Đề tài Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi

TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA – ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA TP.HCM KHOA KYÕ THUAÄT HOÙA HOÏC BOÄ MOÂN COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM Baùo caùo moân Coâng ngheä leân men thöïc phaåm Ñeà taøi TINH SAÏCH ENZYME LACTASE TÖØ CANH TRÖÔØNG NAÁM SÔÏI GVHD: PGS.TS. LEÂ VAÊN VIEÄT MAÃN Nhoùm thöïc hieän: 1.Traàn Thò Nguyeät Minh MSSV: 60701493 2.Nguyeãn Hoaøng Phong MSSV: 60701792 3.Ñoaøn Thò Nhö Quyønh MSSV: 60702001 4.Buøi Thò Kim Thy MSSV: 60702437 Lôùp : HC07TP2 Nhoùm: 01-B Thaùng 05 naêm 2010 Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 2 MỤC LỤC Trang 1. SƠ LƯỢC VỀ ENZYME LACTASE VÀ THU NHẬN ENZYME LACTASE TỪ CANH TRƯỜNG NẤM SỢI ............................................................................................................ 6 2. NGUYÊN LIỆU ............................................................................................................................ 8 2.1 Nguyên liệu chính.................................................................................................................. 8 2.2 Nguyên liệu phụ..................................................................................................................... 8 3. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ ........................................................................................................ 9 3.1 Sơ đồ khối .............................................................................................................................. 9 3.2 Sơ đồ thiết bi ........................................................................................................................ 10 4. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ .......................................................................... 12 4.1 Nghiền .................................................................................................................................. 12 4.2 Trích ly ................................................................................................................................. 14 4.3 Ly tâm .................................................................................................................................. 17 4.4 Siêu loc ................................................................................................................................. 21 4.5 Làm lạnh .............................................................................................................................. 25 4.6 Tủa enzyme .......................................................................................................................... 27 4.7 Ly tâm lạnh .......................................................................................................................... 30 4.8 Hòa tan tủa ........................................................................................................................... 31 4.9 Sắc ký trao đổi ion ............................................................................................................... 32 4.10 Lọc nano ............................................................................................................................... 37 4.11 Sấy thăng hoa ....................................................................................................................... 39 4.12 Phối trộn ............................................................................................................................... 44 4.13 Đóng gói ............................................................................................................................... 45 5. SẢN PHẨM ENZYME LACTASE TỪ CANH TRƯỜNG NẤM SỢI ............................ 46 5.1 Đặc điểm sản phẩm ............................................................................................................. 46 5.2 Yêu cầu về chất lượng sản phẩm ........................................................................................ 47 6. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ .................................................................................................. 48 6.1 Cải tiến giống ....................................................................................................................... 48 6.2 Hoàn thiện phương pháp thu nhận, tinh sạch trong quy mô công nghiệp ....................... 48 Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 3 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................... 49 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1 Các loại màng membrane thường dùng trong siêu lọc …………………….….. 21 Bảng 2 Các thông số hoạt động của màng …………………….……………………….. 21 Bảng 3 Lượng muối hạt (NH4)2SO4 thêm vào để đạt nồng độ bão hòa cần thiết cho 1lít dung dịch ở 0o C …………………….……… ……………………………. 28 Bảng 4 Tiêu chuẩn vật lý và hóa học của chế phẩm enzyme ………………………….. 46 Bảng 5 Chỉ tiêu vi sinh của chế phẩm enzyme …………………….…………………… 46 Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 4 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1 Cân bằng vật chất trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật ……………… 7 Hình 2 Sơ đồ khối quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger ……………………………… ………………………………... 8 Hình 3 Sơ đồ thiết bị quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger …………………………… ………………………........... 9 Hình 4 Nguyên lý hoạt động máy nghiền trục ………………………………………... 12 Hình 5 Thiết bị nghiền trục …………………………………………………………… 13 Hình 6 Thiết bị trích ly kiểu vít tải ……………………………………………………... 15 Hình 7 Thiết bị ly tâm liên tục dạng đĩa ……………………………………………….. 19 Hình 8 Thiết bị phân riêng bằng membrane: mô hình ống …………………………… 23 Hình 9 Thiết bị siêu lọc ………………………………………………………………... 24 Hình 10 Nguyên lý hoạt động thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống ……………………. 26 Hình 11 Thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống ……………………………………… 26 Hình 12 Sự phụ thuộc của điện tích protein vào pH của dung dịch ……………………. 33 Hình 13 Thiết bị trao đổi ion ……………………………………………………………. 35 Hình 14 Sơ đồ nguyên lý của thiết bị trao đổi ion ……………………………………... 36 Hình 15 Thiết bị lọc nano ……………………………………………………………….. 37 Hình 16 Các phương pháp gia nhiệt nguyên liệu trong buồng sấy thăng hoa …………. 40 Hình 17 Sơ đồ nguyên lý thiết thiết bị sấy thăng hoa hoạt động tuần hoàn …………. 41 Hình 18 Thiết bị sấy thăng hoa ………………………………………………………... 42 Hình 19 Thiết bị trộn ……………………………………………………………………. 44 Hình 20 Sản phẩm chế phẩm enzyme lactase …………………………………………… 45 Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 5 MỞ ĐẦU Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Thực tế đa có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đa được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử". Theo thời gian, enzym công nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzym ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulase, ligase, amylase,… và một số enzym đặc biêt khác đã thu được rất nhiều lợi nhuận từ ngành này.Công nghệ enzyme được bắt đầu từ giai đoạn sản xuất chế phẩm thô kết thúc ở giai đoạn tạo thành chế phẩm tinh khiết.Bắt đầu từ chế phẩm enzyme thô, người ta tiến hành tinh sạch enzyme bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Khối lượng chế phẩm enzyme sẽ được giảm dần qua từng bước tinh sạch. Chế phẩm enzyme thô thường chứa những thành phần cơ bản sau: +Nước chiếm khối lượng lớn nhất +Protein không có hoạt tính sinh học +Các tạp chất từ môi trường nuôi cấy +Enzyme Như vậy quá trình tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ ba phần đầu,chỉ thu nhận sản phẩm cuối cùng là enzyme. Việc loại ba thành phần đầu không thể thực hiện trong một giai đoạn mà phải thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn, ta sẽ loại bỏ được một phần không phải là enzyme ra khỏi hỗn hợp. Khi các thành phần khác không phải là enzyme được loại dần ra, khối lượng chế phẩm sẽ giảm theo. Nếu enzyme được tinh sạch theo những bước kỹ thuật khác nhau sẽ thu nhận những giá trị quan trọng sau: -Giảm được khối lượng. Trị số này có ý nghĩa cho việc đóng gói bao bì, vận chuyển, sử dụng, bảo quản. -Tăng được hoạt tính enzyme có ý nghĩa rất lớn trong quá trình sử dụng sau này. -Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm. Trong đề tài này, ta đi vào tìm hiểu quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Asperillus niger (canh trường rắn). Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 6 1. SƠ LƯỢC VỀ ENZYME LACTASE VÀ THU NHẬN ENZYME LACTASE TỪ CANH TRƯỜNG NẤM SỢI 1.1 Sơ lược về enzyme lactase Lactase (LCT), là một enzyme thuộc nhóm β-galactosidase, là một hydrolase glycoside tham gia vào các thủy phân của disaccharide lactose thành galactose và glucose. Lactase là một enzyme cần thiết cho tiêu hóa ( thủy phân ) đường lactose trong sữa. Thiếu enzyme lactase sẽ dẫn đến hiện tượng cơ thể không dung nạp được lactose. Lactase thương mại được sản xuất có thể được chiết xuất từ nấm men như Kluyveromyces fragilis và Kluyveromyces lactis và từ nấm sợi, chẳng hạn như Aspergillus niger và Aspergillus oryzae. Nó được sử dụng chủ yếu để phá vỡ lactose trong sữa làm cho sữa thích hợp cho những người không dung nạp được lactose. Tuy nhiên, Thực phẩm và Dược Hoa Kỳ (FDA) đã không chính thức đánh giá hiệu quả của các sản phẩm này. Lactase cũng được sử dụng trong sản xuất kem. Bởi vì glucose và galactose có độ ngọt cao hơn so với lactose, lactose tạo ra một hương vị dễ chịu hơn. Lactose cũng kết tinh ở nhiệt độ thấp của kem, tuy nhiên, sản phẩm thành phần của nó, glucose và galactose, vẫn còn bị giải thể và đóng góp cho một cấu trúc mịn hơn. Lactase được sử dụng trong việc chuyển đổi whey thành sirup. Các nhà sản xuất kem, sữa chua và món tráng miệng đông lạnh sử dụng lactase để cải thiện độ mịn, vị ngọt, và khả năng tiêu hóa, và giảm kích thước tinh thể lactose trong nguyên liệu. Thưc tế cho thấy, phô mai sản xuất từ sữa đã thủy phân có hiệu suất cao hơn so với phô mai sản xuất từ sữa bình thường. Đặc tính của enzyme lactase: Các đặc tính của enzyme này phụ thuộc vào nguồn của nó. Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme khác nhau với các loại chế phẩm cụ thể. Cố định của các enzym, phương pháp cố định, và loại chất mang sử dụng cũng có thể ảnh hưởng đến các giá trị này. Nhìn chung, lactase đi từ nấm sợi có pH tối ưu trong khoảng 2,5-4,5, lactase đi từ vi khuẩn và nấm men có pH trung tính tương ứng là 6-7 ; 6,5-7,5. Sự khác nhau về pH tối ưu của lactases làm cho chúng phù hợp với nhiều ứng dụng, ví dụ lactases từ nấm mốc được sử dụng để thủy phân whey acid, trong khi lactase đi từ vi khuẩn và nấm men phù hợp với sữa (pH 6,6) và whey ngọt (pH 6,1) thủy phân. Tuy nhiên,ứng với những cơ chất khác nhau thì pH của enzyme cũng thay đổi như đối với cơ chất o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) là 4,5 và với cơ chất lactose là 4,8. Đối với enzyme lactase thu nhận từ nấm sợi thì pH sẽ dao động trong khoảng từ 3,0-5,0 và khoảng nhiệt độ tối ưu của nó cũng dao động từ 50-550C. Về vấn đề ức chế sản phẩm, ví dụ như ức chế bởi galactose, đây là một đặc tính phụ thuộc vào nguồn gốc của lactase. Các enzyme từ Aspergillus niger bị ức chế mạnh mẽ bởi galactose hơn từ Aspergillus oryzae. Sự ức chế này có thể được khắc phục bằng cách thủy phân lactose ở nồng độ thấp bằng cách sử dụng các hệ thống cố định enzyme hoặc bằng cách phục hồi các enzyme thủy phân -sử dụng siêu lọc hàng loạt. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 7 1.2 Quá trình nuôi cấy nấm sợi trên môi trường rắn Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc. Trong trường hợp này, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật. Vi sinh vật không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% khối lượng là hợp lý. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: -Nhiệt độ tăng rất chậm. -Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. -Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. -Khối môi trường còn rời rạc. -Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 30oC vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường. -Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường. -Môi trường được kết lại khá chặt -Độ ẩm môi trường giảm dần -Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC. -Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. -Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, nên trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cần duy trì trong khoảng 29-30oC là tốt nhất. Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau: -Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. -Nhiệt độ của khối môi trường giảm.Trong giai đoạn này cần xác định thời điểm kết thúc quá trình nuôi cấy. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 8 1.3 Thu nhận canh trường sau lên men Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước trong môi trường). + + + Hình 1– Cân bằng vật chất trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Canh trường sau lên men (canh trường rắn) của nấm sợi Aspergillus niger chứa:  Sản phẩm trao đổi chất ngoại bào gồm có: +Sản phẩm trao đổi chất bậc I chủ yếu là glucose, ߚ-D-galactose, … +Enzym lactase +Protein phi enzyme  Cơ chất sót: chất độn của môi trường nuôi cấy, lactose, pepton, K2HPO4, MgSO4.7H2O, (NH4)H2PO4, CaCl2,…  Sinh khối nấm sợi Aspergillus niger. Trong những phần tiếp theo bên dưới ta đi vào quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger (canh trường rắn sau lên men) 2. NGUYÊN LIỆU 2.1 Nguyên liệu chính Canh trường sau lên men của nấm sợi Aspergillus niger, canh trường rắn (nuôi cấy bề mặt). 2.2 Nguyên liệu phụ Nước Muối (NH4)2SO4 Chất độn maltodextrin hoặc tinh bột biến tính Các phụ gia khác Cơ chất Giống VSV Sinh khối vi sinh vật Sản phẩm trao đổi chất Cơ chất sót Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 9 3. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 3.1 Sơ đồ khối Hình 2- Sơ đồ khối quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger Canh trường rắn sau lên men Nghiền thô Trích ly Ly tâm Siêu loc Làm lạnh Tủa Ly tâm lạnh Hòa tan tủa Sắc ký trao đổi ion Lọc nano Sấy thăng hoa Phối trộn Đóng gói Chế phẩm enzyme lactase Bã Nước Muối (NH4)2SO4 Dung dịch đệm Chất độn, phụ gia Bao bì Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 10 3.2 Sơ đồ thiết bi Hình 3- Sơ đồ thiết bị quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 11 Chú thích: Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 12 4. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 4.1 Nghiền Nghiền là quá trình biến các chất rắn thành những chất nhỏ hơn dưới tác dụng của va đập, nén vỡ, chà xát, chia cắt và các yếu tố khác. Ở đây, ta tiến hành nghiền sơ bộ canh trường nấm mốc sau lên men để trích ly enzyme lactase là enzyme ngoại bào nên chỉ nghiền sơ bộ, hạn chế sự phá vỡ tế bào nấm sợi và sự hòa tan của các thành phần tạp khác vào trong canh trường sau khi nghiền như protein phi enzyme, oligosaccharide, … (vì nếu có nhiều thành phần tạp lẫn vào canh trường thì việc tinh sạch sẽ càng khó khăn và tốn kém chi phí). 4.1.1 Mục đích công nghệ: Chuẩn bị: trong quá trình nghiền, kích thước nguyên liệu sẽ giảm, diện tích bề mặt riêng tăng lên; từ đó làm tăng hiệu quả truyền khối (tăng tốc độ và hiệu quả trích ly). Do đó, quá trình nghiền ở đây có mục đích là chuẩn bị cho quá trình trích ly diễn ra tốt hơn, hiệu quả hơn. 4.1.2 Các biến đổi của nguyên liệu: Vật lý : biến đổi vật lý là biến đổi chủ yếu trong quá trình nghiền, kích thước nguyên liệu sẽ giảm, diện tích bề mặt riêng tăng lên. Các biến đổi hóa học, hóa lý và hóa sinh : không đáng kể (Do nghiền ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ của nguyên liệu không tăng nhiều trong quá trình nghiền). Sinh học: khi nghiền vật liệu, dưới tác dụng của lực cơ học, vi sinh vật có thể bị tiêu diệt một phần, nhưng mức độ không đáng kể. Sau khi nghiền, diện tích bề mặt tăng lên, mật độ vi sinh vật tăng lên. Các thành phần dinh dưỡng giải phóng một phần, có thể làm vi sinh vật phát triển mạnh hơn. 4.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng: + Cấu trúc nguyên liệu: yếu tố này quyết định đến lực cơ học tác động lên nguyên liệu. Ở đây với nguyên liệu là canh trường rắn ta chọn lực tác dụng là lực nén. + Độ cứng nguyên liệu: ảnh hưởng đến thông số của máy nghiền về công suất và tốc độ quay của máy nghiền. + Kích thước nguyên liệu: là yếu tố đầu tiên để tính toán, lựa chọn thiết bị nghiền. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 13 4.1.4 Thông số quá trình: +Lực tác dụng lên nguyên liệu: hiệu chỉnh tùy thuộc vào cấu tạo và loại thiết bị. +Kích thước hạt đầu ra: 5-7 mm +Nhiệt độ: 25oC 4.1.5 Thiết bị Việc chọn máy nghiền phụ thuộc vào đặc tính của vật liệu nghiền, vào yêu cầu sản phẩm nhận được và vào năng suất sản xuất. Như khi nghiền các chủng nuôi cấy trên bề mặt trên dây chuyền sản xuất enzim không cho phép ứng suất cơ học phá huỷ cấu trúc của enzim, không cho phép tăng nhiệt độ vật liệu. Độ đồng nhất và mức độ nghiền có ảnh hưởng lớn đến sự thu nhận enzim từ canh trường nấm mốc được nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt. Khi trị số của các hạt đạt được từ 5 ÷ 7 mm thì quá trình khuếch tán enzim sẽ là tối ưu. Giảm kích thước của các tiểu phần sẽ làm tăng sức cản thuỷ lực trong các thiết bị khuếch tán. Tăng kích thước các tiểu phần canh trường sẽ làm chậm tốc độ khuếch tán của enzim. Để nghiền canh trường nấm mốc ta có thể chọn một trong các loại máy nghiền sau: máy nghiền búa, nghiền vít, máy tán, nghiền trục, nghiền rung ,… Ở đây, ta chọn máy nghiền trục. Thiết bị có bộ phận chính là hai trục răng. Khi thiết bị hoạt động, hai trục răng sẽ quay ngược chiều nhau,nguyên liệu được nạp từ trên xuống. Dưới tác dụng ép và chà xát làm giảm kích thước nguyên liệu. Sau đó, nguyên liệu chui qua trụ