Đề tài Tìm hiểu quy trình phát hiện enterobacter sakazakiitrong sữa bột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII TRONG SỮA BỘT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : VƯƠNG MINH ĐẠT MSSV: 0811110013 Lớp: 08CSH1 TP. Hồ Chí Minh, 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, với sự hỗ trợ từ Giáo viên hướng dẫn. Những số liệu trong các bảng biểu và hình ảnh phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác, và đề tài cũng được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, cũng như kết quả khóa luận của mình. TP.HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011 Sinh viên Vương Minh Đạt LỜI CẢM ƠN Trải qua ba năm học dưới mái trường đại học kỹ thuật công nghệ, được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, nay đã hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp. Nhờ trong quá trình làm bài khóa luận, mà em đã học được nhiều kiến thức mà trước đó em chưa hề biết. Em xin chân thành cám ơn các thầy cô khoa Môi trường và công nghệ sinh học, đã giúp đỡ em tận tình trong ba năm học vừa qua để hoàn thành khóa học. Em xin cám ơn giáo viên hướng dẩn đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình làm bài khóa luận tốt nghiệp. Một điều không thể thiếu, đó chính là gia đình, cha mẹ đã động viên em, giúp em có thêm tinh thần, vượt qua được khó khăn về tinh thần, cũng như về vật chất. Nhờ vậy, mà em có thể hoàn thành khóa học và hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp này. Ngoài thầy cô và gia đình ra, một điều quan trọng không thể thiếu, đó chính là tập thể các bạn lớp 08CSH trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ. Chính nhờ các bạn, giúp đỡ động viên rất nhiều trong quá trình học tập, cũng như trong đời sống. Em xin chân thành cám ơn!!! TP.HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011 Sinh viên Vương Minh Đạt i MỤC LỤC Danh mục các từ viết tắt ........................................................................................v Danh mục các bảng ..............................................................................................vi Danh mục các hình ..............................................................................................vii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................................1 1.2. Mục đích ........................................................................................................1 1.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giá trị dinh dưỡng của sữa bột........................................................................2 2.1.1. Đường lactose..............................................................................................2 2.1.2. Protein .........................................................................................................2 2.1.3. Chất béo ......................................................................................................3 2.1.4. Chất khoáng.................................................................................................5 2.1.5. Vitamin........................................................................................................5 2.1.6. Các hợp chất khác........................................................................................6 2.2. Các vi sinh vật gây hại trong sữa bột...............................................................6 2.2.1. Listeria monocytogenes ...............................................................................6 2.2.1.1. Giới thiệu..................................................................................................6 2.2.1.2. Phân loại ...................................................................................................6 2.2.1.3. Đặc điểm .................................................................................................7 2.2.1.4. Yếu tố độc lực...........................................................................................7 2.2.1.5. Khả năng gây bệnh ...................................................................................8 2.2.1.6. Các thực phẩm liên quan...........................................................................9 2.2.2. Escherichia Coli ..........................................................................................9 2.2.2.1. Giới thiệu..................................................................................................9 2.2.2.2. Phân loại ...................................................................................................9 2.2.2.3. Hình thái, cấu trúc...................................................................................10 2.2.2.4. Đặc điểm ................................................................................................10 ii 2.2.2.5. Khả năng gây bệnh .................................................................................11 2.2.2.6. Các thực phẩm liên quan.........................................................................12 2.3. Tổng quan về Enterobacter sakazakii ...........................................................13 2.3.1. Lịch sử phát hiện .......................................................................................13 2.3.2. Phân loại....................................................................................................13 2.3.3 Đặc điểm ....................................................................................................14 2.2.3.1. Đặc điểm chung .....................................................................................14 2.2.3.2. Đặc điểm sinh hóa ..................................................................................16 2.3.4. Cấu trúc ....................................................................................................16 2.3.4.1. Thành tế bào ...........................................................................................17 2.3.4.2. Màng sinh học ........................................................................................18 2.3.4.3. Tiên mao.................................................................................................19 2.3.5. Yếu tố độc lực ...........................................................................................20 2.3.6. Cơ chế gây bệnh ........................................................................................21 2.2.6.1. Các nguồn nhiễm bệnh............................................................................21 2.2.6.2. Triệu chứng ............................................................................................21 2.2.7. Các biện pháp phòng và xử lí bệnh ............................................................22 2.2.7.1. Các biện pháp phòng bệnh ......................................................................22 2.2.7.2. Xử lí bệnh ...............................................................................................22 2.2.8 Tình hình nhiễm E. sakazakii trong sữa bột ................................................22 2.2.8.1. Việt Nam ................................................................................................22 2.2.8.2. Thế giới ..................................................................................................23 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII 3.1. Phương pháp truyền thống ............................................................................25 3.1.1. Nguyên tắc.................................................................................................25 3.1.2. Môi trường nuôi cấy ..................................................................................25 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................25 3.1.4. Lấy mẫu.....................................................................................................25 3.1.5. Chuẩn bị mẫu thử.......................................................................................27 iii 3.1.6. Quy trình phân tích ....................................................................................28 3.1.7. Cách tiến hành ...........................................................................................29 3.1.7.1. Phần mẫu thử ..........................................................................................29 3.1.7.2. Tiền tăng sinh .........................................................................................29 3.1.7.3. Tăng sinh chọn lọc..................................................................................29 3.1.7.4. Phân lập Enterobacter sakazakii giả định................................................29 3.1.7.5. Khẳng định .............................................................................................30 3.1.8. Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar ...............................................................................31 3.1.9. Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường MacConkey ...................32 3.1.10. Khẳng định sinh hóa ................................................................................33 3.1.10.1. Môi trường và thuốc thử trong thử nghiệm sinh hóa..............................33 3.1.10.2. Phép thử Oxydase .................................................................................34 3.1.10.3. Phép thử L-Lysin decarboxylase, L-Ornithin decarboxylase .................34 3.1.10.4 Phép thử L- arginin dihydrolase .............................................................34 3.1.10.5. Phép thử lên men các loại đường khác nhau..........................................34 3.1.10.6. Phép thử chỉ sử dụng Citrate .................................................................34 3.1.10.7. Thử nghiệm Nitrate...............................................................................35 3.1.10.8. Thử nghiệm ONPG ...............................................................................36 3.1.10.9. Thử nghiệm tính di động trên thạch mềm..............................................37 3.1.9.10. Thử nghiệm VP (voges-proskauer) .......................................................38 3.2. Các phương pháp hiện đại.............................................................................39 3.2.1. Phương pháp PCR .....................................................................................39 3.2.1.1. lịch sử phát triển .....................................................................................40 3.2.1.2. Nguyên tắc..............................................................................................40 3.2.1.3. Các thành phần tham gia vào quá trình PCR ...........................................41 3.2.1.4. Phương pháp xác định Enterobacter sakazakii bằng phản ứng PCR........43 3.2.2. Phương pháp real time PCR.......................................................................46 3.2.2.1. Lịch sử phát triển ....................................................................................46 iv 3.2.2.2. Khái niệm và nguyên lí hoạt động...........................................................47 3.2.2.3. Phương pháp tiến hành............................................................................49 CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận ........................................................................................................52 4.2. Kiến nghị......................................................................................................53 Tài liệu tham khảo...............................................................................................55 PHỤ LỤC............................................................................................................56 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ATVSTP: An toàn Vệ sinh thực phẩm FDA : Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ TCVN: Tiêu chuẩn việt nam PCR: Polymerase Chain Reaction BPW: Buffered Pepton Water mLST: Canh thang tryptoza lauryl sulfat cải biến ESIATM : Môi trường phân lập Enterobacter sakazakii giả định TSA: Tryptone Soya Agar EE: Enrichment Enterobacteriaceae ONPG: O-Nitrophenyl-p-D-galactopyranoside MR-VP: Methyl red – Voges Proskauer KIA: Kligler Iron Agar TSI: Triple Sugar Iron Agar PCR: Polymerase Chain Reaction vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Khối lượng đường lactose trong các loại sữa bột Bảng 2.2. Thành phần chất béo có trong sữa bò Bảng 2.3. Thành phần chất khoáng có trong sữa bột Bảng 2.4. Các thành phần vitamin trong sữa vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes Hình 2.2: Vi khuẩn Escherichia Coli Hình 2.3: Trẻ em bị viêm màng não do sử dụng sữa bột nhiễm E. sakazakii Hình 2.4: E.sakazakii dưới kính hiển vi Hình 2.5: Tế bào vi khuẩn E. sakazakii Hình 2.6: Cấu trúc tế bào Gram – Hình 2.7: 5 bước phát triển của màng sinh học Hình 2.8: Cấu trúc tiên mao Hình 2.9: Hai loại sữa điển hình nhiễm E. sakazakii Hình 3.1: E. sakazakii trong môi trường ESIA Hình 3.2: E. sakazakii trên môi trương thạch TSA Hình 3.3: Khuẩn lạc Enterobacter sakazakii trên môi trường Brilliance Enterobacter sakazakii Agar Hình 3.4: E. sakazakii trên môi trường Macconkey Hình 3.5: Kết quả thử nghiệm nitratase (+) khi xuất hiện màu đỏ Hình 3.6: Kết quả thử nghiệm ONPG (+) ống nghiệm màu vàng Hình 3.7: Kết quả thử nghiệm VP ( Voges-Proskauer) Hình 3.8: Cơ chế của phản ứng PCR Hình 3.9: Kết quả sau khi điện di Hình 3.10: Sơ đồ phát quang của Taqman-probe Hình 3.11: Kết quả được đọc bằng máy real time 7500. Hình 3.12: Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dò trên gene OmpA của E. sakazakii 1 CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong xã hội hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm ở trên thế giới và Việt Nam là rất cao. Tình trạng này chưa có dấu hiệu dừng lại và càng ngày càng tăng. Qua kiểm tra cho thấy hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm này là do vi sinh vật gây ra. Đây là điều đã được cảnh báo và đã có cách thức phòng ngừa nhưng vẫn xảy ra các vụ ngộ độc tập thể gây nguy hiểm và có thể dẫn đến tử vong. Trong đó Vi khuẩn Enterobacter sakazakii là nguyên nhân gây ra các bệnh như viêm màng não, viêm ruột hoại tử để lại nhiều di chứng nghiêm trọng về thần kinh và có thể gây chết người. Tỷ lệ Enterobacter sakazakii gây tử vong ở bệnh viêm màng não là 40-80% và viêm ruột hoại tử là 10-55%. Nguyên nhân lây nhiễm chủ yếu của loại vi khuẩn này là do sử dụng sữa bột bị nhiễm Enterobacter Sakazakii Xuất phát từ những lý do trên tôi đã tiến hành thực hiện bài khóa luận: “Qui trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột”. Để có cái nhìn tổng quan về vi sinh vật này 1.2 Mục đích Tìm hiểu về vi khuẩn Enterobacter sakazakii và qui trình phân lập và phát hiện E. sakazakii trong sữa bột. 1.3 Nội dung nghiên cứu - Tìm hiểu về giá trị dinh dưỡng của sữa bột và các mối nguy trong sữa bột - Tìm hiểu tổng quan về E. sakazakii - Các qui trình phân lập E. sakazakii 2 CHƯƠNG II : TỔNG QUAN 2.1 Giá trị dinh dưỡng của sữa bột 2.1.1 Đường lactose Glucid của sữa là lactose hay còn gọi là đường sữa, trung bình mỗi 1 lít sữa bột có 50g. Lactose là một disaccharide do một phân tử glucose liên kết với một phân tử galactose tạo thành, enzyme lactase phân hủy đường lactose thành monosacarit Trong sữa đường lactose tồn tại dưới 2 dạng  Dạng α-lactose mono hydrat C12H22O11H2O  Dạng β-lactose anhydrous C12H22O11 Ngoài ra trong sữa bò còn chứa các loại đường khác nhưng hàm lượng rất thấp Bảng 2.1 khối lượng đường lactose trong các loại sữa bột[1] Loại sữa bột Khối lượng lactose/100g bột Sữa bột 78.0 g Sữa bột tách kem 52,9 g Sữa bột cho trẻ sơ sinh 50,9 g 2.1.2 Protein - Casein Casein là tên của một nhóm protein chủ yếu trong sữa. Trong sữa bò casein chiếm gần 80% tổng số protein hay khoảng 26 g cho 1 lít sữa. Có cấu tạo là các hạt hình cầu có kích thước 40-200 µm. Chúng tồn tại dưới dạng micelle chứa 65% là nước phần còn lại là các casein và khoáng (canxi, magie, phosphate, citrate). Là protein có tính acid vì phân tử của chúng chứa nhiều gốc acid glutamic và acid aspartic 3 - Các protein khác Protein hòa tan gồm : albumin 0,4% và globulin 0,2% bị đông tụ khi đun nóng sữa lên đến 80oc Immunoglobulin trong sữa bò có 3 loại là IgG, IgM, IgA trong đó IgG chiếm hàm lượng cao nhất, IgA có chức năng chống nhiễm trùng đường ruột Serum-albumin là protein có phân tử lượng lớn có nguồn gốc từ máu rất mẫn cảm với nhiệt độ Ngoài ra trong sữa còn có các loại protein màng, hàm lượng của chúng rất thấp - Enzyme Enzyme do tuyến vú tiết ra hoặc do vi sinh vật trong sữa tổng hợp nên. Sự có mặt của enzyme là nguyên nhân gây ra biến đổi thành phần hóa học của sữa trong quá trình bảo quản, dẫn đến chất lượng sữa hư hỏng. Nhưng một số loại enzyme trong sữa có khả năng kháng khuẩn như lactoperoxydase, lysozyme. Hàm lượng vi sinh vật càng nhiều thì thành phần enzyme càng đa dạng, có 60 loại enzyme trong sữa Lactoperoxidase: Enzyme này xúc tác phản ứng chuyển hóa oxy từ H2O2, đến các chất oxy hóa khác Catalase: Enzyme này luôn có trong sữa do tuyến vú tiết ra, xúc tác phân hủy H2O2, thành nước và oxy tự do Lipase: enzyme quan trọng nhất trong sữa,là một glycoprotein, xúc tác thủy phân liên kết ester trong cơ chất triglyceride Protease: enzyme này xúc tác phân hủy protein. Có 2 loại protease là : protease kiềm và protease axit Ngoài ra còn có các loại enzyme khác như : phosphatase, phosphatase acid. 2.1.3 Chất béo Chất béo là một trong những thành phần quan trọng nhất của sữa. Hàm lượng chất béo của sữa thay đổi trong một phạm vi khá rộng. Có loại sữa ít 4 béo, khoảng 3g trong 100 ml sữa, có loại sữa nhiều chất béo khoảng 5-6g trong 100 ml sữa. Đối với sữa bò hàm lượng béo khoảng 3.9%. Thông thường, chất béo chiếm khoảng 2,5 đến 6,0% thành phần sữa, tùy thuộc vào giống bò và chế độ dinh dưỡng. Mỡ sữa tồn tại dưới dạng hạt nhỏ lơ lửng trong nước sữa. Trong thành phần chất béo của sữa có tới 20 loại acid béo khác nhau, trong đó 2/3 là acid béo no và còn lại là acid béo chưa no. Trong số những acid béo trong sữa có khá nhiều acid béo dễ hòa tan trong nước (ví dụ acid caproic). Chất béo của sữa cũng dễ xảy ra những quá trình phân hủy làm thay đổi thành phần và tính chất như quá trình thủy phân, quá trình oxy hóa,… làm giảm dần chất lượng của sữa và nhiều khi làm hỏng sữa. Ngoài chất béo thuộc nhóm lipid của sữa còn có phospholipide và một số chất khác nhưng hàm lượng không nhiều, phospholipide có khoảng 0.5-0.7g trong một lít sữa, trong đó chủ yếu là lexitin. Bảng 2.2. Thành phần chất béo có trong sữa bò Thành phần Hàm lượng (% so với tổng khối lượng chất béo) Ghi chú Lypid đơn giản triglyceride Diglyceride Monoglycerride Cholesteride Ceride 98,5 95-96 2-3 0,1 0,03 0,02 Ester của acid béo và cholesterol Ester của acid béo và rượu cao phân tử 5 2.1.4. Chất khoáng Hàm lượng chất khoáng trong sữa dao động từ 8-10g/l, các chất khoáng trong sữa dạng hòa tan hoặc dung dịch dạng keo dễ bị phá vỡ bởi nhiệt độ và pH các muối trong sữa đều ở dạng dễ đồng hóa. Các nguyên tố chiếm hàm lượng cao nhất là Ca, P, Mg, K, Các nguyên tố khác như K, Na, Cl đóng vai trò là chất điện ly. Và Zn, Al, I, Cu, Mn, Ag… chúng cần thiết cho quá trình dinh dưỡng của con người