Đề tài Tổng quan về Collagen và ứng dụng của Collagen

CHƯƠNG 1: COLLAGEN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ COLLAGEN 1.1.1 Khái quát về Collagen [2] Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc. Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 25% - 35% tổng lượng protein trong cơ thể ở các động vật có xương sống. Collagen được phân bố trong các bộ phận như da, cơ, gân, sụn, răng, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các lớp màng liên kết bao quanh các cơ và là thành phần chính của dây chằng và gân,... Khoảng 10% protein trong cơ ở động vật có vú là collagen, các protein ngoại bào (hơn 90% trong gân, xương và khoảng 50% trong da) có chứa collagen. Trong thành phần của da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da, tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như : sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm,... Nó đóng vai trò kết nối tế bào, kích thích quá trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da. Sự suy giảm về số lượng và chất lượng collagen sẽ dẫn đến hậu quả lão hóa của cơ thể mà sự thay đổi trên làn da, khuôn mặt là dấu hiệu dễ nhận biết nhất: làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đường nhăn mảnh trên khóe mắt, khóe miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu, các đường nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảy xệ. Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống và tác động của môi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương , khi đó sợi collagen sẽ mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá hủy. Chính vì vậy mà collagen đóng vai trò là một trong những chất quan trọng hàng đầu của ngành thẩm mỹ, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng... Collagen cũng được phân bố ở giác mạc, và tồn tại dưới dạng tinh thể. Trong mô cơ, collagen chiếm khoảng từ 1% đến 2%. Trong cơ thể người, collagen chiếm từ 20 – 25% protein của cơ thể. Collagen là thành phần chính của mô liên kết, có chức năng tạo độ vững chắc và đàn hồi. Collagen có tác dụng giống như một chất keo liên kết các tế bào lại với nhau để hình thành các mô và cơ quan nền tảng trong cơ thể. Collagen cung cấp cho các mô liên kết những đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiện diện rộng khắp và sự sắp xếp mang tính cấu trúc của nó. Theo quan điểm y sinh, collagen đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hàn gắn vết thương, là thành phần hoạt hoá các tiểu cầu trong máu và sự hình thành mạch. Thêm vào đó sự phát triển của một số bệnh di truyền được xác định là do sự đột biến trong cấu trúc gen của collagen. Những rối loạn trong quá trình tổng hợp hoặc phân giải collagen đều được ghi lại như là nguyên nhân của nhiều căn bệnh phức tạp như chứng viêm khớp, xơ gan, bệnh đái đường và ung thư cũng như những bệnh có liên quan đến sự lão hoá. Collagen phân bố khắp nơi trong cơ thể, từ chỗ gân nối bắp chân với gót chân cho tới giác mạc. Trong gân và dây chằng, collagen có tác dụng truyền lực từ cơ sang xương và tích trữ năng lượng đàn hồi. Chính nhờ tính chất này mà cơ thể có thể di chuyển, vận động một cách nhịp nhàng và uyển chuyển. Collagen còn là chất nền hữu cơ có trong xương và men răng giúp chúng chống lại sự rạn nứt. Nó là thành phần chính trong da, mạch máu, các cơ. Bên cạnh các chức năng cơ học, ở giác mạc, thủy tinh thể, trật tự cấu trúc của các sợi collagen tạo nên sự trong suốt duy trì thị lực. Collagen được xem như một vật liệu mang tính xây dựng. Sự linh hoạt của nó là nhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, tạo nên sự đa dạng trong tính chất nhằm phục vụ những chức năng nhất định. Xét về mặt kinh tế, nguồn nguyên liệu giàu collagen dùng để sản xuất ra gelatine- chất có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: thực phẩm, y học và dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nhiếp ảnh,... 1.1.2 Lịch sử phát triển của Collagen Theo tiếng Hy Lạp, collagen có nghĩa là “người sản xuất keo hồ”, nói đến quá trình nấu da và gân của ngựa cùng những loài động vật khác để thu được hồ. Keo dán collagen đã được người Ai Cập sử dụng cách đây 4000 năm và người Mỹ sử dụng nó cách đây khoảng 1500 năm. Từ hơn 2000 năm trước, con người đã biết sử dụng mô liên kết và sản phẩm của nó trong chế biến thực phẩm để tạo ra các sản phảm dạng gel, các chất dính. Người Ai Cập cổ đại đã sản xuất ra được collagen và những nghiên cứu cho thấy trong những thế kỉ tiếp theo đã thật sự xuất hiện collagen trong các bữa tiệc, ví dụ trong món cá hồi hay bánh hoa quả,... Năm 1682, một người Pháp tên Papin đã công bố một kết quả là đã thu được một hỗn hợp giống jelly từ xương. Từ năm 1700, thuật ngữ collagen trở nên thông dụng. Năm 1754, bài báo đầu tiên trong lĩnh vực chất dính được công nhận ở Anh về việc sản xuất chất dán của một người thợ làm đồ gỗ. Các chất hồ dán tự nhiên được sản xuất trên thành phần cơ bản là collagen và một vài chất khác. Năm 1850, công nghiệp sản xuất collagen xuất hiện tại Mỹ, nguồn nguyên liệu chính lúc này là xương. Năm 1871, một phát hiện quan trọng của bác sĩ người Anh Richard Leach Maddox về ứng dụng của collagen đã đưa đến bước đột phá trong ngành công nghiệp hình ảnh, vị bác sĩ đã cải tiến “dry plate” với một lớp gelatin – bạc bromua và còn nhạy hơn khi so với “wet plate” . Sau đó nghiên cứu của Charles Bennet đã tiếp tục hoàn thiện phương pháp dùng “dry plate”. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là giảm rất nhiều thời gian trong công nghiệp nhiếp ảnh. Cuối thế kỉ 19, khi ngành công nghiệp sản xuất collagen xuất hiện đã làm tăng thêm các ứng dụng của collagen trong các ngành công nghiệp khác và ổn định tính chất sản phẩm. Năm 1930, ngành sản xuất collagen được phát triển mạnh mẽ khi da heo được xem như là một nguồn nguyên liệu thu nhận collagen. Ngành công nghiệp sản xuất collagen ở Châu Âu chỉ mới bắt đầu khoảng những năm 1930 nhưng Châu Âu lại trở thành khu vực sản xuất collagen quan trọng nhất trên thế giới. Năm 1950, công nghiệp sản xuất collagen có những bước phát triển đáng kể về kĩ thuật, từ đó là nền tảng cho các tiêu chuẩn trong sản xuất và chất lượng sản phẩm ngày nay. Ngày nay, sự hiểu biết về acid amin và protein nói chung, collagen cũng như gelatin nói riêng ngày càng nhiều. Thêm vào đó là những tiến bộ trong kĩ thuật đã giúp sản phẩm collagen đạt an toàn vệ sinh, chất lượng theo tiêu chuẩn quốc tế và yêu cầu nghiêm ngặt của các yếu tố kĩ thuật. 1.1.3 Nguồn gốc thu nhận Collagen Trong những năm trước đây, để đáp ứng nhu cầu trong công nghiệp, collagen được trích ly chủ yếu từ da, xương của các loài gia súc và lợn. Khoảng thời gian gần đây, sự bùng phát của các loại bệnh truyền nhiễm như bệnh bò điên (Bovine Spongiform Encephalopathy – BSE, Tranmissible Spongiform Encephalopathy – TSE) và bệnh lở mồm long móng (Food and Mouth Disease – FMD) ở lợn và gia súc đã hạn chế phạm vi sử dụng của collagen có nguồn gốc từ những loài động vật trên bởi vì những bệnh truyền nhiễm có khả năng lây truyền sang con người thông qua các mô của động vật. Bên cạnh đó, ở một số quốc gia, collagen trích ly từ lợn không được sử dụng vì rào cản tôn giáo. Với những nguyên nhân trên, các nhà khoa học đang tập trung vào các nghiên cứu của họ để tìm ra những nguồn collagen thay thế. Da, xương, vây, vảy của cả những loài cá nước ngọt, đặc biệt là cá da trơn: cá tra, cá ba sa, cá biển, da gà, da ếch, da mực,…có thể được sử dụng như những nguồn thay thế. Trong số những nguồn thay thế, cá cung cấp một nguồn nguyên liệu thô tốt nhất vì: - Dễ tìm, sẵn có để sử dụng - Không có sự lây truyền bệnh - Không gặp phải trở ngại về mặt tôn giáo. - Có khả năng thu được collagen với hiệu suất cao Khoảng 70% tổng trọng lượng cơ thể của cá bị bỏ đi dưới dạng các phế phẩm như da, xương, vây, đầu, vảy, ruột,…trong suốt quá trình chế biến. Việc tận dụng những chất thải này có thể nâng giá trị kinh tế của các loài cá lên. Dựa vào thành phần % của tổng lượng collagen tính trên tổng lượng protein, các loài cá được chia thành 3 nhóm: Nhóm có hàm lượng collagen thấp: tổng lượng collagen chiếm đến 5 % so với tổng lượng protein. Nhóm có hàm lượng collagen trung bình : tổng lượng collagen chiếm từ 5 ¸ 10 % tổng lượng protein. Nhóm có hàm lượng collagen cao: tổng lượng collagen trên 10 % tổng lượng protein. Thịt của những loài cá khác nhau chứa hàm lượng khác nhau của collagen hòa tan trong acid (acid soluble collagen) và collagen không hòa tan (insoluble collagen). Hàm lượng collagen tổng cộng dao động từ 0,3 ¸ 2,99 % so với trọng lượng tươi của các mô, tương ứng với phạm vi từ 1,58 ¸ 13,39 % so với tổng lượng protein. Bảng 1.1 Thành phần collagen trong thịt cá Loại cá Collagen hòa tan trong acid (so với trọng lượng tươi) Collagen không hòatan (so với trọng lượngtươi) Collagen tổng (so với trọng lượngtươi) Collagen tổng (so với protein tổng) Cá chim trắng 0,19 0,11 0,3 1,58 Sardine 0,36 0,09 0,45 2,42 Cá thu 0,38 0,09 0,47 2,41 Cá bơn 0,4 0,18 0,58 2,98 Cá chép 0,49 0,21 0,7 3,25 Cá đối 0,94 0,25 1,19 5,89 Cá ngừ 1,06 0,39 1,45 7,35 Cá mập 2,13 0,86 2,99 13,11 Cá đuối 2,3 0,5 2,8 13,39 Tổng lượng collagen trong cơ thể thay đổi từ 3,26 % (ở cá thu) cho đến 6,97% (ở cá chình Nhật Bản). Lượng collagen có thể hòa tan trong acid (acid soluble collagen) nằm trong khoảng từ 13,1 % (cá chình) đến 56,6 % (cá bơn). Hàm lượng collagen thu được sẽ thay đổi tùy theo loài và loại mô được sử dụng trong quá trình trích ly. Trong tất cả các loài, khả năng hòa tan của collagen trong thịt tương đối cao nhưng thấp đối với những loại collagen trong nội tạng. Collagen trong da, vảy, xương và vây chiếm phần lớn trong tổng lượng Collagen. Cho đến nay, hầu hết các loại mỹ phẩm trên nền collagen đều có chứa protein chiết xuất từ gia súc. Bởi sự bộc phát của bệnh bò điên BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy – mad cow disease), collagen từ gia súc đang dần rút khỏi phạm vi sử dụng, thay vào đó là nguồn collagen được trích từ cá, đặc biệt là cá da trơn: cá tra, cá ba sa. Nguồn collagen được chiết tách từ nguồn nguyên liệu này có nhiều đặc điểm tốt hơn cho việc ứng dụng trong thực phẩm, y học và mỹ phẩm. Trong công nghệ sản xuất mỹ phẩm, mỹ phẩm trên nền collagen từ gia súc có tốc độ hấp thụ rất chậm trên da người. Đối mặt với vấn đề này, liệu pháp tiêm collagen vào da được giới thiệu. Tuy nhiên, những bất lợi của cách thức này là đắt tiền, đau đớn và đi kèm với nó là những rủi ro nguy hiểm cho con người. Hiện nay, các nhà khoa học Phần Lan đã phát triển một tiến trình trích ly collagen từ cá. Không giống với những loại collagen thu được từ những phương pháp trước đây, collagen từ cá được hấp thụ hoàn toàn trên da người. Vì cá sống trong phạm vi rộng lớn với các điều kiện về nhiệt độ, độ sâu và áp suất khác nhau. Điều này có nghĩa là collagen trích từ da cá có một sức chống chịu đặc biệt với các phá hủy lý và hóa học. Đối với các thuốc hay thức uống có chứa collagen, collagen từ cá cũng được chứng minh là có tốc độ hấp thụ vào máu nhanh hơn gấp 1,5 lần so với collagen từ lợn. So sánh khả năng hấp thụ vào máu giữa collagen từ cá và collagen từ lợn Thời gian sau khi sử dụng Khả năng hấp thụ vào máu Hình 1.1 Đồ thị so sánh khả năng hấp thụ vào máu của collagen trích ly từ cá và từ lợn Việt Nam là một nước đang phát triển, có nền nông nghiệp với các sản phẩm phong phú. Trong đó, các sản phẩm từ cá chiếm một phần lớn trong kim ngạch xuất khẩu. Những năm gần đây, việc nuôi cá da trơn : cá tra, cá ba sa rất phát triển, đặc biệt ở Đồng bằng sông Cửu Long. Trong quá trình chế biến cá, song song với những chính phẩm dùng cho việc xuất khẩu (chủ yếu là fillet) là một khối lượng lớn các phụ phẩm như da, xương, vây,… Đây là những nguồn giàu collagen, có thể sử dụng thay thế cho những nguồn cung cấp Collagen cổ điển như da, xương từ lợn, bò. Việc tận dụng những nguồn này sẽ góp phần làm tăng giá trị kinh tế của các loài cá da trơn ở nước ta. 1.2 CẤU TẠO COLLAGEN 1.2.1 Thành phần hóa học của Collagen [1] Thành phần protein trong collagen có gần đầy đủ các loại acid amin, bao gồm tất cả 20 loại acid amin ( Schrieber và Gareis,2007). Thành phần acid amin có thể thay đổi tùy theo nguồn gốc của collagen, nhưng vẫn tồn tại một vài tính chất chung và duy nhất cho tất cả collagen. Trong thành phần collagen không chứa cystein và trytophan, nhưng chứa một lượng lớn glycine (Gly), chiếm khoảng 33% và proline (Pro), chiếm tỉ lệ 12% và hydroxyproline (Hyp), chiếm tỉ lệ 22% (Theo Balian và Bowes 1977). Collagen là một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine (Hyl), ngoài ra trong thành phần Collagen còn chứa khoáng, chiếm tỉ lệ 1%. Bảng 1.2 So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác (số gốc/1000 gốc) Collagen Casein Albumin Glycine 363 30 19 Alanin 107 43 35 Valine 29 54 28 Leucine 28 60 32 Isoleucine 15 49 25 Serin 32 60 36 Threonine 19 41 16 Cystein - 2 1 Methionine 5 17 16 Aspatic acid 47 63 32 Glutamic acid 77 153 52 Lycine 31 61 20 Hydroxylycine 7 - - Arginine 49 25 15 Histidine 5 19 7 Phennylalanine 15 28 21 Tyrosine 5 45 9 Trytophan - 8 3 Proline 131 65 14 Hydroxyproline 107 - - Proline và Hydroxyproline liên quan tới cấu trúc bậc 2 của collagen. Những amino acid này giúp giới hạn sự quay của bộ khung polypeptide, do đó góp phần tạo nên sự bền vững cho cấu trúc xoắn ốc bậc 3. Nhóm hydroxyl của hydroxylproline đóng vai trò quan trọng trong sự bền vững cấu trúc xoắn ốc bậc 3 của collagen. Polypeptide của collagen mà thiếu hydroxylproline sẽ tạo nên cấu trúc gấp khúc ở nhiệt độ thấp và sẽ không bền vững ở nhiệt độ thân nhiệt. Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen mà các loại protein khác không có. Hydroxyproline được hình thành sau quá trình điều chỉnh proline khi được kết hợp vào vị trí Y trong chuỗi Gly-X-Y. Hydroxyproline có công thức phân tử là C5H9NO3, khác với proline, trong công thức cấu tạo của Hyp có gắn nhóm OH nằm ở vị trí cacbon gamma, acid amin này có vai trò quan trọng trong sự ổn định cấu trúc của collagen, là dẫn xuất của proline trong quá trình hình thành chuỗi collagen có sự xúc tác của enzyme hydroxylase proline và sự có mặt của Vitamin C để giúp bổ sung thêm Oxy, thiếu vitamin C sẽ làm chậm quá trình tổng hợp hydroxyproline, ảnh hưởng đến quá trình xây dựng cấu trúc protein gây ra những rối loạn trong cơ thể. Hình 1.2 Công thức cấu tạo của hydroxyproline Phân tử collagen bao gồm 3 chuỗi xoắn lại với nhau tạo thành collagen triple- helix tạo thành cấu trúc 3D- một mô hình lý tưởng cho các liên kết hydro giữa các chuỗi ( Te Nijenhuis, 1997). Mỗi chuỗi trong triple- helix quay theo chiều kim đồng hồ. Triple-helix dài xấp xỉ 300nm và chuỗi có khối lượng phân tử khoảng 105 kDa (Papon, Leblon và Meijer, 2007). Triple-helix được ổn định bởi liên kết hydro nội giữa các chuỗi. Trong cấu trúc phân tử collagen, do tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen. Sự biến tính collagen làm cho các cầu nối bị tách một phần hoặc hoàn toàn gây nên sự tách rời các chuỗi do phá hủy các liên kết hydro, chính điều này làm mất đi cấu trúc triple-helix. Mô hình “ triple-helice” của collagen dựa trên những nghiên cứu về hiện tượng nhiễu xạ sợi. Chuỗi nhiễu xạ sợi thể hiện trên mức trung bình của toàn bộ phân tử collagen , và mô hình đặc trưng thể hiện đó là sự sắp xếp lặp đi lặp lại của các chuỗi polypeptid, thông thường là Gly-Pro-Hyp. Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino acid trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này. Mỗi sợi collagen này được cấu tạo từ ba chuỗi polypeptid nối với nhau giống như sợi dây thừng. Cấu trúc của collagen tương tự như hình xoắn ốc, mỗi một chuỗi polypeptid trong collagen được cấu tạo từ các acid amin theo một trật tự, thông thường là Gly – Pro – Y, hoặc Gly – X – Hyp. Hình 1.3 Trình tự sắp xếp các acid amin trong phân tử Collagen Trong đó X, Y là những đơn vị aminoacid khác nhau, có thể là proline (Pro) và hydroxyproline ( Hyp) chiếm khoảng 1/6 chiều dài chuỗi. Glycine chiếm gần 1/3 trong tổng số các amino acid và nó được phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi 1/3 xuyên suốt trong phân tử collagen. Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau hình thành nên một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi. Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline và glycine đã chiếm ½ chuỗi Collagen. Các acid amin còn lại chiếm ½ Bảng 1.3 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide Triple helix Tỉ lệ so với tổng bộ ba(%) Gly – X – X 44 Gly – X – Y 20 Gly – Y – X 27 Gly – Y – Y 9 Collagen cũng chứa các đơn vị carbonhydrate, cả monosaccharide galactose hoặc disaccharide glucosylgalactose, liên kết với phần dư hydroxylysine thông qua nhóm hydroxyl chức năng của amino acid. Tỷ lệ của mono/disaccharide phụ thuộc vào loại collagen và tình trạng sinh học. Chức năng của các đơn vị carbohydrate vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ, nhưng ảnh hưởng của chúng trong việc gắn kết phần bên phân tử collagen hình thành nên sợi và bán kính của sợi đang được nghiên cứu. Ngoài ra, trong phân tử collagen có những vùng gồm khoảng 9 ¸ 26 amino acid tại các điểm đầu mút amino hay carboxyl của chuỗi. Các vùng này không sáp nhập với cấu trúc xoắn ốc và được gọi là telopeptide. 1.2.2 Cấu trúc phân tử Collagen [1] Phân tử collagen là một protein hình trụ, có cấu trúc bậc 4, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc.. Đơn vị cơ bản của collagen là “Tropocoll