hay HCl. 13 Hình 2.2: Quá trình cố định enzym lên PEI So với các enzyme trong dung dịch, cố định enzyme β -galactosidase có nhiều ưu điểm trong sản xuất GOS, như enzyme có thể dùng lại, năng suất cao, cải thiện sự ổn định nhiệt, hoạt động liên tục, việc hình thành sản phẩm được kiểm soát, năng suất cao, enzyme không nhiễm vào sản phẩm. 14 Tạp chất Enzyme β- galactosidase tự do Lactose Nước Phản ứng Than hoạt tính Xử lý than hoạt tính Lọc Sản phẩm Tạp chất Tách GOS Cô đặc Sấy phun Mụi than & enzyme PHẦN 3: QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ 3.1. Sơ đồ khối: 3.1.1. Sơ đồ 1: Sản xuất GOS dùng enzyme β-galactosidase tự do có nguồn gốc từ A. oryzae Hình 3.1: Sơ đồ khối Sản xuất GOS dùng enzyme β-galactosidase tự do có nguồn gốc từ A. oryzae 15 Tạp chất Enzyme β- galactosidase cố định Lactose Nước Phản ứng Than hoạt tính Xử lý than hoạt tính Lọc Sản phẩm Tạp chất Tách GOS Cô đặc Sấy phun Mụi than & enzyme 3.1.2. Sơ đồ 2: Sản xuất GOS dùng enzyme β-galactosidase cố định bằng bông vải có nguồn gốc từ A. oryzae Hình 3.2: Sơ đồ khối sản xuất GOS dùng enzyme β-galactosidase cố định bằng bông vải có nguồn gốc từ A. oryzae 16 3.2 Giải thích qui trình công nghệ 3.2.1 Qui trình 1: Sản xuất GOS dùng enzyme β-galactosidase tự do có nguồn gốc từ A. oryzae 3.2.1.1 Phản ứng  Mục đích công nghệ: chế biến Chuyển hóa lactose thành GOS .  Các biến đổi  Vật lý: nhiệt độ tăng.  Hóa học: nồng độ các chất thay đổi hàm lượng GOS, glucose, galactose tăng lên , hàm lượng lactose giảm do phản ứng thủy phân lactose. Hóa sinh: enzyme β-galactosidase xúc tác phản ứng thủy phân lactose. Sau phản ứng lượng GOS đạt được là 27% với 50% lactose đã được chuyển đổi hay phản ứng. Bảng 3.1: Thành phần các chất sau phản ứng. Các chất sau phản ứng Hàm lượng các chất(%) Lactose Glucose Galactose GOS 2OS 3OS 4OS 5OS 6OS 50.38 17.22 4.98 27.42 0.00 18.30 5.77 2.35 1.01  Hóa lý: hiện tượng bốc hơi nước, đường tinh thể hòa tan, độ nhớt thay đổi.  Vi sinh: không có thay đổi nhiều.  Phương pháp thực hiện: Cho dung dịch lactose đã tiệt trùng và được gia nhiệt tới 40oC vào bình phản ứng, giữ dung dich ở nhiệt độ 40oC. Cho cánh hoạt động với tốc độ 30 – 50 vòng/phút. Chỉnh pH dung dịch về 4.5 rồi bổ sung enzyme vào. Giữ nhiệt độ ổn định trong suốt quá trình phản ứng. Khi phản ứng kết thúc, nâng nhiệt độ dung dịch đến 950 Cđể vô hoạt enzyme.  Thiết bị: Thiết bị dạng hình trụ, đáy cầu bằng thép không rỉ. Xung quanh thân dưới và đáy là lớp vỏ áo để giữ nhiệt cho dung dịch trong quá trình phản ứng. Phía trong có cánh khuấy. Một motor làm cánh khuấy quay được đặt phía trên đỉnh thiết bị. Cơ chất và enzyme được cho vào thiết bị qua cửa đỉnh. 17 Hình 3.3: Thiết bị phản ứng Người ta có thể đặt cảm biến nhiệt và pH trong thiết bị để theo dõi nhiệt độ và pH trong suốt quá trình phản ứng.  Các yếu tố ảnh hưởng:  Nhiệt độ và pH: Mỗi enzyme có một nhiệt độ và pH tối thích khác nhau. Tại nhiệt độ và pH tối thích này hoạt lực của enzyme sẽ là cao nhất. Đối với enzyme β-galactosidase có nguồn gốc từ A. oryzae thì pH tối thích là 4.5 và nhiệt độ tối thích là 40oC.  Enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme : Với: – vận tốc phản ứng; - nồng độ enzyme. Nhưng khi nồng độ enzyme quá lớn, cơ chất không đổi thì vận tốc phản ứng tăng chậm và tiến về cực đại. Do đó ta cần tính toán lượng enzyme sử dụng cho phù hợp để đạt được tốc độ phản ứng cao và không lãng phí enzyme. 18 Cơ chất: Hàm lượng lactose ban đầu trong môi trường là môt nhân tố quan trọng ảnh hưởng tối việc hình thành GOS. Lượng GOS thu được càng lớn khi môi trường chứa càng nhiều hàm lượng lactose. Hàm lượng lactose cũng ảnh hưởng tới loại GOS được taọ thành. Khi hàm lượng đường lactose ban dầu tăng thì hàm lượng các GOS có khối lượng phân tử lớn hơn sẽ tăng nhiều hơn hàm lượng các GOS có khối lượng phân tử thấp hơn. Bảng 3.2: Hàm lượng các loại GOS tạo thành trong môi trường có hàm lượng lactose khác nhau. Loại GOS Hàm lượng tạo thành trong môi trường lactose 50g/l Hàm lượng tạo thành trong môi trường lactose 500g/l 3OS 9.2% 18.3% 4OS 1.5% 5.5% 5OS 0.2% 3.1% 6OS 0% 1.1%) Tuy nhiên khi nghiên cứu môi trường tập trung lactose 400g/l và 500g/l người ta thấy chỉ có một khác biệt nhỏ về sản xuất GOS . Do đó, ta sẽ sử dụng môi trường chứa 400g/l lactose để sản xuất vì ở nồng độ lactose cao thì độ nhớt dung dịch cao và khả năng hòa tan của nó trong nước thấp sẽ dẫn tới khó khăn trong sản xuất. Hình 3.4: Ảnh hưởng của hàm lượng lactose ban đầu đến sự tạo thành GOS. Thời gian: Yếu tố thời gian là yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sản xuất GOS. Nếu thời gian quá ngắn hiệu suất chuyển đổi lactose không cao và GOS tạo thành không nhiều, nhưng thời gian quá dài tuy hiệu suất chuyển đổi của lactose vẫn tăng nhưng hàm lượng GOS tạo thành lại giảm. Hai đồ thị dưới thể hiện mối quan hệ giữa thời gian phản ứng, tỉ lệ lactose 19 được chuyển đổi, và tỉ lệ GOS tạo thành. Dựa vào đồ thị ta tính toán được thời gian phản ứng thích hợp của phản ứng là 37.5h. Hình 3.5: Biến đổi của các chất theo thời gian. Hình 3.6: Giản đồ biểu diễn hàm lượng GOS tạo thành theo phần trăm chuyển đổi của lactose.  Thông số công nghệ:  Nhiệt độ phản ứng: 40oC.  pH: 4.5.  Tốc độ khuấy: 30 – 50 vòng/phút.  Thời gian: 37.5h.  Lactose cho vào:400g/l.  Lượng enzyme cho vào: 1mg/ml đối với chế phẩm enzyme có hoạt tính 106.742 LU/g (Tổng công ty phát triển enzyme New York, LU là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 mmol glucose mỗi phút từ lactose ở pH 4,5 ở 37oC). 20 3.2.1.2 Tách các tạp chất bằng than hoạt tính:  Mục đích công nghệ : khai thác tách các tạp chất trong dung dịch.  Các biến đổi: có sự hấp thụ chất màu lên bề mặt than hoạt tính.  Nguyên tắc hoạt động: Than hoạt tính là vật liệu carbon có độ xốp cao. Khả năng hấp thụ của than hoạt tính lớn hơn than thường 50-60 lần. Bề mặt riêng của than hoạt tính có thể đạt đến 1300- 1700m2/g. Than hoạt tính có thể hấp thu nhiều loại tạp chất, đặc biệt là chất màu và chất mùi. Bơm dung dịch chứa GOS sau phản ứng vào thiết bị dạng cột chứa than hoạt tính. Chọn lưu lượng dòng chảy sao cho hỗn hợp đủ thời gian tiếp xúc với than hoạt tính, để cho các chất màu có thể hấp thụ lên than hoạt tính, sản phẩm đươc làm sạch theo yêu cầu.  Thiết bị: đường kính thân 0.7m và chiều c