Đề tài Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio

Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio 1. Giới thiệu chungGiống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria.Vi khuẩn gram âm (-), hình phẩyDi động bằng 1 roiKỵ khí tùy ýKhông sinh bào tửPhát triển tốt ở pH trên 9, dung dịch NaCl 3%Test Catalase (+), Oxidase (+), H2S (-), lên men Glucose không sinh khíLà vi khuẩn gây bệnh tả, chủ yếu có ở trong các thực phẩm từ động vật biểnGiống Vibrio gồm 4 loàithuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm:V. CholeraeV. ParahaemolyticusV. VulnificusV. AlginolyticusVibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae có khả năng gây bệnh đường ruộtVibrio vulnificus có thể vào cơ thể thông qua vết thương hở hoặc do bệnh nhân uống nước biển chứa vi khuẩn. Triệu chứng nhiễm khuẩn thường xảy ra là nôn, sốt, tiêu chảy và hạ huyết áp.V. choleraeV. parahaemolyticusV. vulnificusV. alginolyticusPhản ứng oxidase (+)Tăng trưởng được trong môi trường canh trypton ở 42oCArginine dehydrolase (-)Lysine decarboxylase (+)Lên men được sucroseKhử nitrate thành nitriteCó thể tăng trưởng trong môi trường chứa 0-3% NaCl, không phát triển được trong môi trường chứa 6,8-10% muối.Phản ứng oxidase (+)Phát triển được trong canh trypton ở 24oCPhản ứng ADH (-), LDC (+)Khử nitrate thành nitriteKhông lên men sucroseKhông sinh hơiTăng trưởng trong môi trường chứa 8% muối, ức chế trong môi trường chứa 10% muối.Không lên men sucroseKhông tăng trưởng được trong môi trường không có muối, ức chế trong môi trường có 8-10% muối.Không lên men sucrosePhát triển được trong môi trường chứa đến 10% muối.2. Quy trình phân tích 2.1 Tăng sinh chọn lọcVibrio sinh trưởng bằng cách tăng sinh trong môi trường pepton kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V. cholera, V. alginolyticus và V. vulnificus; canh Colistine cho trường hợp V. parahaemolyticus.Mẫu lỏng: cho vào nước peptone kiềm, ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ.Mẫu rắn: cho vào túi PE vô trùng chứa nước peptone kiềm và đồng nhất trong máy dập mẫu rồi ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ.2.2 Phân lậpỬ trong môi trường TCBS ở 370C trong 18 – 22 giờ.Cấy khuẩn lạc đặc trưng sang môi trường TSA hay thạch máu.Ủ 370C để lấy sinh khối cho bước tiếp theo là thử nghiệm sinh hóa.Khuẩn lạcV.Cholerae và V.AlginolyticusKhuẩn lạcV.Parahaemolyticus và V.Vulnificus- Đường kính 2 – 3 mm- Màu vàng- Láng, hơi phẳng- Tâm đục và xung quanh khuẩn lạc có quầng trắng đục.- Đường kính 3 – 4 mm- Màu từ xanh đến xanh dương2.3 Thử nghiệm sinh hóaKết luận thử nghiệm sinh hóa của V. cholera Thử nghiệmKết quảONPG+Lactose-ADH-LDC+TDA-Indol+Mannose+Sucrose+Oxidase+Tính ưa muối0%+3%+6%-8%-10%-Thử nghiệm sinh hóa: Quan sát tính di động và hình thái của vi khuẩn trên kính hiển viQuan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X.Ghi nhận kết quả: di động hay bất động, hình dạng tế bào.Tiến hành:Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lên lam kính, đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên.Soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển vi thấy vi khuẩn tả di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường. Lam kính 2: Nhỏ 1 giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh tả đa giá. Nếu là vi khuẩn tả thì vi khuẩn sẽ bị bất hoạt, không di động nữa.Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, vi khuẩn tả di động như sao đổi ngôi .Thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm khả năng lên men đườngMôi trường: Phenol red broth base pH 7.4Chỉ thị pH: đỏ phenol, màu đỏ chuyển sang vàng khi pH dưới 6.8Kiểm nghiệm khả năng lên men: lactose, sucrose, mannoseBổ sung đường vào môi trường rồi khử trùngSau đó cấy và ủ 370C trong 18 – 20 giờThử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm khả năng lên men đườngĐánh giá dựa vào sinh acid (làm đổi màu chỉ thị) và sinh hơi (CO2 tạo thành được bẫy lại trong ống Durham).Kết quả:Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng.Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ. Thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm DecarboxylaseEnzyme carboxylase do VK tạo ra loại nhóm carboxyl của acid amin tạo amin hay diamin và CO2 .Môi trường: Decarboxylase Basal MediumChỉ thị: Bromothymol purple pH 6.0, vùng chuyển màu pH 5.2 – 6.8 thay đổi từ vàng thành tímKiểm nghiệm: ADH, LDC.Hấp khử trùng môi trường rồi cấyBổ sung dầu khoáng hay parafin rồi ủ 370C trong 1 đến 4 ngày.Thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm DecarboxylaseKết quả: Môi trường đục, màu tím (CO2 sinh ra làm thay đổi pH, đổi màu chỉ thị). Môi trường trong, màu vàngMT trước khi cấyPứ dương tínhPứ âm tínhThử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm khả năng sinh IndolMôi trường: TryptonThuốc thử: Kovac’sCho thêm eter để chiết IndolỦ 44.50C trong 24 giờKết quả:(+) Bề mặt môi trường màu đỏ(-) Bề mặt môi trường có màu vàng của thuốc thử (đôi khi có màu cam do Skatol là tiền chất Methyl hóa của Indol tạo ra).Chủng VSVMT canh tryptonThuốc thử Kovac’sPứ dương tínhPứ âm tính37oC / 24hThử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm khả năng sinh H2SThử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm khả năng sinh H2SEnzym desulfohydrase do VK tổng hợp sẽ xúc tác sự chuyển hóa acid amin chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) và phóng thích H2S.Môi trường:Thạch nghiêng: KIA, TSIThạch đứng: SIM, PIAĐĩa petri: BSACấy vào môi trường rồi ủ 370C trong 24 – 48 giờ hoặc đến 7 ngày nếu cần.Thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm khả năng sinh H2SKết quả: (+) Môi trường xuất hiện màu đen do H2S tạo tủa đen với sulfide trong môi trường. (-)Môi trường không có sự xuất hiện hay chuyển màu đen.(+)ĐCThử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm OxidaseXác định sự hiện diện của enzym oxidase ở VSV. Enzym quan trọng nhất của hệ enzym này là cytochrome oxydase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí.Thuốc thử: p – phenylenediamine.Cấy lên ống thạch nghiêng rồi ủ 24 – 48 giờ.Tiếp tục tiến hành theo 1 trong 2 cách:Nhúng giấy lọc vào tetramethyl – p – phenylenediamine dihydrochloride 1%, dùng que cấy dàn đều sinh khối lên tấm giấy lọc đó.Nhỏ lên sinh khối vài giọt p – aminophenylenediamine oxalate 1% và α – napthol 1% trong ethanol.Thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm OxidaseKết quả:(+) Xuất hiện màu xanh dương đậm do có sự hiện diện của cytochrom khử trong tế bào làm thuốc thử oxy hóa thành indolphenol.(-) Không xuất hiện màu xanh dương.Thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm ONPGCác VK lên men lactose tổng hợp trong tế bào tạo enzym β – galactosidase. Enzym này xúc tác thủy phân lactose và permease có vai trò vận chuyển lactose vào trong tế bào.Môi trường: ONPG broth 0.6% (o – nitrophenyl – D – galactopyranoside) trong dung dịch Na2HPO4 1mM.Khử trùng môi trường, cấy và ủ 370C trong 24 giờ.Thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm ONPGKết quả:(+) Xuất hiện màu vàng trong dịch cấy do quá trình thủy phân phóng thích o – nitrophenol có màu vàng.(-) Không xuất hiện màu vàng.Lactose agarChủng VSV2ml ONPG brothPứ (+)Pứ (-)ủ qua đêm37oCMàu vàngThử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm khả năng oxi hóa – lên men (thử nghiệm Hugh – Leifson)Nhằm xác định VSV biến dưỡng carbohydrate theo phương thức oxi hóa hay lên men, quá trình lên men tạo môi trường có tính acid cao hơn quá trình oxi hóa => làm đổi màu chỉ thị.Môi trường: Hugh – Leifson chứa glucose là nguồn carbon duy nhất.Chỉ thị: Bromothymol Blue.Cấy VSV vào 2 ống môi trường, sau đó chỉ có 1 ống phủ lên bề mặt lớp dầu khoáng parafin để cản sự tiếp xúc với oxi không khí.Ủ 2 ống ở 370C trong 24 – 48 giờ.Thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm khả năng oxi hóa – lên men (thử nghiệm Hugh – Leifson)Biến dưỡng theo phương thức lên menBiến dưỡng theo phương thức oxi hóa2 ống đều bị acid hóa đều trên mặt và phần sâu của môi trường.Ống kị khí bị acid hóa đều khắp thạch sâu.Ống hiếu khí không bị acid hóa trên mặt, chỉ bị acid hóa ở đáy ống.Thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm khả năng oxi hóa – lên men (thử nghiệm Hugh – Leifson)A: đối chứngB: phản ứng Ôxi hóaC: phản ứng lên menThử nghiệm kháng huyết thanh Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện.Một số phương pháp nhanh:Test kit: Thường được dùng để sàng lọc ở một phạm vi lớn, một số sản phẩm cũng đã được thương mại.Phương pháp miễn dịch: như EIA, ELISA cũng được phát triển, tuy nhiên các bộ kit được thương mại hoá thì không phổ biến khiến phương pháp này không được thịnh hành.Phương pháp sinh học phân tử: Ngày nay một số phương pháp phân tử đã được phát triển,đáng chú ý là kỹ thuật PCR. Hiện nay đã có bộ sinh phẩm dùng xác định cả 3 loài: V. cholerae, V. parahaemolyticus và V. vulnificus chỉ trong vòng 24h bằng kỹ thuật real time PCR (Labelled DNA probes ) từ mẫu thực phẩm, hơn nữa còn có thể xác định độc tố của V.cholerae mà bằng phương pháp phân tích từ các chủng V.cholerae rất khó khăn.Quy trình phát hiện và định danh V. cholera và V. parahaemolyticusSơ đồ định lượng V. parahaemolyticusTên chỉ tiêuMức1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, không lớn hơn1.000.0002. Tổng số Coliforms, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, không lớn hơn2003. Staphylococcus aureus, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, không lớn hơn1004. E. coli, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩmKhông cho phép5. Salmonella, tính bằng số khuẩn lạc trong 25g sản phẩmKhông cho phép6. Vibrio cholera, tính bằng số khuẩn lạc trong 25g sản phẩmKhông cho phépBảng 1. Chỉ tiêu vi sinh sản phẩm thuỷ sản đông lạnh - cá basa philê.Bảng 2. Chỉ tiêu vi sinh sản phẩm thuỷ sản đông lạnh – thịt nghêu luộc.Tên chỉ tiêuMức1. Tổng s ố vi sinh vật hiếu khí chịu nhiệt trung bình (300C), tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩmm = 50.000, M = 500.000. n = 5, c = 22. Vi sinh vật chỉ thị vệ sinh- Staphylococcus aureus, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩmm = 100, M = 1000, n = 5, c = 2- Coliform phân (440C trong môi trường đặc), tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm,m = 10, M = 100, n = 5, c = 2Hoặc E. coli (trên môi trường đặc), tính bằng số khuẩn lạc trong1g sản phẩmm = 10, M = 100, n = 5, c = 13. Vi sinh vật gây bệnh, tính bằng số khuẩn lạc trong 25 g sản phẩm :- SalmonellKhôngcho phép, n = 5, c = 0- ShigellaKhông cho phép, n = 5, c = 0- Vibrio choleraKhông cho phép, n = 5, c = 0Tên chỉ tiêuMức và yêu cầu1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, tính bằng số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩm, không lớn hơn100.0002. Tổng số coliform, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, không lớn hơn1003. Staphylococcus aureus, tính bằng số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩm, không lớn hơn1004. Escherichia coli, tính bằng số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩmKhông cho phép5. Salmonella, tính bằng số khuẩn lạc trong 25 g sản phẩmKhông cho phép6. Vibrio cholera, tính bằng số khuẩn lạc trong 25 g sản phẩmKhông cho phépBảng 3. Chỉ tiêu vi sinh vật của SurimiTài liệu tham khảo:[1] Trần Linh Thước. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm, mỹ phẩm. NXB Giáo dục. 2007.