Đề tài Tổng quan tài liệu về Biosensor

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA BIOSENSOR Năm 1956, giáo sư Leland Clark Jnr – người khai sinh về khái niệm điện cực sinh học (Biosensor) đã có công bố về điện cực Oxy. Dựa trên kinh nghiệm và tâm huyết của mình, ông đã phát triển lĩnh vực phân tích giúp có thể đo lường được trong cơ thể. Năm 1962, tại Hội nghị Khoa học ở Viện hàn lâm New York, ông đã có bài diễn thuyết: “Làm thế nào để các điện cực điện hóa (phương pháp pH, cực phổ, phép đo điện thế, phép đo độ dẫn điện) thông minh hơn”. Trong đó, ông trình bày cách làm điện cực điện hóa thông minh hơn bằng cách thêm enzym vào máy chuyển đổi như những chiếc bánh sandwich được bao bọc bởi một lớp màng. Năm 1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực với sự công bố của công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) về máy phân tích glucose dựa trên việc đo dòng điện của hydro peroxide. Đây là lần đầu tiên các phòng thí nghiệm trên thế giới phân tích dựa trên một Biosensor. Cũng vào năm này, Biosensor tiến thêm một bước mới là khi Divis đề xuất rằng vi khuẩn có thể được dùng như một yếu tố sinh học trong điện cực vi khuẩn để đo hàm lượng rượu. Năm 1976, La Roche (Thụy Sĩ) giới thiệu máy phân tích Lactat (Lactate Analyser – LA640) trong đó sử dụng tác nhân trung gian hexacyanoferrat hòa tan để chuyển các electron từ lactatdehydrogenase tới một điện cực. Mặc dù không thành công trên thương trường nhưng là bước đột phá quan trọng cho một thế hệ của Biosensor được ứng dụng trong thể thao và chẩn đoán lâm sàng. Năm 1987, điện cực enzym screen-printed được công bố bởi Medisense (Cambridge, USA) với dụng cụ đo có kích thước như một chiếc bút cho phép giám sát lượng glucose trong máu tại nhà. Điện cực này được thiết kế lại làm cho thông dụng hơn và số lượng bán của Medisense đã đạt tới 175 triệu đôla năm 1996 khi họ được Abbort mua lại. Hiện nay Hãng Boehringer, Manheim và Bayer đang cạnh tranh nhau rất gay gắt về Biosensor và lượng bán ra của ba công ty chiếm ưu thế trên thị trường Biosensor của thế giới tới 85%. KHÁI NIỆM VỀ BIOSENSOR Biosensor thực chất là một thiết bị phân tích chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu điện. Đầu tiên, Biosensor sẽ nhận dạng hiện tượng và biên dịch thành một đặc tính có thể định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này được chuyển đổi thành một tín hiệu điện bởi một bộ biến năng. Trong Biosensor, hiện tượng được nhận dạng bởi một hệ thống sinh học gọi là cơ quan thụ cảm sinh học (bioreceptor). Hệ thống này sẽ tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích gây ra phản ứng và tạo thành hợp chất nhạy cảm cho Biosensor. Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt đối với chất phân tích. Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo của biosensor Chú thích: Chất xúc tác sinh học (a) chuyển cơ chất (S) thành sản phẩm (P). Bộ biến năng (b) chuyển sản phẩm phản ứng thành tín hiệu điện. Bộ khuếch đại (c) nhằm khuếch đại tín hiệu điện của bộ biến năng. Bộ vi xử lý tín hiệu (d). Màn hình hiển thị (e). ĐẶC ĐIỂM – YÊU CẦU CỦA BIOSENSOR Để định lượng, Biosensor phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả năng lặp lại, khả năng tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính và thời gian đáp ứng tín hiệu tốt. Các phép đo có độ lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự nhau được thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng biosensor trong cùng một mẫu phân tích. Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể đạt được khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai. Tính chọn lọc của biosensor thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơn trong hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụ cảm sinh học và bộ biến năng. Một biosensor có tính chọn lọc cao nếu như thành phần tạp chất của mẫu thấp. Tính nhạy cảm của biosensor thể hiện ở sự thay đổi về lượng thì sẽ gây ra sự thay đổi về tín hiệu trả lời: Da = s Dm Trong đó Da : Độ dao động về biên độ của dòng ra Dm : Độ dao động về biên độ của dòng vào s : Độ nhạy cảm của biosensor, đặc trưng cho mức độ phù hợp của biosensor trong một ứng dụng cụ thể. Đối với Biosensor đo bằng điện thế thì biên độ của tín hiệu trả lời tỷ lệ thuận với logarite của nồng độ chất phân tích. Theo định luật Nernst: Da = s D(logc). Vùng tín hiệu tuyến tính thu được là một đường cong hiệu chỉnh của tín hiệu trả lời với nồng độ khác nhau của chất phân tích. Đường cong chỉ thật sự có ý nghĩa nếu tiến hành hiệu chỉnh cả hai loạt nồng độ tăng và giảm. Đường cong hiệu chỉnh gọi là tốt nếu như tín hiệu trả lời ổn định theo thời gian. Thời gian đáp ứng khá dài bởi bản chất của đường cong hiệu chỉnh, nó cho biết một phương pháp đo cho tín hiệu trả lời nhanh hay chậm khi thay đổi nồng độ. NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BIOSENSOR Các chất cần phân tích trong mẫu phân tích sẽ đi vào trong điện cực. Màng ngoài (external membrane) của biosensor sẽ cho các chất cần phân tích thấm qua. Các thành phần sinh học (enzym, tế bào vi sinh vật, mô, cơ quan) sẽ phản ứng với chất cần phân tích và tạo ra các đáp ứng mà các bộ biến năng (transducer) có thể phát hiện được. Các thành phần sinh học ở đây thực hiện các hoạt động sau: Biến đổi các chất cần phân tích thành các chất hóa học khác thông qua các phản ứng sinh hóa (biểu diễn bằng vòng tròn rỗng trong sơ đồ). Giải phóng ra các sản phẩm hóa học rồi từ đây tạo ra các tác nhân kích thích. Thay đổi các đặc tính như quang học, điện học, cơ học. Tạo ra một số các đáp ứng khác nhau với lượng có thể đo được. Còn có một số màng khác gần bộ phận transducer, những màng này có thể có các đặc tính thấm khác nhau so với màng bên ngoài. Tín hiệu ra của điện cực thường phụ thuộc vào loại biến năng mà nó sử dụng. Hình 1.2: Nguyên lý hoạt động chung của một Biosensor: - Chất cần phân tích - Tác nhân kích thích (chất tạo ra tín hiệu) Bảng 1.1: Một số điện cực enzym thường sử dụng Điện cực để xác định Enzym Sản phẩm Glucose Glucooxydase và catalase H2O2, O2 Saccarose Invertase, glucooxydase H2O2 Lactose b-galactosidase, glucooxydase H2O2 Rượu Alcoloxydase H2O2 Ure Urease NH4+, CO2 Pennicillin Pennicillinase H+ CHƯƠNG 2 PHÂN LOẠI BIOSENSOR Điện cực điện hóa (Electrochemical biosensor) Điện cực đo điện thế (potentiometric biosensor) Điện cực đo điện thế hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự khác nhau về điện thế giữa điện cực đo (probe electrode) và điện cực so sánh (reference electrode) (là điện cực có điện thế không đổi). Sự khác nhau về điện thế giữa hai điện cực là hàm của hoạt độ các ion trong dung dịch điện phân nơ đặt điện cực (điều kiện hoạt động của điện cực đo điện thế là không có dòng điện trong mạch đo, vì thế người ta gọi nó là điện cực có dòng điện bằng không). Điện thế này được xác định theo phương trình Nerst: Trong đó: Eo: Điện thế oxy hóa-khử tiêu chuẩn; R: Hằng số khí; T: Nhiệt độ tuyệt đối; F: hằng số Faraday; N: số điện tử trao đổi của cơ chất; a1, a2: Hoạt độ trong dung dịch và trong lớp màng điện cực. Điện cực đo (probe electrode): Điện cực đo là điện cực có tham gia phản ứng điện hóa với một trong các cấu tử của cân bằng điện thế. Điện cực đo phải có thế điện cực được thiết lập đủ nhanh và có độ chính xác cao. Trong điện cực điện hóa, điện cực đo thường dùng là điện cực màng và điện cực khí. Điện cực khí: Điện cực được cấu tạo bởi kim loại trơ như Pt, Au…tiếp xúc đồng thời với khí và dung dịch chứa ion tương ứng với khí này. Trên thị trường đã có điện cực khí hydro, điện cực Oxy, điện cực khí clo được sử dụng rộng rãi. Điện cực màng chọn lọc ion: Điện cực màng chọn lọc thông thường là các bán pin có lớp màng phân cách dung dịch cần phân tích với một dung dịch chuẩn ở bên trong. Nguyên tắc hoạt động của điện cực màng là dựa vào sự xuất hiện của một đại lượng điện thế trên bề mặt của màng phân cách chứ không phải do phản ứng điện hóa kèm theo sự vận chuyển ion. Màng có tác dụng thuận nghịch với một ion hay một nhóm ion trong dung dịch một cách chọn lọc. Điện cực thủy tinh là điện cực điển hình của loại điện cực màng này. Tất cả các loại điện cực màng đều phải đáp ứng các yêu cầu bắt buộc sau đây: Màng phải không được tan trong dung dịch cần phân tích. Để đáp ứng được điều này, màng phải được cấu tạo từ những chất có phân tử lượng lớn như thủy tinh silicate hoặc nhựa polymer. Màng chọn lọc phải có độ dẫn điện. Độ dẫn điện này thường được tạo ra nhờ vào sự dịch chuyển của các ion hóa trị một bên trong màng. Màng hoặc một vài phần tử chứa trong bộ khung của màng phải có khả năng tác dụng chọn lọc với ion cần khảo sát theo nguyên tắc: trao đổi ion, kết tinh hay tạo phức. Hai nguyên tắc đầu phổ biến hơn nguyên tắc thứ ba. Điện cực màng thủy tinh: Đây là loại điện cực màng thông dụng nhất. Điện cực gồm một ống thủy tinh, ở đầu của ống là một bầu tròn cấu tạo bằng thủy tinh mỏng (0.06-0.10mm). Đây chính là lớp màng thủy tinh có thành phần xác định và có khả năng trao đổi chọn lọc với proton và các cation khác. Điện cực màng thủy tinh đo pH: Phổ biến nhất là thủy tinh chứa 22%Na2O, 6%CaO và 72%SiO2 có khả năng trao đổi chọn lọc ion H+ đến pH xấp xỉ 9. Ở pH cao hơn, lớp màng thủy tinh trở nên kém chọn lọc với H+ vì có thể trao đổi với Na+ cũng như các cation hóa trị I khác. Ngày nay người ta đã sử dụng loại thủy tinh trong đo Na+ và Ca2+ được thay thế bởi Li+ và Ba2+ có khả năng xác định chọn lọc H+ ở pH cao hơn. Phần cuối của điện cực là một bầu thủy tinh có thành mỏng và có thành phần đặc biệt. Bên trong bầu thủy tinh chứa dung dịch H+ có nồng độ xác định. Nhúng vào dung dịch H+ là dây dẫn Pt hay kim loại Ag phủ AgCl. Toàn bộ bộ phận trên được đặt trong ống bảo vệ. Khi nhúng điện cực thủy tinh vào dung dịch chứa ion H+, ở hai bề mặt của màng thủy tinh tiếp xúc với H+ có phản ứng trao đổi: nghĩa là ở hai mặt của lớp thủy tinh sẽ tạo ra hai lớp “gel” H2SiO3 (dày 10-4-10-5 mm) do sự hiện điện của H+ trong thủy tinh. Vì có hiện tượng trao đổi ion xảy ra ở hai mặt của màng thủy tinh nên mỗi lớp gel sẽ xuất hiện một điện thế có giá trị phụ thuộc vào hoạt độ của H+ trong dung dịch và hoạt độ của H+ trong lớp gel. Hay nói cách khác, hiệu thế màng E qua lớp thủy tinh sẽ phụ thuộc vào hoạt độ của H+ bên trong bầu, của H + ở ngoài bầu và hoạt độ H+ ở trong hai lớp gel. Với giả sử rằng hiện tượng trao đổi ion xảy ra ở hai mặt thủy tinh gần giống nhau và do cố định hoạt độ H + ở trong bầu thủy tinh nên hiệu thế màng E chỉ phụ thuộc vào hoạt độ của H+ trong dung dịch cần khảo sát. Bằng việc thay thế thành phần của thủy tinh sao cho điện thế màng không phụ thuộc vào giá trị pH, thường sử dụng Al2O3 và B2O3 ta có thể tạo ra các điện cực màng thủy tinh dùng xác định các cation hóa trị I như Na+, K+, NH4+… Đầu dò khí: Đầu dò khí là các thiết bị đo có tính chọn lọc và độ nhạy cao dùng để xác định các khí hòa tan hoặc các ion có thể chuyển thành khí hòa tan khi điều chỉnh pH của môi trường. Bộ phận chính của đầu dò khí là một lớp màng xốp mỏng được lắp vào phần cuối của đầu dò và có thể được thay thế một cách dễ dàng. Tấm màng này được gọi là màng thấm khí, được chế tạo từ các polymer chịu nước như polytetrafluoroethylene hoặc polypropylene với độ xốp khoảng 70% (kích thước lỗ xốp nhỏ hơn 1mm). Lớp màng này sẽ phân tách dung dịch cần phân tích với dung dịch NaHCO3 và NaCl (nếu thiết bị dùng để đo CO2 hòa tan). Điện cực chuẩn: Trong hầu hết các ứng dụng điện hóa, ngoài điện cực đo ta phải sử dụng thêm một điện cực có điện thế xác định và không đổi. Điện cực này được gọi là điện cực chuẩn hay điện cực so sánh. Điện cực chuẩn phải không tham gia phản ứng với bất kỳ thành phần nào trong dung dịch cần khảo sát, phải thuận nghịch và tuân theo phương trình Nerst, phải có điện thế không đổi theo thời gian và có thể lấy lại giá trị thế ban đầu sau khi có dòng điện nhỏ chạy qua… Điện cực chuẩn thường là điện cực kim loại loại hai (kim loại M phủ một lớp hợp chất ít tan MA của kim loại đó và được nhúng vào trong dung dịch muối có chứa anion A có nồng độ xác định). Điện cực calomel: Điện cực calomel được tạo thành bởi kim loại Hg tiếp xúc với dung dịch chứa muối Hg2Cl2 bão hòa và KCl có nồng độ xác định (bão hòa hay 1M). Điện cực Ag/AgCl: Ngày nay điện cực Ag/AgCl được sử dụng rộng rãi để làm điện cực chuẩn thay cho điện cực calomel. Nồng độ dung dịch KCl sử dụng là bão hòa hay 3.5M Các điện cực chuẩn thường có một lỗ nhỏ ở gần đầu phía trên. Lỗ này thường có một nút đậy kín khi không sử dụng để chống lại sự bay hơi của dung dịch phía trong. Hình 2.1: Cấu tạo của một biosensor đo điện thế đơn giản Chú thích: a) Màng bán thấm b) Thành phần sinh học c) Màng thủy tinh d) Điện cực thủy tinh đo pH e) Điện thế giữa điện cực đo và điện cực so sánh g) Dung dịch HCl f) Điện cực đo Ag/AgCl h) Điện cực so sánh Ứng dụng: Điện cực đo điện thế được dùng để xác định glucose với sự cố định enzym glucooxydase lên điện cực: Đo lượng H+ tạo thành (đo pH sau khi giải phóng H+) sẽ xác định hàm lượng D -glucose. Xác định Ure với sự có mặt của enzym Urease: Chú thích: c – Cáp bảo vệ e – Dung dịch điện phân m – màng kỵ nước r – điện cực so sánh Hình 2.2: Cấu tạo điện cực pCO2 Xác định lysin: Điện cực đo dòng điện (Amperometric biosensor) Điện cực đo dòng điện hoạt động dựa vào dòng điện chạy qua mạch đo khi đặt một hiệu điện thế giữa hai điện cực (điện cực đo và điện cực so sánh). Mật độ của các hạt tích điện tỷ lệ thuận với cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực. Cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực là hàm của mật độ các hạt tích điện trong dung dịch và điện thế đặt giữa hai điện cực. Trong đa số trường hợp, người ta thường tiến hành oxy hóa hoặc khử một loại hạt tích điện trên cực đo. Nếu đặt vào điện cực đo một điện thế E biến thiên so với điện cực so sánh và vẽ đường cong I = f(E), chiều cao I của bậc giới hạn khuếch tán sẽ tỷ lệ với nồng độ của hạt bị oxy hóa hoặc bị khử trên điện cực đo. Hình 2.3: Đồ thị I = f(E) Chú thích: 1- E quá nhỏ để sự oxy hóa có thể xảy ra 2- vận tốc oxy hóa điện hóa và cường độ dòng điện sẽ tăng cường với sự tăng hiệu điện thế 3- cường độ không phụ thuộc vào hiệu điện thế và I = K.Cred Hiện nay các điện cực đo dòng điện đang được sử dụng rộng rãi là điện cực oxy và điện cực hydroperoxyde. Oxy và hydroperoxyde (H2O2) đều là những chất được sinh ra trong một số phản ứng có enzym xúc tác, cũng như trong phản ứng có các chất trung gian oxy hóa-khử nhân tạo: ferrocyanua, ion N-metyl-phenazini (NMP) và benzoqiunon và chúng có thể xác định nhờ đo dòng điện. Các điện cực đo dòng điện thường sử dụng các enzym oxydoreductase để gắn vào màng. Oxy, NAD+, NADP+ được dùng như chất nhận điện tử để phục hồi enzym sau khi tham gia phản ứng xúc tác cơ chất. Các enzym sử dụng Oxy như oxydase và enzym sử dụng NAD+, NADP+ được gọi là dehydrogenase hay reductase. Trong hai nhóm enzym này thì oxydase được dùng nhiều nhất. Các điện cực đo dòng điện được sử dụng để xác định các cơ chất của enzym như glucose, monosacharide, hypoxanthyl, lactate, acid amin, sulfite, salicylate, oxalate và pyruvate. Điện cực enzym để đo nồng độ glucose có cấu tạo gồm: một anod Pt và một catod Ag phủ AgCl tiếp xúc với màng đã cố định glucoseoxydase (GOD). Cả hai đều được đặt trong dung dịch điện phân KCL. Điện áp phân cực 0.68 Volt được đặt vào giữa hai điện cực. Dưới tác động của điện áp phân cực này H2O2 được giải phóng ra sẽ bị oxy hóa ở mặt phân cách giữa anod và màng theo phản ứng: Dòng điện đo được tỷ lệ với lượng H2O2 bị oxy hóa và do đó tỷ lệ với lượng glucose trong môi trường cần đo. Hình 2.4: Sơ đồ nguyên tắc của điện cực đo dòng điện Cũng như đo glucose, để đo lượng lactate, dùng điện cực có gắn lactatoxydase (LOD) từ Pediscoccuspecies xúc tác phản ứng: Để đo lượng cholesterol thì gắn enzym cholesteroloxydase (ChOD) từ Rhodococcus eryththropolis, xúc tác phản ứng: Để đo lượng lactose thì gắn enzym b-galactosidase (b-GAL) từ E.coli và glucoozydase (GOD) từ A.niger, xúc tác các phản ứng: Do quá trình chuyển khối H2O2 đến điện cực anod mà vận tốc phản ứng ở anod thường bị giới hạn. Khi đó, cường độ dòng điện ở anod tỷ lệ thuận với nồng độ H2O2 trong môi trường tiếp xúc với anod. Cũng có thể xác định lượng glucose qua đo nồng độ Oxy hòa tan trong dung dịch nhờ điện cực Oxy hay điện cực Clark, có cấu tạo gồm: hai điện cực có khả năng phân cực, một catod bằng Pt và một anod bằng Ag phủ AgCl. Cả hai điện cực được đặt vào chất điện phân là KCl. Hệ thống điện cực này được ngăn cách với môi trường nghiên cứu bằng một màng thấm khí kỵ nước bằng teflon hay polypropylen) cho Oxy thấm qua. Dưới tác dụng của điện áp phân cực 0.65V đặt vào giữa hai điện cực, Oxy khuếch tán qua màng sẽ bị khử tại catod theo phản ứng: O2 + 4e- + 4H+ 2H2O Hình 2.5: Cấu tạo của điện cực Oxy xác định nồng độ Glucose Dòng điện chạy giữa hai điện cực do phản ứng điện hóa tỷ lệ với lượng O2 bị khử và do đó tỷ lệ với lượng O2 và lượng glucose. Dòng điện được đo sau khi khuếch đại và được chỉ thị trực tiếp bằng số hoặc biểu diễn dưới dạng nồng độ Oxy hay áp suất riêng phần của Oxy. Phương pháp đo dòng điện này có những đặc điểm sau: Phản ứng Enzym sẽ phụ thuộc vào vận tốc khuếch tán của cơ chất qua màng Khi phản ứng oxy hóa – khử xảy ra, gradient nồng độ của cơ chất giảm dần, do đó vận tốc chuyển khối chậm và có thể dòng điện bị khử, để duy trì dòng điện không đổi cần phải giữ vững vùng tiếp xúc càng nhỏ càng tốt (tức là cần điều chế các vi điện cực có đường kính rất nhỏ, đến vài mm). Vận tốc phản ứng oxy hóa – khử phụ thuộc vào nồng độ Oxy hòa tan. Để hạn chế ảnh hưởng của nồng độ Oxy hòa tan trong du