Đề tài Tổng quan về legionella gây bệnh trong nước

CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong những năm qua thì ngộ độc thực phẩm được biết đến khá thường xuyên, trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây ra ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp là có nguồn gốc từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật này trong nước uống, thực phẩm. Ngày nay, an toàn nhất là về phương diện vi sinh vật, trở thành một trong những yêu cầu không thể thiếu đối với chất lượng thực phẩm. Việt Nam là một nước nông nghiệp có tiềm lực lớn về sản xuất nông sản, thủy hải sản, thực phẩm. Ngoài thị trường tiêu thụ nội địa cho gần 80 triệu dân, thực phẩm và thủy sản của nước ta cũng đã xuất khẩu được ra thị trường thế giới đem lại nguồn ngoại tệ lớn cho đất nước. Đặc biệt, thủy hải sản chế biến của Việt Nam đã có được thị phần quan trọng tại Bắc Mỹ, Châu Aâu, Nhật Bản, Hoa Kỳ…là một trong những ngành kinh tế mang lại ngoại tệ quan trọng cho đất nước, giải quyết việc làm cho một số lượng lớn người lao động ở cả nông thôn và thành thị. Do nhận thức ngày càng được nâng cao của người tiêu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sự tăng cường quản lý nhà nước, kiểm tra, giám sát của các cơ quan chức năng, việc phân tích vi sinh vật gây bệnh và thực hiện các biện pháp đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt tiêu chuẩn về an toàn về vi sinh vật ngày càng được các đơn vị sản xuất, chế biến thực phẩm nội địa quan tâm. Đối với thủy hải sản xuất khẩu, để đáp ứng tiêu chuẩn nghiêm ngặt về vi sinh của các thị trường trên thế giới và tăng cường năng lực cạnh tranh, trong những năm gần đây các đơn vị sản xuất chế biến thủy hải sản xuất khẩu Việt Nam đã rất chú trọng đến việc đầu tư đổi mới công nghệ, thực thi các chương trình quản lý đảm bảo chất lượng như phân tích và kiểm soát, trong đó việc xây dựng phòng phân tích, kiểm định và đào tạo cán bộ phân tích, kiểm định vi sinh vật ngày càng được quan tâm. Như vậy, hiện nay đang có một nhu cầu thực tiễn rất lớn về phía nhà sản xuất cũng như về phía người lao động về đào tạo cán bộ phân tích vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Nhà sản xuất có phòng thí nghiệm phân tích tốt, có đội ngũ có tay nghề cao sẽ dễ thuyết phục, tạo được niềm tin ở đối tác để ký kết các hợp đồng sản xuất quan trọng. Cán bộ kỹ thuật, kỹ thuật viên được đào tạo, nâng cáo kỹ năng về phân tích vi sinh vật sẽ dễ củng cố vai trò và sự cần thiết của mình đối với đơn vị. Với ý nghĩa thực tiễn đồng thời được sự chấp nhận của Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tổng quan về Legionella gây bệnh trong nước”. Mục đích Tìm hiểu về Legionella gây bệnh trong nước. Tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của Legionella. Nội dung nghiên cứu - Tìm hiểu độc tố và khả năng gây bệnh của Salmonella trong thực phẩm. - Tìm hiểu độc tố và khả năng gây bệnh của Escherichia Coli trong thực phẩm. - Tìm hiểu độc tố, cơ chế gây bệnh, đặc điểm cấu trúc của Legionella gây bệnh trong nước. - Tìm hiểu các nguồn nhiễm của Legionella và các phương pháp phát hiện Legionella. - Tìm hiểu biện pháp kiểm soát Salmonella, Escherichia Coli, Legionella gây bệnh trong thực phẩm. CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM 2.1. Salmonella 2.1.1. Lịch sử phát hiện Salmonella - Năm 1880 Grafhy đã mô tả hình thái vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản. - Năm 1884 Grafhy là người đầu tiên phân lập Salomonella typhi. - Chi Samonella được bắt nguồn từ tên cuối cùng của Daniel Elmer Salmo. - Năm 1885 nhà nghiên cứu Theobald Smith trợ lý cho Daniel Elmer Salmon (1850-1914) đã phát hiện ra Salmonella choleraesuis. Kể từ đó số lượng Salmonella gây ra Samonellosis đã tăng lên 2.300 typhi. Nhưng sau đó Schweinittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây nên và đã xác định S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn. - Năm 1889 Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được S.pullorum năm 1909. Hình 2.1 : Vi khuẩn Salomonella typhi và Salmonella choleraesuis. 2.1.2. Phân loại Samonella Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào : Giới : Bacteria Nghành : Proteobacteria Lớp : Gamma Proteobacteria Bộ : Enterobacteriales Họ : Enterobacteriaceae Giống : Salmonella lignieres (1990) 2.1.3. Đặc điểm của Salmonella 2.1.3.1. Đặc điểm hình thái Salmonella có hình gậy ngắn, hai đầu tròn. Đa số các loại Salmonella đều có khả năng di động mạnh do có từ 7-12 lông xung quanh thân. Vi khuẩn sẽ nhuộm màu với các thuốc thông thường, bắt màu Gram âm. Khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu. Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ 2-3 x 0,5-1µm. Di chuyển bằng tiên mao (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum gây bệnh cho gia cầm), không tạo bào tử, chúng phát triển tốt ở 6oC – 420C, thích hợp nhất ở 350C – 370 C, pH từ 6 - 9 thích hợp nhất là pH = 7,2. Ở 180C – 400C vi khuẩn có sống đến 15 ngày. Hình 2.2: Vi khuẩn Salmonella enteritidis và Salmonella typhimurium. 2.1.3.2. Tính chất nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, dễ nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp 370C nhưng có thể phát triển được ở pH từ 6-9. Phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. - Môi trường nước thịt : Cấy vài giờ đã đục nhẹ, sau 18 giờ đục đều, nuôi cấy lâu thì ở đáy ống nghiệm có mặt trên môi trường có màng mỏng. - Môi trường thạch thường : Nuôi cấy trên thạch thường vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa, nhỏ và trắng hơn khuẩn lạc E.coli. - Môi trường Mac Conkey : Ở 350C- 370C sau 18-24 giờ vi khuẩn Salmonella mọc thành những khuẩn lạc tròn, trong, không màu, nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa. - Môi trường SS : Nuôi cấy ở 350C- 370C sau 18-24 giờ vi khuẩn Salmonella mọc thành những khuẩn lạc tròn, bóng, không màu. - Môi trường XLD : Nuôi cấy ở 350C- 370C sau 18-24 giờ vi khuẩn Salmonella mọc thành những khuẩn lạc tròn, lồi có tâm đen ở giữa, môi trường chuyển sang màu hồng. Hình 2.3: Salmonella spp sau khi tăng trưởng 24 giờ trên thạch XLD. 2.1.3.3. Đặc điểm sinh hóa Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số đường nhất định và không đổi. Phần lớn các loài Salmonella lên men đường glucose, sinh hơi, không lên men lactose, sucrose, salicin và inositol. - Một số loài Salmonella cũng lên men đường glucose nhưng không sinh hơi như S.abortus equi, S. abortus bovis, S.typhisuis, S.typhi… - Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có tính chất trên, các ngoại lệ đã được xác định như Salmonella typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và S.cholerasuis không sinh H2S. S.pullorum không lên men mantose. - Tất cả các Salmonella không lên men lactose và saccarose. - Đa số Salmonella không làm tan chảy gelatin, không phân giải urê, không sinh Indol, một số sử dụng được cacbon. - Trên môi trường KIA (Kiglen Iron Agar) : vi khuẩn lên men glucose và không lên men lactose nên phần thạch đứng chuyển sang màu vàng, phần thạch nghiêng giữ nguyên màu của môi trường (màu hồng), vi khuẩn có hoặc không sinh - Phản ứng H2S dương tính (trừ S.paratyphi A, S.abortusequi, S.typhisuis). 2.1.3.4. Đặc điểm cấu trúc Salmonella Salmonella có 3 loại kháng nguyên đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự kích thích đó. Kháng nguyên đó bao gồm : + Kháng nguyên thân O + Kháng nguyên lông H + Kháng nguyên vỏ K + Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu. a) Kháng nguyên thân O Thành phần cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm hai lớp : Trong cùng là một lớp peptidoglycan, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipoplysaccharide. Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố của nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu. Kháng nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide (LPS). Tính đặc hiệu của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau: Kháng nguyên O ngoài LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính miễn dịch của nó mạnh hơn LPS. Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8 - 10 nm gồm 3 thành phần: Lipid A, polysaccharide, lõi. Màng ngoài kháng nguyên O còn có thêm các protein: + Protein cơ chất: Porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ. + Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài. + Lipoprotein: Đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài. b) Kháng nguyên vỏ K - Kháng nguyên vỏ K có bản chất hóa học của vỏ vi khuẩn là polypeptid hoặc polysaccharide.Vỏ của vi khuẩn gây miễn dịch không mạnh nhưng khi gắn với tế bào vi khuẩn vỏ vẫn gây được miễn dịch. Kháng nguyên vỏ được dùng để phân loại các chủng Salmonella. c) Kháng nguyên lông H - Được tổng hợp từ các acid amin dạng D ( dạng ít gặp trong tự nhiên). Do đó việc xử lý kháng nguyên của các tế bào miễn dịch không thuận lợi và đáp ứng kháng thể không mạnh. Khi các sợi lông bị kết hợp bởi các kháng thể đặc hiệu, lông sẽ bị bất động, vi khuẩn không thể di chuyển được.Kháng nguyên lông cũng dùng để phân loại một số chủng Salmonella. - Kháng nguyên lông H chia làm 2 phase : + Phase 1 : Có tính đặc hiệu gồm 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị bằng chữ số La Tinh thường : a, b, c… + Phase 2 : Không có tính đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khác đôi khi thành phần có thể gặp ở E.coli. Phase 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữ số Ả Rập hay chữ số La Tinh . 2.1.4. Độc tố của Salmonella - Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra hai loại độc tố : Ngoại độc tố và nội độc tố.- Nội độc tố Salmonella rất mạnh gồm 2 loại : Gây xung huyết và mụn huyết, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. - Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra rồi cấy chuyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invitro và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột. 2.1.4.1. Nội độc tố Endotoxin Màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là lipopolysaccharide (LPS). LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với đặc tính và chức năng riêng biệt : Vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A. - Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharide chứa các đơn vị kháng nguyên O. - Vùng lõi có bản chất là acid heteroligosaccharide, ở trung tâm nối kháng nguyên O với vùng lipit A. - Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của vi khuẩn. Cấu trúc nội độc tố gần giống với cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội độc tố biến đổi sẽ dẫn tới sự thay đổi độc lực của Salmonella. Nội độc tố thường là lipopolysaccharide (LPS) được phóng ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện độc tính của mình, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như : Tế bào đại thực bào, tiểu thực bào, tế bào gan, lách. Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể chịu sự tác động của nội độc tố LPS như : Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa, hệ thống miễn dịch. Với các biểu hiện bệnh lý như : Tắc mạch máu, giảm trương lực cơ thiếu oxy mô bào, rối loạn tiêu hóa, mất tính thèm ăn… Nội độc tố tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ, kích thích hình thành kháng thể. LPS tác động lên các tế bào tiểu cầu, gây sốt nội độc tố theo cơ chế : + Giải phóng các chất hoạt động mạnh như : Histamin. + Ngưng kết các tiểu cầu động mạch. + Đông vón, tắc mạch quản. LPS tác động lên quá trình trao đổi gluxit : LPS làm tăng cường hoạt lực của các men phân giải glucose, các men phân giải glycogen, làm giảm hoạt lực các men tham gia quá trình tổng hợp glycogen… 2.1.4.2. Độc tố đường ruột Enterotoxin - Cơ chế miễn dịch và di truyền các Enterotoxin của Salmonella có quan hệ gần gũi với Choleratoxin nên được gọi là Choleratoxin like enterotoxin ( viết tắt là CT). - Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính : Độc tố thẩm xuất nhanh ( Rapid permeability facto viết tắt là RPF) và độc tố thẩm xuất chậm là (Delayed permeability facto viết tắt là DPF). - Độc tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, sau khi thực hiện khả năng thẩm xuất 1-2 giờ và kéo dài 48 giờ thì làm trương các tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). - Độc tố thẩm xuất nhanh kích thích co bóp nhu động ruột, làm tăng thẩm thấu thành mạch, phá hủy tổ chức tế bào mô ruột, giúp vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào tế bào và phát triển nhanh về số lượng. - Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E.coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella (Heat Lable Toxin viết tắt là LT). LT thực hiện chức năng phản ứng chậm từ 18-24 giờ. LT bị phá hủy ở 37 oC trong vòng 30 phút và ở 50oC trong vòng 4 giờ. - Độc tố thẩm xuất chậm làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải dẫn đến cản trở sự hấp thu, gây thoái hóa lớp tế bào thành ruột gây tiêu chảy. 2.1.4.3. Độc tố tế bào - Khi cơ thể người và động vật bị tiêu chảy thì kèm theo hiện tượng mất nước vì vậy hàng loạt các tế bào biểu mô ruột bị phá hủy hoặc bị tổn thương ở các mức độ khác nhau. Sự phá hủy hay tổn thương đó là do độc tố tế bào của Salmnella gây nên. - Có 3 dạng độc tố tế bào : + Dạng thứ nhất : Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với trypsin. Độc tố dạng này tác động theo cơ chế là ức chế tổng hợp protein của tế bào Hela và làm teo tế bào. + Dạng thứ hai : Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi khuẩn có cấu trúc và chức năng gần giống với các dạng độc tố tế bào do Shigella. Phổ biến ở hầu hết các Salmonella serovar gây bệnh. + Dạng thứ ba : Có liên hệ với độc tố hemolysin. Hymolysin liên hệ với các độc tố tế bào có sự khác biệt với Hemolysin khác về trọng lượng phân tử và các phương thức tác động lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào. 2.1.5. Khả năng gây bệnh của Salmonella Tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm gen inv (invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm vào thành ruột của người và động vật mở đầu cho tiến trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI – 1 (Salmonella pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella tư ønhóm tiến hóa thấp nhất là S.bongori đến nhóm tiến hóa cao nhất là S.enterica I. InvA là một bản gen luôn có mặt trong hệ thống geninv. Sự xâm nhiễm Salmonella vào cơ thể vật chủ và gây bệnh được thực hiện chủ yếu qua con đường tiêu hóa với biểu hiện phổ biến nhất là gây tiêu chảy, đôi khi là thương hàn và phó thương hàn. Salmonella chủ yếu gây bệnh bằng nội độc tố. Nội độc tố chịu được nhiệt độ sôi và không bị phân hủy bởi protease, tính kháng nguyên yếu và không sản xuất được kháng nguyên.Trái lại với ngoại độc tố để gây bệnh Salmonella xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hóa do thức ăn, nước uống bị nhiễm bẩn. Các chủng Salmonella thường sản sinh ra một entertoxin có bản chất lipopolysaccharide vốn có khả năng tác động đến nhiều mô khác nhau, đến các chức năng mô. Tuy nhiên trong trường hợp nhiễm độc thực phẩm chất độc này chỉ có tác dụng khi nó được giải phóng vào trong ruột từ những vi khuẩn sống và đang trong pha sinh sản. Khi ăn các bào tử sống thì có thể sinh bệnh song khi ăn các vi khuẩn đã bị chết do nhiệt thì không bị ảnh gì. Sau khi đi vào ống tiêu hóa, vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột non rồi xâm nhập qua niêm mạc vào các hạch mạc trên ruột. Ở đây chúng nhân lên qua hệ thống bạch huyết và ống ngực đi vào máu, lúc này dấu hiệu lâm sàng bắt đầu xuất hiện. Từ máu, vi khuẩn đến lá lách và các cơ quan khác. - Tới màng Peyer vi khuẩn tiếp tục nhân lên. - Tới gan theo mật đổ xuống ruột rồi được đào thải qua phân. - Tới thận một số vi khuẩn được đào thải ra ngoài theo đường nước tiểu. Salmonella gây bệnh bằng sự xâm của bản thân vi khuẩn phá hủy tổ chức tế bào bằng nội độc tố của Salmonella khi bị chết. Ngộ độc do Salmonella cần có 2 điều kiện: - Thức ăn phải nhiễm một lượng lớn vi khuẩn sống, vì tính chất gây độc của vi khuẩn rất yếu. - Vi khuẩn vào cơ thể tiết ra một lượng lớn độc tố. 2.1.6. Điều trị khi nhiễm Salmonella Những kháng sinh thường được dùng để điều trị Salmonella galiinarum là choloramphenicol và ampicillin. Trước đây chloramphenicol là loại kháng sinh có hiệu lực gần như tuyệt đối trong điều trị các Salmonella nói chung và các Salmonella gây bệnh thương hàn nói riêng. Tuy nhiên chúng ta cần lưu ý đến hai nguyên tắc cơ bản : - Lúc đầu không được dùng liều thuốc quá mạnh vì như thế có thể tiêu diệt vi khuẩn làm chúng nhả ra nhiều độc tố có thể nguy hại đến tim, thần kinh làm bệnh nhân có thể chết bất thần. - Nên dùng thuốc từ 1-2 tuần lễ sau khi hạ nhiệt vì vi khuẩn còn ẩn trốn trong hạch hay túi mạch dễ có nguy cơ tái phát sau này. Hie