Đề tài Sản xuất xylanase bằng phương pháp lên men bề mặt

1 I. GIỚI THIỆU: 1. Enzyme xylanase:  Định nghĩa: Xylanase là enzyme thủy phân mạch polysaccharide beta-1,4-xylan thành xylose, có nghĩa là nó thủy phân mạch hemicellulose (nhưng lại không ảnh hưởng gì đến cellulose). Hemicellulose là thành phần chính trong thành tế bào của thưc vật. Hình 1: Cơ chế thủy phân xylan  Cấu trúc: Hình 2: Cấu trúc không gian của enzym xylanase 2  Phân loại Có ít nhất là 3 cách để phân loại xylanase: Theo khối lượng phân tử và pI (Wong et al): - Xylanase có phân tử lượng cao: o pI cao (ở vùng base) o pI thấp (ở vùng acid) - Xylanase có phân tử lượng thấp: o pI cao (ở vùng base) o pI thấp (ở vùng acid) Theo cấu trúc tinh thể: - Family F Xylanase (glycosidase family 10): Miền hoạt động( catalytic domain) có dạng ống xylanh (cylindrical barrel). o Có hoạt tính của endocellulase. o Khối lượng phân tử lớn. - Family G Xylanase (glycosidase family 11): Miền xúc tác có dạng hình máng 2 lớp có nhiều nếp gấp (2 layered trough). o Không có hoạt tính cellulase. o Khối lượng phân tử thấp. Theo tính chất động học, cơ chất đặc trưng và sản phẩm tạo thành…  Cơ chế sinh tổng hợp enzyme Hình 3: Cơ chế sinh tổng hợp enzyme 3  Đặc tính: Tên khoa học: endo-1,4-β-xylanase (No EC 3.2.1.8) Loại: Hydrolase Cơ chất: Xylan Sản phẩm: Xylose Vi sinh vật: Aspergillus niger pH: 5 -6 (pH tối ưu 5.5) pI: 8.6 Nhiệt độ: 35 – 600C (nhiệt độ tối ưu 450C) Khối lượng phân tử: 13.5 – 14 kDa  Ứng dụng: Tẩy trắng giấy. Cải thiện nguồn dinh dưỡng của thức ăn gia súc. Làm trong nước rau quả. 2. Aspergillus niger: Hình 4 : Aspergillus niger 4  Đặc tính: Đây là loài nấm phát triển nhanh, sản sinh khuẩn lạc màu đen khi ủ ở 25 0C trong 10 ngày. Nó sinh ra mùi mốc. Loài nấm này phân bố rộng khắp. Nó được phân lập từ đất, không khí, cát biển, đầm lầy, sợi cây đước, nước ngọt chứa nguồn hữu cơ, nước bùn, thực phẩm, đặc biệt là trái cây và rau… Nó xuất hiện chủ yếu như là tác nhân gây ra nhiễm trùng mãn tính và thỉnh thoảng gây ra bệnh nấm phổi. A. niger phát triển mạnh trong môi trường thạch malt.  Phân bố: Loài Aspergillus phân bố rất nhiều trong tự nhiên, ở đất, ở xác thực vật, hoa quả và đặc biệt có nhiều ở vùng có khí hậu ấm áp. Một trong những chủng của loài đó được nghiên cứu kĩ trong các phòng thí nghiệm và qua quá trình sản xuất là Aspergillus niger. Chủng này trong quá trình phân hủy các chất glucid và các chất khác có khả năng tích luỹ ở môi trường một lượng axit hữu cơ và enzyme khá lớn.  Cấu tạo: Các khuẩn lạc bao gồm các màu cơ bản là màu trắng hoặc vàng mọc thành từng lớp dày đặc với đầu màu nâu tối hoặc màu đen và tạo thành bào tử dài khoảng 7-10µm, trong một số trường hợp có thể dày tới vài mm về chiều dài và có thể hơn 20µm về đường kính, khuẩn lạc có màu đen, trên những cuống bào tử có vô số những bào tử. Những bào tử này có thể nhìn rõ qua kính hiển vi. Hình dạng của cuống bào tử đính và sự hình thành hắc tố là điểm đặc trưng của Aspergillus niger. Cuống bào tử có 2 phần: o Phần thứ nhất: dài và to, có kích thước khác nhau, khoảng 10-20 µm về chiều dày. o Phần thứ hai ngắn hơn khoảng 2-3 µm, có màu nâu nhạt hay hoàn toàn đen. Đầu bào tử được chia thành 2 phần bởi vách ngăn: phần dạng túi màu nâu mọc ở trên và phần cuống ở dưới. Bào tử tự do có dạng cầu hoặc gần cầu, đường kính 3,5-5 µm, có thành nhám, màu nâu tối hoặc màu đen. Hình 5: Cấu tạo cuống bào tử cp - cuống bào tử đính v - thể bình s - cuống nhỏ c –các bào tử 5  Đặc điểm sinh lý: Vi sinh vật hiếu khí bắt buộc. Dị dưỡng hóa năng. Phương pháp sinh sản bằng bào tử. 3. Bã dầu cọ:  Cây dầu cọ: Cây dầu cọ thuộc: o Giới : Plantae o Ngành: Angiospermae. o Lớp : Monocots. o Bộ: Arecales. o Họ: Arecaceae. o Giống: Elaeis. o Loài: có 2 loài là: Elaeis guineensis (cọ dầu châu Phi) và Elaeis oleifera (cọ dầu châu Mỹ). Các cây trưởng thành là loại có một thân cây, có thể cao tới 20 m. Lá thuộc loại lá lông chim, có thể dài tới 3-5 m. Các cây non sinh ra khoảng 30 lá mỗi năm. Những cây trên 10 năm tuổi sinh ra khoảng 20 lá mỗi năm. Hoa mọc thành cụm dày dặc; mỗi hoa riêng rẽ là hoa nhỏ, có ba đài hoa và ba cánh hoa. Quả phải mất 5 đến 6 tháng kể từ khi thụ phấn để có thể chín; nó chứa lớp cùi thịt ngoài chứa nhiều dầu (vỏ quả), với một hạt duy nhất (nhân), cũng rất nhiều dầu. Không giống như họ hàng của nó là dừa, cọ dầu không sản sinh ra các chồi phụ; sự nhân giống được thực hiện bằng cách gieo hạt. Cây cọ dầu phát triển tốt trên đất pha cát và có khả năng chống chịu mặn tốt cũng như nó ưa thích các nơi sinh sống có nhiều nắng và lượng mưa bình thường (750–2.000 mm hàng năm), điều này giúp nó trở thành loại cây định cư bên các bờ biển nhiệt đới một cách tương đối dễ dàng. Cọ dầu cần độ ẩm cao (70– 80%) để có thể phát triển một cách tối ưu nhất và cho lại nhiều quả. Hình 6: Cây dầu cọ ở châu Phi 6  Quả dầu cọ: Cấu tạo: gồm 4 phần: o Ngoài cùng là lớp vỏ mỏng, khi chín đổi màu từ nâu sang đỏ cam. o Thịt quả có thớ, bao quanh hạt. o Tiếp theo là lớp vỏ cứng bên trong để bảo vệ hạt. o Hạt. Hình 7: Cấu tạo quả dầu cọ. Phân loại: có 3 loại dựa vào lớp vỏ cứng bao quanh hạt: - Dura: có vỏ cứng dày - Tenera: có vỏ cứng mỏng. - Pisifera: không có vỏ cứng. Hình 8: Các loại quả dầu cọ 7  Quy trình sản xuất bã dầu cọ: Hình 9: Quy trình sản xuất bã dầu cọ. Bảng 1: Thành phần hóa học của bã dầu cọ : Hàm lượng chất khô (%) 91.0 Protein thô (%) 15.2 Xơ thô (%) 16.0 Dung môi trích (%) 1.8 Tro (%) 3.8 Nitrogen tự do (%) 63.2 Calcium (%) 0.25 Phosphorus (%) 0.52 Magnesium (%) 0.16 Copper (Đồng) (ppm) 28.5 Ferrous (Sắt) (mg/kg) 4.05 Manganese (mg/kg) 225.0 Zinc (Kẽm) (mg/kg) 77.0 8 II. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ: Nguyên liệu CB môi trường Tiệt trùng Cấy giống Lên men Tinh sạch Sấy Nhân giống Enzym sạch Giống 9 III. THUYẾT MINH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ: 1. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG:  Mục đích: chuẩn bị  Môi trường: o Palm kernel cake: 10g o Môi trường Mandel: g/l - ure : 0.3 - peptone: 0.75 - dịch chiết nấm men: 0.25 - (NH4)2SO4 : 1.4 - KH2PO4 : 2 - CaCl2: 0.3 - MgSO4.7H2O : 0.3 -Các yếu tố vi lượng: (mg/l) FeSO4.7H2O: 5 MnSO4.4H2O : 1.6 ZnSO4.7H2O : 1.4 CoCl2.6H2O : 20 Với mỗi 10g cơ chất rắn bổ sung 15ml môi trường Mandel. Sau khi tiệt trùng, làm nguội và đưa về nhiệt độ 28±3ºC để cấy canh trường giống 104 tế bào/ml.  Thiết bị: Hình 10: Thiết bị khuấy trộn  Thông số công nghệ: Nhiệt độ phòng Tốc độ khuấy: 40 rpm Thời gian: 15-30phút 10 2. TIỆT TRÙNG MÔI TRƯỜNG:  Muc đích: tạo môi trường vô khuẩn chuẩn bị lên men  Các biến đổi: o Vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng, tỉ trọng (nước bốc hơi), … o Hóa lý: Sự bốc hơi nước. o Hóa sinh: Enzym bị vô hoạt. o Sinh học: Ức chế, tiêu diệt vi sinh vật. o Cảm quan: Sự tổn thất của một số cấu tử mẫn cảm với nhiệt (vitamin, …).  Thông số công nghệ: o Áp suất: 1 atm o Nhiệt độ: 121oC o Thời gian: 45 phút  Thiết bị: nồi hấp tiệt trùng Hình 11: Thiết bị Autoclave nằm ngang 11 3. NHÂN GIỐNG:  Giống được cấy trên môi trường dịch nước nha ở 370C đến khi hình thành bào tử. Tế bào sau đó được thu nhận và đếm trực tiếp bằng buồng đếm  Môi trường nhân giống: o Thành phần (g/l): - Dịch chiết malt 30.0 - Peptone 5.0 - Agar 15.0 Môi trường được hấp tiệt trùng ờ 115oC trong 10 phút. Dịch chiết malt là nguồn cung cấp năng lượng cho vi sinh vật, peptone cung cấp nguồn Nitơ cho vi sinh vật, agar là tác nhân làm đông đặc môi trường  Các yếu tố ảnh hưởng: o Nhiệt độ: Nếu tiến hành nhân giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn khoảng nhiệt độ tối ưu thì vi sinh vật sinh trưởng chậm hơn và hằng số tốc độ sinh trưởng của giống (μexpo) sẽ giảm xuống. o Oxy: Đối với nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc như Aspergillus niger, việc cung cấp oxy cho môi trường là rất cần thiết để giúp vi sinh vật tổng hợp năng lượng, duy trì các hoạt động trao đổi chất và tổng hợp sinh khối. o Thời gian: Theo lý thuyết, vào thời điểm đầu của giai đoạn ổn định, số lượng tế bào thu được trong canh trường là cao nhất và chúng có hoạt tính sinh lý ổn định. Do đó, ta kết thúc quá trình nhân giống để thu nhận sinh khối vào thời điểm này để đạt được hiệu quả kỹ thuật và kinh tế cao nhất.  Thông số công nghệ: o Nhiệt độ 37°C o Thời gian: 24-36h  Các cấp nhân giống: - Trong phòng thí nghiệm : Giống được nuôi trên môi trường thạch nghiêng . - Nhân giống giai đoạn phân xưởng: Sử dụng thiết bị nhân giống dạng hình trụ đứng, có cánh khuấy giúp đảo trộn đều canh trường 12 Hình 12: Minh họa các cấp nhân giống. 4. NUÔI CẤY:  Mục đích: khai thác tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển để thu enzyme.  Các gian đoạn phát triển của nấm mốc : o Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: - Nhiệt độ tăng rất chậm. - Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. - Thành phần dinh dưỡng có sự thay đổi. - Khối môi trường còn rời rạc. bắt đầu có - Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. o Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: - Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường. - Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường. - Môi trường được kết lại khá chặt. 13 - Độ ẩm môi trường giảm dần. - Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C. - Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. - Enzyme xylanase được tổng hợp mạnh. - Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất. o Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau: - Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. - Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng enzyme tạo ra sẽ giảm xuống . Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzyme rất cần thiết.  Các biến đổi: o Vật lý: tăng nhiệt độ o Hóa lý: ẩm bốc hơi, cấu trúc môi trường thay đổi o Hóa học: O2 giảm,CO2 tăng o Hóa sinh: sự hình thành enzyme, thay đổi tốc độ 1 số phản ứng hóa sinh o Sinh học: tăng sinh khối  Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình: o Nhiệt độ: Là một trong những thông số quan trọng quyết định đến sự thành công của của phương pháp lên men bề mặt. Khi nhiệt độ thấp, quá trình lên men kéo dài. Khi nhiệt độ quá cao, hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật bị giảm và các cấu tử mẫn cảm với nhiệt bị tổn thất. o Hàm ẩm: Nước làm cho cơ chất trương nở và tạo điều kiện cho vi sinh vật sử dụng tốt cơ chất. Tăng lượng ẩm có thể làm cho giảm độ xốp của cơ chất, do đó hạn chế lượng oxy chuyển vào cơ chất Tỷ lệ ẩm thấp dẫn đến giảm sự hòa tan chất dinh dưỡng của cơ chất rắn, độ trương nở thấp hơn và sức căng của nước cũng lớn hơn o Lượng giống cấy: Nếu lượng giống cấy ít, thời gian thu hồi sản phẩm sẽ kéo dài, năng suất không cao. Nếu lượng giống tăng, hoạt độ của xylanase cũng sẽ tăng nhanh dù sự sinh trưởng không tăng nhanh nhưng kéo theo là giai đoạn suy thoái cũng đạt nhanh hơn. 14 o Lượng oxy: A.niger là sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2,5÷3cm, phòng nuôi phải thoáng.  Thiết bị: Hình 13: Thiết bị lên men  Thông số công nghệ: Nhiệt độ: 28±3ºC Tỷ lệ ẩm giữa PKC và chất làm ẩm: 1:0.75 Canh trường giống: 104 tế bào/ ml với mỗi 10g cơ chất Thể tích thiết bị: 500 lít Thể tích hoạt động: 250 lít Lưu lượng khí: 1500 l/h Năng suất của hệ thống làm mát: 2.5kW  Đánh giá thiết bị: o Nhược điểm: Khó điều khiển quá trình nuôi cấy Tốn chi phí năng lượng cho việc thổi khí, cung cấp nhiệt. o Ưu điểm: Mặc dù có nhiều nhược điểm nhưng thống thiết bị này lại cho kết quả gần giống với kết quả đã nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nghĩa là ta sẽ thu được xylanase với hoạt tính và hiệu suất cao nhất trong những điều kiện tối ưu. 15 5. TINH SẠCH: a. TRÍCH LY:  Mục đích: thu nhận enzyme.  Các biến đổi:  Vật lý:  Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch.  Quá trình khuếch tán các chất hòa tan từ canh trường ra dung môi, song song đó, quá trình khuếch tán ngược chiều nước vào trong canh trường. Trao đổi ion Dịch enzyme sạch Canh trường Lọc gel Hòa tan kết tủa Kết tủa Ly tâm Trích ly Nước Bã Ly tâm 16  Hóa học:  Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng.  Sự thủy phân một số chất (đường, protein,…).  Hóa lý:  Sự hòa tan một số chất vào dung môi, làm tăng độ nhớt của dung dịch  Hóa sinh: Vô hoạt hệ enzyme thủy phân và oxy hóa – khử.  Cảm quan:  Màu dung dịch sậm hơn do xảy ra phản ứng Maillard.  Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly:  Chênh lệch nồng độ giữa canh trường và dung môi. Khi chênh lệch nồng độ lớn, lượng chất trích ly tăng.  Diện tích tiếp xúc của vật liệu rắn và dung môi càng lớn thì hiệu suất trích ly càng tăng, nhưng nếu vật liệu được nghiền quá mịn thì quá trình tách cặn sẽ khó.  Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuêch tán và giảm độ nhớt, phân tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi, tuy nhiên nhiệt độ là 1 yếu tố có giới hạn, vì khi nhiệt độ quá cao có thể xảy ra các phản ứng khác không cần thiết gây khó khăn trong quá trình công nghệ.  Thời gian trích ly càng dài thì lượng chất khuếch tán tăng, nhưng thời gian phải có giới hạn, khi đã đạt được độ trích ly cao nhất nếu kéo dài sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế.  Thiêt bị: Hình 14 : Thiết bị trích ly 2 vít nằm ngang tác động liên tục. 1-Máng nghiêng; 2-Bơm định lượng; 3-Bộ trao đổi nhiệt; 4-Vít tải; 5-Bộ định lượng; 6-Dẫn động; 7-Bơm; 8-Bộ trao đổi nhiệt; 9-Áo trao đội nhiệt.  Thông số công nghệ:  Nhiệt độ trích ly: 250C  Thời gian: 40-60 phút 17 b. LY TÂM LẦN 1:  Mục đích: tách sinh khối vi sinh vật và bã của canh trường.  Các biến đổi:  Vật lý:  Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch.  Hóa học:  Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng.  Hóa lý:  Huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng  Vi sinh: Hàm lượng vi sinh vật giảm.  Các yếu tố ảnh hưởng:  Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn – lỏng: chênh lệch nhiều thì quá trình phân riêng sẽ dễ dàng hơn.  Tốc độ quay của roto: tốc độ quay nhanh thì quá trình ly tâm sẽ tốt hơn  Thiết bị: Sử dụng các con lốc ly tâm để tách riêng các phần tử rắn và lỏng có tỷ trọng khác nhau Hình 15: Thiết bị ly tâm lắng  Thông số công nghệ:  Tốc độ quay: 10000rpm  Thời gian: 10 phút  Nhiệt độ: 4oC  Họat độ riêng: 80.1 IU/mg  Độ tinh sạch:1  Hiệu suất: 100% 18 c. KẾT TỦA ENZYME:  Mục đích: tách enzyme ra khỏi dung dịch.  Nguyên lý: dùng các muối hòa tan háo nước làm tăng nồng độ dung dịch và làm enzyme bị mất nước, kết tủa.  Các biến đổi: Vật lý: tăng nhiệt độ. Hóa lý: Biến tính protein Kết tủa các tạp chất có phân tử lượng lớn Enzyme chuyển từ dạng lỏng sang dạng rắn. Hóa sinh: vô hoạt enzyme.  Các yếu tố ảnh hưởng:  Nồng độ dung dịch enzyme ban đầu càng loãng thì enzyme càng khó kết tủa và ngược lại.  Lượng muối hòa tan bổ xung càng nhiều thì khả năng kết tủa enzyme càng cao nhưng nếu quá cao thì khả năng kết tủa giảm.  Thiết bị: Hình 16: Thiết bị kết tủa.  Thông số công nghệ:  Nhiệt độ: tiến hành kết tủa ở nhiệt độ phòng.  Muối: Amoni sunfat 80%.  Thời gian: 10 – 18 h.  Họat độ riêng: 162 IU/mg  Độ tinh sạch: 2  Hiệu suất: 74% 19 d. LY TÂM LẦN 2:  Mục đích: thu nhận kết tủa.  Các biến đổi:  Vật lý:  Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch.  Hóa học:  Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng.  Hóa lý:  Huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng  Các yếu tố ảnh hưởng :  Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn – lỏng: chênh lệch nhiều thì quá trình phân riêng sẽ dễ dàng hơn.  Tốc độ quay của roto: tốc độ quay càng nhanh thì quá trình ly tâm càng thuận lợi.  Thiết bị: giống ly tâm lần 1.  Thông số kỹ thuật: - Tốc độ quay: 10000rpm - Thời gian: 10 phút - Nhiệt độ: 4oC e. HÒA TAN:  Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lọc gel  Các biến đổi:  Enzyme chuyển từ dạng rắn sang dạng lỏng.  Nồng độ dung dịch enzyme giảm do mất các chất hòa tan.  Các yếu tố ảnh hưởng: Lượng dung dịch đệm càng nhiều thì khả năng hòa tan càng cao nhưng gây khó khăn trong quá trình lọc gel. Chêng lệch pH của dung dịch đệm và pI của enzyme càng cao thì hòa tan càng tốt  Thiết bị: dạng thiết dạng hình trụ có cánh khuấy.  Thông số công nghệ:  Dung dịch đệm: Phosphat ( 50mM, pH = 8 ). 20 f. SẮC KÝ LỌC GEL:  Nguyên lý của phương pháp : khác nhau về kích thước, hình dạng, cấu trúc không gian, phân tử lượng . Hình 17: Sắc ký lọc gel  Bản chất quá trình lọc gel:  Quá trình triển khai sắc ký được thực hiện thông qua sự tương tác của 2 pha: Pha tĩnh : là các hạt gel có cấu trúc mở, chứa liên kết ngang tạo thành mạng lưới không gian ba chiều được nhồi cố định trong cột. Bên trong và bên ngoài hạt gel có các mao quản kích thước nhỏ. Cả cột gel được giữ cân bằng bằng cách rửa qua dung dịch đệm. Pha động : là hỗn hợp gồm dịch enzyme và các tạp chất hòa tan khác có kích thước phân tử khác nhau được pha trong dung dịch đệm. Hình 18: Bản chất của quá trình lọc gel 21  Dung dịch mẫu chứa enzyme và các cấu tử hòa tan (pha động) có kích thước khác nhau được chạy qua cột. Những phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ mao quản của gel thường không thể đi vào bên trong hạt gel, vì thế chúng di chuyển trong khoảng không gian giữa các hạt. Những phân tử có kích thước nhỏ hơn thì có khả năng khuếch tán vào bên trong các hạt gel.  Các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình lọc gel:  Kích thước hạt gel: Chọn hạt gel có kích thước nhỏ nhằm khắc phục hiện tượng chảy tràn do trọng lực, chảy rối và tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha động và pha tĩnh. Tuy nhiên, nếu gel có kích thước quá nhỏ, đặc biệt là các gel có cấu trúc mềm thì xuất hiện sự tăng áp suất trong quá trình sắc ký và dễ xảy ra hiện tượng đè nén cục bộ.  Dung dịch đệm chiết xuất: Tùy theo độ ổn định của gel và các cấu tử cần chiết tách mà lựa chọn dung dịch đệm có pH thích hợp.  Tốc độ dòng chảy qua gel: Tốc độ dòng chảy qua gel phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm chiều dài cột, kiểu và kích thước hạt gel. Để đảm bảo an toàn chung cho sự rửa giải của cột gel thì tốc độ dòng chảy phải thấp hơn nhiều so với dòng chảy tự do. Tốc độ dòng chảy cao sẽ làm giảm độ khuếch tán của mẫu hoặc làm rộng miền khuếch tán nhưng chủ yếu là làm mất cân bằng nội tại giữa các cấu tử cần chiết tách và bề mặt mao quản gel. Tốc độ rửa giải quá thấp thì không những làm chậm quá trình phân tích mà còn có thể làm tăng sự phân tán của mẫu.  Thiết bị: Hình 19: Thiết bị lọc gel.