Đề tài Tiêu chuẩn hiện hành trong kiểm nghiệm coliform và E.coli

CHUYÊN ĐỀI. Tổng quan về coliforms và E.coli 1. Coliforms 2. E.coliII. Các phương pháp định tính, định lượng 1. Định tính 2. Định lượng a. Phương pháp MPN b. Phương pháp đếm khuẩn lạc c. Phân tích nhanhIII. Các tiêu chuẩn hiện hành 1. Đối với nước 2. Đối với thực phẩm 3. Một số tiêu chuẩn quốc tế I. TỔNG QUANColiforms - Thuộc họ Enterobacteriaceae - Vi khuẩn hình que - Gram âm - Không sinh bào tử - Hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi - Sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 370C trong vòng 24 giờ - Không sinh bào tử - Chứa β-galactosidase I. TỔNG QUAN - Các giống có nguồn gốc từ phân (như Escherichia) : + Phát triển nhanh, khoảng 16 giờ, trong 8 môi trường dinh dưỡng ở 440C + Không mọc ở 40C. + Là loại vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp nhất là 410C. - Các giống không có nguồn gốc từ phân (như Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte ): + Chúng có nguồn gốc thuỷ sinh hay từ đất, + Mọc nhanh ở 4oC trong 3 – 4 ngày và 10oC trong 1 ngày. + Không mọc ở 41oC, + Ở 44oC ức chế hoàn toàn sự phát triển của tất cả các Coliform không có nguồn gốc từ phân.ColiformE.coliColiforms tổng sốColiforms chịu nhiệtColiforms phânVi khuẩn đường ruộtYersiniaSalmonellaShigellaVị trí của coliform trong họ Enterobacteriaceae (Vi khuẩn đường ruột)Coliforms chịu nhiệt:Là những coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24h khi được ủ ở 44oC trong môi trường EC.Coliforms phân (E.coli giả định):- Là coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24h ở 44.5oC trong môi trường Trypton.Fecal Coliform2. E.coli- Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc: Lớp: Schgzomycetes Bộ: Eubacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống: Escherichia Loài: Escherichia coli Là một phân nhóm của nhóm coliforms phân- Cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++--Hình. Vi Khuẩn E.coliCác dòng E.coli có khả năng gây bệnh: - EAEC (Enteroaggregative E. coli), E. coli kết tập ở ruột. - EHEC (Enterohemorrhagic E. coli), E. coli gây xuất huyết ở ruột. - EPEC (Enteropathogenic E. coli), E. coli gây bệnh đường ruột. - ETEC (Enterotoxigenic E. coli), E. coli sinh độc tố ruột. - EIEC (Enteroinvasive E. coli), E. coli xâm lấn niêm mạc ruột. II. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG1. Định tínhNguyên tắc: - E. coli lên men sinh hơi đường glucose, manitol, lactose, galactose nhưng không sinh hơi đường maltose, arabinose. E. coli không lên men dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin. - Trong môi trường BGBL, khuẩn lạc dẹt, có ánh kim - E. coli không sinh H2S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên Nitrate thành Nitrite. Qui trình định tính E.coliQui trình định tính E.colia/ Định lượng Coliforms:- Cấy 1ml dich đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB.- Thực hiện tương tự với mẫu pha loãng 10-2 và 10-3.- Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 48h.Ghi nhận ống có sinh hơi (+). Cấy dịch mẫu từ các ống LSB dương tính (+) sang các ống chứa canh BGBL. Ủ 37oC ± 1oC trong 48h.2.1. PHƯƠNG PHÁP MNPQuy trình định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phânVà E.coli bằng pp MPNGhi nhận số ống (+) có sinh hơi với mỗi độ pha loãng.b/ Định lượng Coliforms chịu nhiệt:Dùng que cấy vòng, chuyển một vòng dịch từ ống LSB (+) sang môi trường EC.Ủ trong 44.5 ± 0,2oC trong 24h. Đếm các ống có sinh hơi (+), ở mỗi độ pha loãng.c/ Định lượng Coliforms phân:Cấy ria dịch dịch mẫu từ ống (+) trên môi trường EC sang môi trường EMB ủ 37oC trong 24h. khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím là khuẩn lạc của Colifoms phân (E. coli giả định).- Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1ml cấy vào canh Tryptone, ủ ở 44,5 ± 0,2oC, trong 24h.Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm: ống có xuất hiện màu đỏ trong môi trường trong vài phút là ống (+).- Thực hiện cho tất cả các ống (+) trên môi trường EC.Ghi nhận các ống (+) trên môi trường tryptone tương ứng với mỗi độ pha loãng. c/ Định lượng Coliforms phân:d/ Định lượng E. coliThực hiện tương tự như trường hợp coliforms phân để tìm các khuẩn lạc E. coli giả định.Chọn các khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực thử nghiệm IMViC.(-) (+)Khuẩn lạc E. Coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là (+ + - -) chính là E. coli.Cách đọc kết quả: Từ kết quả thu được ở các trường hợp trên, dùng bảng MPN thích hợp để tính ra mật độ VSV trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.Thực hiện tương tự các ống (+) trong môi trường EC và tạo được được khuẩn lạc E. coli gỉa định trên môi trường EMB.- Ghi nhận số ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.Hệ thống MPN 15 ống2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc- Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu - Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu - Cấy mẫu vào môi trường, ủ mẫu - Đếm số khuẩn lạc hình thànhĐịnh lượng Coliforms, Coliform phân bằng pp đếm khuẩn lạc:Nguyên tắc: Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose & sinh acid sau khi ủ ở 37±1oC trong 24-48h.Máy đếm khuẩn lạcChuẩn bị mẫu đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3Cấy 1ml dd mẫu vào đĩa petri, bổ sung 5ml MT TSA, lắc đều,Để yên 1-2hRót vào mỗi đĩa 10-15ml MT thạch VRB, để đông, ủ ở 37oCTrong 24-48hĐếm các khuẩn lạc màu đỏ đến màu đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, đường kính ≥0,05mm, chọn 5 khuẩn lạc.Cấy vào ống canh BGBL, ủ ở 37oC, 24-48hCấy vào ống canh EC, ủ ở 44oC, 24-48hĐếm số ống canh(+) (sinh hơi)Tính tỉ lệ khẳng định ColiformsChọn ống canh (+)(sinh hơi)Mật độ ColiformsCấy vào ống canh Trypton,MR-VP, thạch SC CitrateThử nghiệm IndolĐếm số ống mt EC(+)& Indol(+), tính tỉ lệ khẳng định Coliform phânThử nghiệm IMViCMật độ Coliforms phânĐếm số ống mt EC(+)&IMViC++--, tính tỉ lệ khẳng định E.coliMật độ E.coliQuy trình định lượng Coliforms, Coliforms phân, E.coli bằng pp đếm khuẩn lạc Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật độ của Coliforms và Coliform phân.Nn1vf1++nivfiA(CFU/g hay CFU/ml) =x RN: tổng số khuẩn lạc đếm đượcni: số đĩa có số khuẩn lạc được tuyển chọn tại mỗi độ pha loãngv: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩafi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếmR: tỉ lệ khẳng địnhCách tính kết quả:Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quangCác chất nhuộm phát huỳnh quang- Acridin cam (AODC)- 4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI)- Fluorescein isothiocyanate (FITC)2.3. Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọcPhễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọc Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp: 2 thì loại bỏAChỉ tiêuKế hoạch lấy mẫuGiới hạn cho phép (CFU/ml)Phân loại chỉ tiêuncmMColiform tổng số4102AKiểm tra lần 1:Kiểm tra lần 2:2. Đối với thực phẩmSản phẩmChỉ tiêuKế hoạch lấy mẫuGiới hạn cho phép (CFU/ml hoặc CFU/g)Phân loại chỉ tiêuncmMPhomat được sản xuất từ sữa đã qua xử lýE.Coli52102103APhomat whey ( sản xuất từ whey đã qua xử lý nhiệt)E.coli52102103ACream và bơE.coli52101102AThịt và sản phẩm chế biến từ thịt sử dụng trực tiếp không cần xử lý nhiệtE.coli525.1015.102BThịt và sản phẩm chế biến từ thịt phải qua xử lý nhiệt trước khi sử dụngE.coli525.1025.103BGhi chú: (1) MPN/100g cơ thịt và nội dịchBảng 2.1: QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨMQCVN 8-3:2012/BYTSản phẩmChỉ tiêuKế hoạch lấy mẫuGiới hạn cho phép (CFU/ml hoặc CFU/g)Phân loại chỉ tiêuncmMNhuyễn thể hai mảnh, động vật chân bụng, động vật da gai, hải tiêu (tunicates) còn sốngE.coli10230(1)700(1)BGiáp xác và động vật thân mềm có vỏ hoặc đã bỏ vỏ gia nhiệtE.coli521101BThực phẩm chế biến từ ngũ cốc cho trẻ từ 6 đến 36 tháng tuổiColiform52<320ARau ăn sốngE.coli52102103BQuả ăn ngayE.coli52102103BBảng 2.1: QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨMQCVN 8-3:2012/BYTNhóm thực phẩmGiới hạn cho phép (CFU/g hay CFU/ml thực phẩm)TVKHKECOCOLNhóm thịt-Thịt tươi, thịt đông lạnh, thịt xay nhỏ, thịt nghiền, thịt chế biến.- Sản phẩm chế biến từ thịt: thịt hun khói, pate, xúc xích.1061023-105350Nhóm cá và hải sảnCá và thủy sản tươi sống.Sản phẩm chế biến: tôm, cá hấp nóng, hún khói, chả cá, chả mực, các loại giáp xác, nhuyễn thể luộc hấp.Thủy sản khô sơ chế: cá khô.10610210531010610102Nhóm trứngTrứng tươi, dịch trứng tươi hoặc đông lạnh.Sản phẩm chế biến từ trứng (đã tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur1053102106010Bảng 2.2: Chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thực phẩm, Bộ Y tế 4/1998.Nhóm thực phẩmGiới hạn cho phép (CFU/g hay CFU/ml thực phẩm)TVKHKECOCOLNhóm sữaSữa khô, sữa bộtSữa tươi tiệt trùng theo phương pháp Pasteur.Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp U.H.TSản phẩm chế biến từ sữa (bơ, sữa chua, pho mát).5.1040105.1043101000104010Sản phẩm chế biến từ ngũ côc, khoai củ, đậu đỗ:Cần xử lí nhiệt trước khi dùng: bột, miến, mì sợi.Dùng trực tiếp không xử lí: bánh bột.106102103104310Nhóm nước khoáng và nước giải khát đóng chai:Nước giải khát có cồn.Nước giải khát không cồnNước khoáng đóng chai.100102010Theo G.M.P30Bảng 2.2: Chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thực phẩm, Bộ Y tế 4/1998.Nhóm thực phẩmGiới hạn cho phép (CFU/g hay CFU/ml thực phẩm)TVKHKECOCOLNhóm gia vị1043102Nhóm nước chấm-Nguồn gốc động vật: nước mắm.- Nguốn gốc thực vật10401021040102Nhóm thức ăn khô và chứa dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay thế đặc biệt Phải xử lí trước khi sử dụng.Dùng trực tiếp, không qua xử lí nhiệt.1051010104010Kem, nước đá5.1040102Nhóm đồ hộp0Nhóm dầu mỡ103310Bảng 2.2: Chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thực phẩm, Bộ Y tế 4/1998.TIÊU CHUẨNTÊN MẶT HÀNGTVKHKCOLECOTCVN5289/92Cá fillet, tôm, mực1.000.0002000TCVN4381/92Tôm vỏ đông lạnhTCVN4380/92Tôm thịt đông lạnhTCVN4546/94Tôm mũ ni đông lạnhTCVN5835/93Tôm thịt IQFTCVN2644/94Mực đông lạnhBảng 2.3: TCVN và TCN (Bộ thủy sản) về vi sinh trên thủy sảnBảng 2.3: TCVN và TCN (Bộ thủy sản) về vi sinh trên thủy sảnTIÊU CHUẨNTÊN MẶT HÀNGTVKHKCOLECOTCVN5649/92Hàng khô (không ăn liền)1.000.0000TCN 118:1998Thịt nghêu luộc: n:5m: 50.000M: 500.000c: 228TCN 119/98Surimi cá biển10.000100028TCN 104/97Mực nang fillet ăn liềnSashimi 50.00010028TCN 105/9728TCN 117/98Nhuyễn thể 2 mảnh1.000.0002000Cá basa fillet1.000.0002000Bảng 2.3: TCVN và TCN (Bộ thủy sản) về vi sinh trên thủy sảnTIÊU CHUẨNTÊN MẶT HÀNGTVKHKCOLECOTCVN6175/9Mực, cá khô tẩm gia vị50.000100TCVN5526/91Nước mắm20.00010/ml0THỊ TRƯỜNGTÊN MẶT HÀNGTVKHKCOLECOChâu ÂuGiáp xác và nhuyễn thể luộcHàng dạng nguyên liệu (raw material)Hàng ăn liền (raedy to eat)Ruốc tôm bò (nguyên con)104Thuỷ sản thanh trùng Pasteur, bảo quản sơ1050Thuỷ sản ngâm dầu, muối1050Cá fillet ướp lạnh105Bảng 2.4: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị trường Châu Âu3.Một số tiêu chuẩn Quốc tếTHỊ TRƯỜNGTÊN MẶT HÀNGTVKHKCOLECOChâu ÂuCá fillet đông lạnh1-5 x 104Cá xông khói5 x 10501Nhuyễn thể 2 mảnh sốngGiáp xác luộc nguyên con ướp lạnh105Giáp xác / tôm luộc nguyên con ướp lạnh1030Tôm luộc nguyên con ướp lạnh105Điệp, sò106Bảng 2.4: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị trường Châu ÂuTHỊ TRƯỜNGTÊN MẶT HÀNGTVKHKCOLECOChâu ÂuĐùi ếch ướp lạnh, đông lạnh5 x 104Nhuyễn thể 2 mảnhm = 104M = 105Cá nguyên con fillet103 – 5 x 104Tôm vỏ103 – 5 x 105Tôm thịt104 – 5 x 104Mực, bạch tuộc104 – 5 x 1062500Cá cắt lát5 x 105Bảng 2.4: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị trường Châu ÂuTHỊ TRƯỜNGTÊN MẶT HÀNGTVKHKCOLECOChâu ÂuTôm thịt luộc đông lạnh105Hàu3/100mlTôm luộc ( 5 mẫu)Tôm105 – 1062500Điệp chín đông lạnh1040Bảng 2.4: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị trường Châu ÂuTHỊ TRƯỜNGTÊN MẶT HÀNGTVKHKCOLECOBắc MỹHàng luộc và ăn liềnm = 4M = 40Các loại khácm = 4M = 40Nghêu, sò, điệp, hàu đông lạnh5 x 105230Thịt cua3,6Tôm bao bột105102Bảng 2.5: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị trường Bắc MĩTHỊ TRƯỜNGTÊN MẶT HÀNGTVKHKCOLECOChâu ÁCá khô tẩm gia vị, mực5 x 10400Giáp xác luộc1049Giáp xác đông lạnh10611Tôm vỏ đông lạnh1062000Tôm thịt đông lạnh1062000Tôm thịt IQF1062000Mực đông lạnh1062000Hàng khô ( không ăn liền)1060Bảng 2.6: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị trường Châu ÁTHỊ TRƯỜNGTÊN MẶT HÀNGTVKHKCOLECOChâu ÁThịt nghêu luộcm = 5 x 104M = 5 x 105c = 2Surimi cá biển1051000Mực nang fillet ăn liềnSashimi5 x 104100Nhuyễn thể 2 mảnh1062000Cá basa fillet1062000Nước0/100mlNước mắm2 x 10410/ml0Bảng 2.6: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị trường Châu ÁNước và thực phẩm nuôi sống con người nhưng cũng có thể gây ngộ độc hoặc nhiễm bệnh cho con người do có thể chứa các độc tố vi sinh vật hoặc các vi sinh vật gây bệnh.Mặc dù có thể gây ngộ độc, số lượng tế bào vi sinh hiện diện hoặc độc tố của chúng tiết ra trong thực phẩm khi được sử dụng phải đủ lớn.Tuy mật độ vi sinh vật ban đầu trong nước , trong nguyên liệu, trong thực phẩm có thể rất thấp nhưng ở những điều kiện nhất định thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật trong quá trình chế biến hoặc bảo quản thực phẩm, mật độ vi sinh vật được nhân lên nhanh đến mức đủ để gây bệnh hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại.Do vậy mật độ cho phép của vi sinh vật gây bệnh trong nước, thực phẩm là rất thấp, trong đa số các trường hợp là bằng không.Trần Linh Thước (2012), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB GD Việt Nam.