Đề tài So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III

ĐẶT VẤN ĐỀ Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau. Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1]. Berberin được biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli, điều trị bệnh lỵ. Thuốc được sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn, không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của vi khuẩn có ích ở ruột. Hiện nay trên thị trường có các dạng bào chế của Berberin như: thuốc nhỏ mắt, viên nén, viên bao…. Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lượng nguyên liệu làm thuốc cũng như thành phẩm là rất quan trọng. Dược điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại UV- VIS, dược điển Trung Quốc (2005) định lượng Berberin bằng HPLC. Để có cơ sở lựa chọn phương pháp định lượng Berberin thích hợp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “ So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III” với những mục tiêu sau: Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III So sánh hai phương pháp định lượng trên để tìm phương pháp thích hợp cho việc định lượng berberin trong các cơ sở kiểm tra chất lượng thuốc trong nước. PHẦN I. TỔNG QUAN VÀI NÉT VỀ BERBERIN: 1.1.1. Cấu trúc: Beberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có khung protoberberin[1]. Isoquinolin còn được gọi là benzo[c] pyridin hay 2- benzamin là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic[18] Cấu trúc của isoquinolin Công thức cấu tạo: Công thức phân tử: C20H18NO4+ PTL: 336.36 Tên khoa học : 5,6 dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a – azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6] 1.1.2. Nguồn gốc: Berberin thường có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin có nhiều trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so với alcaloid toàn phần [9]. Berberin thường có lẫn các tạp chất alcaloid khác như: palmatin, jatrorrhizin. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5 % [6],[13]. 1.1.3. Tính chất - Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng. Tan trong nước nóng, khó tan trong ethanol và nước lạnh, rất khó tan trong cloroform, không tan trong ether.[6] 1.5. Tác dụng dược lý: - Berberin có tác dụng kháng vi trùng như: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu và liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùng gây bệnh (kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đường ruột) [12], [17]. - Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệt khi dùng sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột, khi dùng phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đường ruột [17]. - Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co cơ, giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đường, ức chế cơn nhịp nhanh thất, giảm viêm cho người bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất huyết, giảm tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin[17]. Chỉ định: [9],[12],[17] - Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt. - Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài( do nắng, gió, lạnh, bụi, khói…) và điều trị bệnh đau mắt hột. - Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas. 1.1.6. Chống chỉ định: [17] - Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin - Người dị ứng với berberin ( rất hiếm gặp) 1.1.7. Dạng thuốc và hàm lượng: [11] - Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lượng 10 mg, hoặc 50-100 mg/ viên - Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (gió, nắng, lạnh, bụi, khói) 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN: 1.2.1. Phương pháp thể tích: [5], [13] Hòa tan 0,3g chế phẩm (chính xác) vào trong cốc với 150ml nước đang sôi. Làm nguội, chuyển dung dịch vào bình định mức 250ml. Lấy chính xác 50ml dung dịch kali dicromat 0,1N rồi thêm nước tới vạch. Lắc đều trong 5 phút, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 100ml dịch lọc cho vào bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, lắc cho tan, sau đó thêm 10 ml dung dịch acid hydrochloric 16%, đậy kín, lắc đều, để vào bóng tối trong 10 phút. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1N, gần điểm tương đương thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi màu xanh biến mất thì dừng. Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều kiện. 1ml dung dịch kali dicromat 0,1N tương ứng với 12,39 mg C20 H18NO4Cl. 1.2.2. Phương pháp đo UV-VIS Phương pháp 1:[6]. * Dung dịch thử: Cân 0.200 g chế phẩm và hòa tan trong 200ml nước bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 1000ml. Lấy 10ml dung dịch này pha loãng với nước đến 100ml. * Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,200 g Kali dicromat thuốc thử chuẩn đã sấy khô ở 1100C trong 4 giờ, hòa tan trong nước. Thêm 10ml dung dịch acid sulfuric 1N và thêm nước vừa đủ 1000ml. * Đo độ hấp thụ: Đo At và As của dunh dịch thử và dung dịch chuẩn ở bước sóng 421 nm. * Cách tính: Lượng ( mg) của C20H18NO4Cl được tính bằng công thức sau: a: khối lượng ( mg) kali dichromat. Phương pháp 2 [6] Xác định hàm lượng berberin clorid trong viên nén. * Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 80 mg berberin clorid, thêm 10ml nước để thấm đều bột viên, sau đó thêm khoảng 200ml nước sôi, khuấy kĩ 5 phút, để nguội rồi chuyển vào bình định mức 500ml, thêm nước tới vạch, lắc đều. Để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm. Lấy chính xác 5ml dung dịch trong ở trên đem pha loãng với nước cất vừa đủ 100ml. * Dung dịch chuẩn : pha tương tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu berberin clorid. * Mẫu trắng: nước cất. * Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn trong cùng điều kiện tại bước sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy 1 cm. 1.2.3. Phương pháp cân [5] Áp dụng để định lượng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo tủa của berberin với acid picric. Cân 20 viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml, thêm khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, rồi thêm methanol đến ngấn. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu. Lấy đúng 100ml dịch lọc. Làm bay hơi cho đến khô trên cách thủy, thêm 150ml dung dịch NaOH 0,1N và 90ml nước, đun nóng. Lắc kỹ để hòa tan. Để nguội rồi lọc qua giấy lọc đã thấm ướt. Rửa phễu và giấy lọc 3 lần, mỗi lần 10ml nước. Gộp dịch lọc và nước rửa, thêm 10ml dung dịch acid hydroclorid 0,1N rồi tiếp tục cho ngay và từ từ 30ml dung dịch bão hòa acid picric ( TT). Lắc đều. Để yên qua một đêm, lọc qua phễu thủy tinh xốp có đường kính lỗ xốp 10 – 16 mm ( đã cân bì) để lấy tủa. Rửa tủa 3 lần với nước cất ở khoảng 150C, mỗi lần 15ml nước, hút kiệt nước rồi sấy khô phễu và tủa ở 1000C đến khối lượng không đổi. Khối lượng tủa xác định là P (g). 1 g tủa tương ứng với 0,6586 g C20H18NO4Cl. 1.2.4. Phương pháp HPLC Phương pháp 1:[14], [15]. * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột thép không gỉ ( 25cm x 4 mm) được nhồi bởi hạt silicagel đã được octadecylsilan hóa có đường kính 5 mm. - Nhiệt độ cột: 400C. - Pha động: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat và 1,7g natri laurylsulfat trong 1000 ml hỗn hợp dung môi nước và acetonitril (1:1). - Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu của berberin khoảng 10 phút. - Detector UV ở bước sóng 345 nm. - Thể tích tiêm: 10 ml. - Nồng độ dung dịch thử và chuẩn: 0,1mg/ml và cách tiến hành pha 2 dung dịch này giống nhau. * Tiến hành: Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin trong các dung dịch thử , chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng berberin trong chế phẩm. * Cách tính: Lượng Wt (mg) của berberin clorid (C20H18ClNO4). Wt = Ws x (At / As) Ws = Lượng (mg) của berberin chuẩn, tính theo lượng khan. Phương pháp 2: [13] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột được nhồi bởi các hạt silicagel đã được octadecylsilan hóa. - Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kali dihydrophosphat với 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chứa 0,2% triethylamin, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric] và acetonitril (60:40). - Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút. - Detector UV ở bước sóng 263 nm. - Thể tích tiêm: 20 ml - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 32 mg/ml * Tiến hành: Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng berberin có trong chế phẩm. Phương pháp 3: [16] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột Hypersil C18 ( 5 mm, 25 cm x 4,6 mm) - Pha động: Acid phosphoric 0,04 mol/l – acetonitril ( 58: 42). - Tốc độ dòng: 1ml/phút. - Detector UV ở bước sóng 349 nm. * Tiến hành: Tương tự như 2 phương pháp HPLC đã trình bày ở trên. 1.3. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC 1.3.1. Nguyên tắc Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in. [8] 1.3.2. Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ. [8], [11] 1.3.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký: Kết quả của quá trình sắc kí được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ( hình 1): Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng Trong đó : to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách tR (thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích. tR’ (thời gian lưu thực ) = tR- to. W0,5: Độ rộng pic ở nửa chiều cao Wb: Độ rộng đáy pic. 1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’ [8] Nếu k' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau. 1.3.2.2 Độ chọn lọc a (selectivity - factor) a= (k2' > k1' ) [4], [8] a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2. 1.3.2.3. Độ phân giải (resolution) Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức: [4], [8] Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5 1.3.2.4. Hệ số bất đối AF Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức: [4], [8] Trong đó: W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lượng được chấp nhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tượng kéo đuôi càng rõ. Hiện tượng đỉnh kéo đuôi (tailing peak) có thể là do tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh hoặc cột sắc ký bẩn. Đỉnh kéo tuyến trước (fronting peak) có thể do lượng mẫu đưa vào quá lớn so với năng lực cột [7]. 1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N Đặc trưng cho hiệu lực cột. N = 16 hay N=5,54 [4], [8] Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng công thức: 1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8] Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau: a/Hệ thống bơm Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 - 400 bar) a/ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 mm ) và đuổi khí hòa tan. c/ Hệ tiêm mẫu Để đưa mẫu phân tích vào cột. Có nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động. Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp qua màng lọc 0,45 mm, còn mẫu rắn cần hòa tan trong 1 dung môi thích hợp. d/ Cột sắc ký lỏng HPLC Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được với áp suất cao đến vài trăm bar. - Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh có đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 mm). - Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm. e/ Detector trong HPLC Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ UV - VIS. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa. f/ Thiết bị hiển thị kết quả Có nhiều loại nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín hiệu đo dưới dạng pic. Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 2 Bơm Van tiêm mẫu Binh chứa pha động Cột Bộ phận tự ghi Detector Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC 1.3.5. Cách đánh giá pic[7] * Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tương ứng với tổng lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số 1,3 %). Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đường nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao. * Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic (khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ. Phương pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số k' là hằng định. * Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic. 1.4.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6] 1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng ở và cường độ Io qua dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l. Khi đi qua dung dịch ,một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì đi qua dung dịch . Mối quan hệ giữa I và Io được thể hiện bằng định luật Lambert-Beer. I = Io 10 -ồCl Với ồ là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch. 1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer + Chùm tia sáng phải đơn sắc + Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp) + Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang). + Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền duới tác dụng của ánh sáng (UV-VIS). 1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer + Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) như do tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém. + Sai lệch do hoá học: - Do sự phân ly (ion hoá): thường gặp khi pha loãng dung dịch, phân tử chất tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly không như nhau. - Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác dạng đơn phân tử. + Do phản ứng các chất lạ: - Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện tượng này xảy ra, người ta dùng mẫu trắng có thành phần như dung dịch, chỉ thiếu chất cần định lượng. - Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hưởng tới kết quả định lượng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng ²tạo màu², phải chú ý tới điều kiện phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng. 1.4.1.4. Một số đại lượng thông dụng[ a/ Độ truyền qua (T-Transmittance): Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang) đặc trưng cho độ trong suốt (về mặt quang học) của dung dịch, được định nghĩa: T = = 10-ồCl Thường T tính ra phần trăm (%). Một chất có T=1(hay100%), nghĩa là hoàn toàn không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt. b/ Độ hấp thụ (A-Absorbance): Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa : A = lg = ồ.C.l Đối với một chất xác định (có ồ xác định), thường đo trên một loại cốc đo (có bề dày thông thường là l=1 cm), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch: A=K.C (K=ồ.l) c/ Hệ số hâp thụ phần trăm (): Theo công thức A =ồ.C.l, nếu l=1 cm, C=1% thì : A = ồ = Vậy chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo có bề dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một ở xác định, là một hằng số. d/ Hệ số hấp thụ phân tử (ồỡ): Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1M/l, dùng cốc đo có bề dày1cm. Cũng như , với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác định (ở, dung môi, nhiệt độ,...) ồỡ là một hằng số. Giữa và ồỡ có mối liên hệ ồỡ = M ở đây M là phân tử gam của chất tan. 1.4.2. Một số kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-VIS.[2],[4],[8] 1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp: Đo độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ C của dung dịch dựa vào giá trị biết trước (tra cứu). A = .C.l → C = (với l =1 cm) Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sóng (ở) và mật độ quang A bằng cách: Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D2 (cho một vạch sáng có bước sóng xác định). Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số. Dùng một kính lọc Holmium (có các giá trị ởmax xác định cho trong tài liệu )để kiểm tra lại máy. Dùng dung dịch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiết quang phổ pha thành dung dịch có nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị ởmax và tìm Amax . 1.4.2.2. Phương pháp so sánh Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử có nồng độ Cx (chưa biết) và của dung dịch chuẩn có nồng độ Ac (đã biết). Ta có: = → Cx = x Cc Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc không được chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết quả càng chính xác. Ngoài ra còn có các kỹ thuật định lượng khác như: phương pháp đường chuẩn, phương pháp thêm đường chuẩn, phương pháp chuẩn độ đo quang, phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ . PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất, thuốc thử: 2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu: . Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lượng 83,3% do Viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp . Berberin clorid dạng nguyên liệu do bộ môn Hoá Dược cung cấp . Palmatin: do viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp 2.1.1.2. Hoá chất, thuốc thử: . Muối potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric (H3PO4) . Heptane sodium sulfonate, triethylamine . Acetonitril dùng cho HPLC (Merk) . Nước cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ môn Hóa vô cơ trường đại học Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC . Một vài hóa chất khác 2.1.1.3.