Đề tài Tổng quan về các vi sinh vật chỉ thị và các biện pháp kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU Đặc vấn đề: Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề được quan tâm ngày càng sâu sắc trên phậm vi mỗi quốc gia và quốc tế, bởi vì sự liên quan trực tiếp của nó ảnh hưởng đến sức khỏe và tính mạng con người, sự duy trì nòi giống, cũng như quá trình phân phối kinh tế quốc tế. Gần đây ở trong nước và trên thế giơí càng hối thúc các nhà hoachj định thế giới mạnh tay hơn nữa trong quá trình an toàn vệ sinh thực phẩm. Để đảm bảo cho người tiêu dùng an toàn về vấn đề thực phẩm, thì đầu tiên người tiêu dùng cần đảm bảo vệ sinh cá nhân cho chính bản thân mình. Để góp phần cho việc bảo đảm thực phẩm sạch tốt, việc kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm cũng là điều cần thiết và cấp bách. Việc kiểm tra vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm góp phần giúp cho người tiêu dùng an tâm với các sản phẩm mình chon lựa hơn. Để tìm hiểu vi sinh vật chỉ thị cho thực phẩm và biện pháp kiểm soát vi sinh vật, tôi xin trình bày những nghiên cứu mà mình đã học hỏi và tìm hiểu. Mục đích khóa luận: Đánh giá mức độ nhiễm tạp của vi sinh vật trong thực phẩm, biện pháp kiểm soát mức độ an toàn của vi sinh vật chỉ thị trong thực phẩm. Nội dung khóa luận: Tổng quan các ci sinh vật chỉ thị trong thực phẩm. Phương pháp kiểm tra các vi sinh vật trong thực phẩm và biện pháp kiểm soát. Chương II. TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về vi sinh vật chỉ thị 2.1.1. Khái niệm vi sinh vật chỉ thị Vi sinh vật chỉ thị là những đối tượng sinh vật có yêu cầu nhất định về điều kiện sinh thái liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, hàm lượng oxy, cũng như khả năng chống chịu một hàm lượng nhất định các yếu tố độc hại trong môi trường sống và do đó sự hiện diện của chúng biểu thị một tình trạng về kiều kiện sinh thái của môi trường sống nằm trong giới hạn nhu cầu và khả năng chống chịu của đối tượng sinh vật đó. 2.1.2. Các tiêu chí lựa chọn một vi sinh vật chỉ thị - Chúng có mặt ở hiện tại và dễ phát hiện trong tất cả thực phẩm có chất lượng (hoặc không có chất lượng) để được đánh giá. - Sự tăng trưởng và số lượng của chúng cần phải có xu hướng tiêu cực tương quan với chất lượng. - Chúng cần phải dễ dàng phát hiện, liệt kê và có sự khác biệt rõ ràng với các vi sinh vật khác. - Chúng cần được liệt kê trong một thời gian ngắn, thời gian lý tưởng là trong vòng một ngày. - Sự tăng trưởng của chúng không bị gây ảnh hưởng bất lợi do các thành phần khác của thực phẩm. Bảng 2.1: Mối quan hệ giữa vi sinh vật gây hư hỏng và thực phẩm. Vi sinh vật Sản phẩm Acetobacter spp Bia tươi Bacillus spp Bột bánh mì Byssochlamys spp Trái cây đóng hộp Clostridium spp Pho – mat rắn Flat – bào tử Rau chua đóng hộp Geotrichum spp Trái cây đóng hộp Vi khuẩn acid lactic Bia, rượu vang Lactococcus lactic Sữa Leuconostoc mesenteroides Mía đường (Trong quá trình lọc) Pectinatus cerevisiiphilus Bia “Pseudomonas putrefaciens” Bơ Nấm men Nước ép trái cây Zygosaccharomyces bailii Mayonnaise, salad đóng gói Nhóm vi sinh vật là nguyên nhân của sự hư hỏng, số lượng của nó được nhận biết bằng cách chọn lọc nuôi cấy. Các tổng thể của vi sinh vật đánh giá chất lượng của các sản phẩm, trong bảng 2.1 nêu lên sự tăng trưởng và số lượng của các vi sinh vật trong thực phẩm. 2.1.3. Chỉ thị về an toàn thực phẩm Vi sinh vật chỉ thị nhằm đánh giá mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm và các hệ thống chất lượng. Để đáp ứng các chỉ tiêu quan trọng nó cần các yếu tố sau: Dễ dàng nhận biết và nhanh chóng phát hiện. Dễ phân biệt với các nhóm vsv khác trong thực phẩm. Sự hiện diện của vi sinh vật là tác nhân gây nên mầm bệnh trong thực phẩm. Tỷ lệ nhu cầu tăng trưởng và phát triển của mầm bệnh trong thực phẩm đó. Loại trừ mầm bệnh có mặt trong thực phẩm. Chỉ thị Mầm bệnh Số lượng Thời gian Hình 2.1: Mối quan giữa vi sinh vật chỉ thị và mầm bệnh. Các tiêu chí này áp dụng cho hầu hết các vi sinh vật trong thực phẩm có tác nhân gây bệnh bất kể có nguồn gốc thực phẩm nào. Tuy nhiên tác nhân gây bệnh được quan tâm có nguồn gốc từ đường ruột, để phát hiện sự ô nhiễm phân của nguồn nước và sự hiện diện của tác nhân gây bệnh đường ruột. 2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng Tốc độ hấp thu và bài tiết: Đây là đặc tính quan trọng trong quá trình đánh giá ô nhiễm. Đối với những chất có thể bài tiết nhanh chỉ có thể phát hiện được ở nồng độ cao trong cơ thể sinh vật ngay sau khi chất đó được thải ra môi trường. Đặc điểm sinh lý: Bao gồm quá trình trao đổi chất, lượng mỡ dự trữ, khả năng bắt mồi, khả năng sinh sản… Những sinh vật có quá trình trao đổi chất mạnh hơn (cá) thì có khả năng tích tụ nhanh hơn ngay cả trong điều kiện nguồn thức ăn bị hạn chế. Tuổi và kích thước: Đây là yếu tố ảnh hưởng lớn đến kết quả đánh giá đặc biệt đối với cá. Chúng có mối quan hệ chặc chẽ với các chất tích tụ trong cơ thể. Aûnh hưởng của các chất: + Những enzyme khử độc ảnh hưởng đến sự hấp thụ và bài tiết của các chất. + Sự thay đổi mật độ hấp thụ của các chất. + Sự thay đổi đặc tính bên trong của sinh vật sẽ ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ và bài tiết. + Sự bài tiết của các chất tạo nên những hợp chất phứt tạp hơn. Sự biến đổi của môi trường: Sự thay đổi nhiệt độ, độ cứng, độ mặn, độ đục… + Nhiệt độ: Không ảnh hưởng đến độ tan của rất nhiều chất mà còn ảnh hưởng đến khả năng tích tụ của sinh vật. + Nước cứng: Làm giảm tính độc của một số kim loại nặng trong môi trường. + Độ mặn và độ đục: Là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến mức độ hấp thụ của các sinh vật, đặc biệt ở những vùng cửa sông. Dinh dưỡng: Một trong số các nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến nồng độ kim loại nặng tích tụ trong cơ thể sinh vật nhất là những sinh vật hấp thụ qua thức ăn. 2.1.5. Ý nghĩa của các vi sinh vật chỉ thị Vi sinh vật chỉ thi vệ sinh thực phẩm có ý nghĩa rất lớn trong việc đánh giá an toàn về vi sinh và chất lượng thực phẩm. a. Vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình Tổng lượng vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình cho biết lượng vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình mà nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm bị nhiễm. Khi đó người quản lý và sản xuất thực phẩm phải kiểm tra lại điều kiện vệ sinh trong sản xuất, điều kiện bảo quản và phân phối. Thực phẩm bị phân hủy trong 1 gam chứa khoảng 106 đến 108 tế bào visinh vật hiếu khí. b. Vi sinh vật kị khí ưa nhiệt độ trung bình Tổng lượng vi sinh vật kị khí ưa nhiệt độ trung bình cho biết khả năng thực phẩm nhiễm Clotridium. c. Vi sinh vật ưa lạnh Tổng lượng vi sinh vật ưa lạnh cho biết trước khoảng thời gian cần thiết để bảo quản lạnh nhằm đảm bảo sự an toàn thực phẩm. 2.1.6. Các vi sinh vật chỉ thị điển hình 2.1.6.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí a. Giới thiệu - Chỉ số này còn có tên gọi khác là: số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm trên đĩa, tổng số vi sinh vật sống. - Chỉ tiêu này được dùng để đánh giá mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm. Từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm. b. Định nghĩa Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử (O2). Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. c. Nguyên tắc - Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30oC/72h ± 6h hoặc 37oC/48h ± 6h. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. 2.1.4.2. Coliform tổng số a. Giới thiệu Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: Số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm. Được xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống hay trong các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. b. Nguồn gốc Vào cuối những năm 1800 khi Von Fritsch được mô tả Klebsiella pneumoniae và Klebsiella rhinoscleromatis như là vi sinh vật đặc trưng được tìm thấy trong phân của con người. (Geldreich 1978) Năm 1885 Percy và Grace Frankland đầu tiên thường xuyên xét nghiệm vi khuẩn trong nước ở London. Robert Koch sử dụng chất keo rắn nấu bằng phương tiện truyền thống để đếm vi khuẩn (Hutchinson và Ridgway 1977). Đầu thập niên 1900 (Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của coliform như là một dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và sau khi sản xuất khí đốt với việc giới thiệu ống Durham (Durham năm 1893) thì khái niệm về vi khuẩn Coliform và các vi khuẩn khác dạng coli được sử dụng ở nước Anh năm 1901. Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩn coliform. Năm 1909 MacConkey công nhận 128 loài khác nhau của vi khuẩn coliform. Đến đầu thập niên 1920, sự khác biệt của các dạng vi khuẩn coli được đem ra sản xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose và Voges – Proskauer nhằm xác định sự ô nhiễm faecal (Hendricks 1978). Năm 1938 Parr có những phát minh lên đến đỉnh điểm trong thử nghiệm IMVIC (Indole, Methyl đỏ, voges – Proskauer và muối của acid Citric). Việc thử nghiệm cho thấy sự khác biệt của các dạng vi khuẩn coliform phân, các dạng vi khuẩn trong đất và trung gian, và nó được sử dụng cho đến ngày hôm nay. c.Đặc điểm Vi khuẩn coliform là những trực khuẩn gram âm, không hình thành bào tử, có phản ứng oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của β - galactosidase. Vi khuẩn này có khả năng phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính ức chế tương tự, có thể lên men lactose (với β-galactosidase) cho việc sản xuất acid và sinh hơi khi ủ ở 35 – 37oC trong vòng 24 - 48 giờ ở 36 ± 2oC. Coliforms gồm 4 chi trong họ Enterrobacteriaceae: Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy, 1991). Chúng thường có mặt trong đường ruột của động vật có vú. (ví dụ: Escherichia coli phổ biến trong đất, trên cơ thể người,…). Chúng bao gồm vi khuẩn lên men lactose như Escherichia cloacae, Citrobacter freundii có thể tìm thấy trong phân và ngoài môi trường (nước giàu chất dinh dưỡng, đất và thực vật) cũng như trong nước uống có nồng độ có các chất dinh dưỡng tương đối cao. Citrobacter freundii Hình 2.2Escherichia cloacae Hình 2.2: Vi khuẩn lên men lactose Coliform chịu nhiệt có khả năng lên men đường lactose ở 44 – 45oC, nó bao gồm Escherichia và loài Kiebsiella, Enterobacter, Citrobacter. Citrobacter Kiebsiella Enterobacter Hình 2.3. Coliform chịu nhiệt lên men đường lactose d. Hiện diện Vi khuẩn coliform hiện diện ở khắp nơi, kể cả trong đất, da, nước sông, nước ao, rau cải,… Sự có mặt của chúng trong nước và rau củ được xem là một chỉ số về sự tinh khiết của nước hay rau. Tuy nhiên chỉ số này cũng không đáng tin cậy.Vì vi khuẩn coliform vẫn có khả năng sống sót trong nước ấm, Sự hiện diện của coliform trong nước không hẳn là nước bị nhiễm phân. Coliform chịu nhiệt xuất hiện từ nơi có nguồn nước giàu chất hữu cơ như nước thải công nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất. Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và lá mơ. Loại rau và vi khuẩn Trước khi rửa Sau khi rửa Giảm Rau ngổ Tổng số vi khuẩn Coliform 3.300.000 89.000 37.000 2.300 99% 97% Lá mơ Tổng số vi khuẩn Coliform 190.000 24.000 160.000 4.800 16% 80% Sự có mặt của coliform trong môi trường chứng tỏ môi trường đó nhiễm bẫn có nguồn gốc từ phân. Bảng 2.3. Chỉ tiêu của coliform trong thực phẩm Tiêu chuẩn Thực phẩm Coliform TCVN5289/92 Cá fillet, tôm, mực 200/g TCVN4381/92 Tôm vỏ đông lạnh TCVN4380/92 Tôm thịt đông lạnh TCVN4546/94 Tôm mũ ni đông lạnh TCVN5835/94 Tôm thịt IQF TCVN2644/93 Mực đông lạnh TCVN5649/92 Hàng khô TCVN5526/91 Mực cá khô tẩm vị 10/g TCVN6175/9 Nước mắm 10/ml Bảng 2.4 Giới hạn cho phép coliform trong thực phẩm Thực phẩm Giới hạn cho phép CFU/g hay CFU/ml thực phẩm Sản phẩm từ thịt: pate, xúc xích,… 50 Sản phẩm chế biến: tôm, cá, mực,… 10 Thủy sản khô sơ chế: Cá khô 102 Trứng 102 Sản phẩm từ trứng 10 Sữa 10 Sản phẩm từ ngũ cốc, xử lý nhiệt trước khi dùng(bột, miến, mì), dùng trực tiếp (bánh bột). 103 10 Nước giải khát không cồn 10 Nước khoáng đóng chai 0 2.1.4.3. Escherichia Coli: a. Giới thiệu: - Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli) là một trong những vi khuẩn sống ký sinh trong đường ruột của động vật. - Vi khuẩn E. coli cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc. Sự có mặt của vi khuẩn trong nước là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân. - Vi khuẩn này được dùng để đánh giá mức độ ô nhiễm phân, bởi vì nó thường tạo khuẩn lạc trên thành ruột và nó không gây nguy hiểm cho sức khỏe. b. Nguồn gốc: - Năm 1885 Escherichia coli được Buchner tìm ra và đến năm 1886 tại Munchen, một bác sĩ nhi khoa tên Theodor Escherich nghiên cứu đầy đủ. E.coli thường sống trong ruột già, trong tiếng LaTinh ruột già là colum. Vì tôn trọng nhà khoa học nên người ta lấy tên ông ghép vào chữ ruột già theo ngữ pháp sở hữu cách tiếng La Tinh nên vi khuẩn này coa tên Escherichia coli. - Vi khuẩn do Escherich phát hiện trong tả lót của trẻ em được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune. 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá. - Năm 1895 người ta lại gọi bằng tên Bacillus coli. - Năm 1896 gọi thành Bacterium coli. - Năm 1991 vi khuẩn được thống nhất toàn cầu là Escherichia coli. c. Phân loại khoa học: - Giới: Bacteria. - Ngành: Proteobacteria. - Lớp: Gamma Proterobacteria. Hình 2.4: Escherichia coli - Bộ: Enterobacteriales. - Họ: Enterobacteriaceae. - Chi: Escherichia. - Loài: E.coli d. Đặc điểm hình thái và phân bố: - Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, được đặc trưng bởi tính chất enzyme β–galctosidase và β-Glucoronidase,là loài trực khuẩn hình que, kích thước (1.1 – 1.5) x (2 - 6)μm, có độ dài 3 μm di chuyển bằng lông và roi, vi khuẩn gram âm và yếm khí tùy tiện. Không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp là 35 – 37oC, pH thích hợp 6.4 – 7.5 (tối ưu nhất là 7.2 – 7.4), sinh sản trong khoảng 5 – 12oC, sinh sản mạnh ở 5oC. Nó phát triển ở nhiệt độ 44 – 45oC trên môi trường tổng hợp, lên men đường lactose và mannital có sinh hơi và sinh acid, sinh endol từ triptophan. - Escherichia coli là một trong số thành viên của nhóm vi khuẩn Coliform được sử dụng để chỉ ra nguồn phân. Chúng được xếp vào loại có tính kháng nguyên, chủ yếu là kháng nguyên loại O và H. Tuy nhiên, chúng không sinh oxidase hoặc thủy phân ure và một số không sinh hơi, có thể phát triển ở 37oC. - Chúng phân bố ở khắp nơi trong môi trường đặc biệt trong thực phẩm, nước và ruột già. e. Đặc điểm sinh hóa và nuôi cấy: - Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ E.coli làm đục nhẹ môi trường, càng để lâu càng đục, có mùi hôi thối, sau vài ngày có nổi váng mỏng trên môi trường. - Trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S có màu xám trắng, tròn, ướt, bề nặt bóng, kích thướt khoảng 2 – 3mm. + Trên môi trường thạch EMB: E.coli cho khuẩn lạc tím ánh kim. + Trên môi trường thạch MacConkey: E.coli cho khuẩn lạc đỏ hồng. + Trên môi trường thạch nghiêng TSI: E.coli tạo acid/acid (vàng/vàng). Để phân biệt E.coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng thử nghiệm IMViC. E.coli cho kết quả IMViC là ++ - - hoặc - + - - f. Yếu tố kháng nguyên: E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phứt tạp, hệ thống phân nhóm này dựa vào việc xác định kháng nguyên bề mặt O,H,K. Ÿ Kháng nguyên thân O: Có bản chất là lipopolysaccharide của màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn. Kháng nguyên O có thể phát hiện bằng phản ứng ngưng kết và giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loại vật chủ. Ÿ Kháng nguyên lông H: Có bản chất là Protein, tạo nên khả năng di động của E.coli, kém chịu nhiệt. Có khoảng 56 type kháng nguyên. Ÿ Kháng nguyên giáp mô K: Sự hiện diện của kháng nguyên K ở vi khuẩn, nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O khi bị nung nóng. Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành 3 type A,L,B và người ta phân loại kháng nguyên này dựa vào tính chất hóa học. Một vài E.coli tiết độc tố ruột có những lông bám, những lông bám này bản chất là protein nên việc sắp xếp chúng vào kháng nguyên K là không phù hợp và sau đó chúng được xếp và kháng nguyên tiêm mao F. Ÿ Kháng nguyên tiêm mao F: Tham gia vào sự di chuyển, ngắn hơn và nhiều hơn flagella, dạng thẳng, xoắn, dài khoảng 4μm, đường kính 2,1 – 7,0nm. Tiêm mao giúp vi khuẩn kết dính vào tế bào niêm mạc nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Ví dụ: E.coli có mã số O157:H7 là vi khuẩn thường gặp nhất. Chúng là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy có máu và gây tổn thương thận ở người. Người bị nhiễm trùng vi khuẩn STEC thường có triệu chứng đau thắt bao tử, tiêu chảy thường có máu và ói mửa. Hình 2.5: E.coli O157:H7 – Việc sử dụng E.coli là một vi sinh vật chỉ thị được giới hạn bởi các yếu tố: + E.coli không phải là một loài vi sinh vật chỉ thị duy nhất. + Nó là một trong số các chi của nhóm Coliform như Proteus và Aerobacter thường được tìm thấy bên ngoài đường ruột của con người. + Các vi sinh vật khác tìm thấy trong nước nhưng không đại diện cho phân ô nhiễm mà chúng có một số đặc điểm giống E.coli. g. Tính chất gây bệnh Khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng lớn kèm theo độc tố của chúng E.coli gây tiêu chảy gồm các n