Đề tài Tổng quan về sản xuất Butanol bằng phương pháp lên men tĩnh

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Do sự gia tăng liên tục giá thành của dầu thô-nguồn năng lượng chính trên thế giới hiện nay, rất nhiều đề tài nghiên cứu gần đây quan tâm đến việc phát triển các nguồn nhiên liệu mới có giá trị về mặt kinh tế và môi trường. Có thể nói nhiên liệu sinh học là một nguồn nhiên liệu đầy tiềm năng hứa hẹn thay thế cho nguồn xăng dầu sắp cạn kiệt trong tương lai, đặc biệt là những nhiên liệu được sản xuất thông qua quá trình lên men từ các nguồn nguyên liệu tái tạo, điển hình là butanol. Hiện nay butanol thương mại được sản xuất chủ yếu từ con đường hóa dầu nhưng kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình lên men từ vi sinh vật để thu nhận butanol có rất nhiều triển vọng. Quá trình lên men sản xuất butanol hay còn gọi là quá trình lên men Ethanol-Butanol-Acetone (ABE) được thực hiện bởi giống vi khuẩn Clostridium, đặc biệt là loài Acetobutylicum (Lin và Blaschek, 1983). Loài vi sinh vật này được xem là lâu đời nhất trong nghành công nghiệp lên men kỵ khí bắt buộc. Nó được xếp ở vị trí thứ hai chỉ sau lên men ethanol từ nấm men Saccharomyces cerevisiae ở quy mô sản xuất. Quá trình lên men ABE được thực hiện rộng rãi trong công nghiệp đến nửa đầu thế kỷ 20 với 66% sản lượng tiêu thụ trên toàn thế giới của butanol được sản xuất từ phương pháp sinh học (Dürre, 2008). Tuy nhiên, với sự ra đời của Thế chiến thứ hai và sự phát triển leo thang của ngành công nghiệp hóa dầu, sản xuất butanol từ phương pháp sinh học nhanh chóng giảm dần. Đến năm 1960, hiệu quả thấp của quá trình lên men ABE so ngành công nghiệp hóa dầu cùng với các chi phí cao hơn khi sử dụng các nguồn carbohydrate làm cơ chất dẫn tới kết quả là việc đã xoá bỏ hoàn toàn các hoạt động công nghiệp từ quá trình lên men này. Tuy nhiên, khi giá dầu bắt đầu tăng từ đầu những năm 1970 do "cuộc khủng hoảng dầu thô" cùng với sự suy giảm dần về nguồn dầu và hơn nữa là sự thúc đẩy xã hội trên toàn thế giới nhận thức về các vấn đề môi trường đang trong tình trạng cấp cứu, đã làm cho con người quan tâm đến ngành công nghiệp sinh học (Dürre, năm 1998; Dürre, 2008). Kể từ đó, những nỗ lực nghiên cứu đáng kể về quá trình lên men ABE sản xuất butanol đã được thực hiện trong nhiều lĩnh vực, cụ thể là trong ngành công nghệ vi sinh vật, tạo ra các chủng đột biến mới nhằm nâng cao sản lượng dung môi, nghiên cứu thay đổi các điều kiện lên men nhằm cải thiện năng suất thấp và nồng độ butanol trong dịch lên men. Giống như trong mọi quá trình sinh học khác, quá trình lên men ABE thể hiện một số hạn chế về kinh tế và khả năng cạnh tranh so với các quá trình sản xuất bằng phương pháp hóa học tinh khiết. Những bất lợi chính trong trường hợp này liên quan đến con đường trao đổi chất khá phức tạp bởi các vi khuẩn sản xuất butanol. Trong một chu trình lên men ABE tiêu biểu từ nguồn carbohydrate: axit butyric, propionic và acetic trước hết được sinh tổng hợp bởi C. acetobutylicum (acidogenesis) trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân của tế bào. Khi vi sinh vật bước vào giai đoạn ổn định sẽ bắt đầu giai đoạn tạo thành acetone, butanol và ethanol theo tỷ lệ 3:6:1 tương ứng (solventogenesis) (Fond et al, 1985.). Quá trìnhchuyển pha từ acidogenesis sang solventogenesis được điều khiển bằng cách thay đổi hoặc làm giảm pH ( 2 gl-1) (Gottschalk và Morris, 1981; Gottwald và Gottschalk, 1985; Monot etal., 1984). Tuy nhiên, quá trình lên men trong thực tế khá phức tạp cần phải kiểm soát chặt chẽ các điều kiện lên men để đạt hiệu quả cao (Chauvatcharin et al., 1998). Trong quá trình lên men ABE truyền thống, mật độ tế bào vi sinh vật thấp trong môi trường lên men làm hiệu suất sinh tổng hợp butanol từ glucose nói chung là khá thấp thường khoảng 15% (w / w) và hiếm khi vượt quá 25% (w / w). Ngoài ra, việc sinh tổng hợp butanol còn bị giới hạn bởi nhiều yếu tố ức chế khác, trong đó butanol là yếu tố chính gây ức chế ngược lên sự tăng trưởng của tế bào làm ngừng quá trình lên men. Trong thực tế, vi khuẩn khó có thể duy trì hoạt tính khi nồng độ butanol trong dịch lên men xấp xỉ 10 gl-1. Kết quả là nồng độ butanol trong dịch lên men ABE thường xấp xỉ 13 gl-1. Do đó, việc sản xuất butanol từ quá trình lên men ABE truyền thống cho hiệu quả kinh tế rất thấp. (Maddox, 1989). Nội dung bài viết này sẽ giới thiệu chung về butanol cũng như các ứng dụng của nó trong thực tiễn. Dựa trên các nghiên cứu gần đây về quá trình lên men tĩnh sản xuất butanol sẽ trình bày một số chủng Clostridium đã được phân lập có khả năng sinh tổng hợp và chịu được nồng độ butanol cao. Giới thiệu các nguồn cơ chất khác nhau mà vi sinh vật có thể sử dụng để lên men cũng như các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo butanol, qua đó có thể so sánh hiệu suất sinh tổng hợp butanol. Trình bày một số kết quả nghiên cứu đạt được khi lên men sử dụng tế bào vi khuẩn cố định trên một số chất mang. Các phương pháp tách chiết butanol từ dịch sau lên men cũng sẽ được giới thiệu trong bài viết này. CHƯƠNG 2: BUTANOL 2.1. Giới thiệu chung Butanol (danh pháp IUPAC, 1-butanol; CAS no.71-36-3) còn được gọi là rượu butylic, n-butanol hoặc methylolpropane, là một rượu gồm 4 cacbon có công thức phân tử C4H9OH (KLPT = 74,12 g.mol-1). Butanol là một chất lỏng không màu, dễ cháy, kỵ lỏng, có mùi thơm như chuối hương và có mùi cồn mạnh. Khi tiếp xúc trực tiếp nó có thể gây kích ứng mắt và da.Hơi của nó có tác dụng kích thích vào niêm mạcmàng và có khả năng gây mê khi hít phải ở nồng độ cao.Butanol hầu như hòa tan hoàn toànvới các dung môi hữu cơ phổ biến, nhưng lại ít hòa tan trong nước (Lee và cộng sự, 2008a). Hình 1: Cấu trúc không gian của butanol Bảng 1: Tính chất vật lý của n- butanol Khối lượng phân tử 74.12 g mol-1 Dạng tồn tại Dung dịch lỏng màu vàng Tỷ trọng 0.810– 0.812 Nhiệt độ nóng chảy −90 °C, 183 K, -130 °F Nhiệt độ sôi 118 °C, 391 K, 244 °F Độ tan trong nước 9.0 ml/100 ml (7.7 g/100 ml ở 20°C) Nhiệt độ đánh lửa 35–37 oC Nhiệt độ tự bốc cháy 343–345 oC Flash point 25–29 oC Nhiệt hóa hơi 43.8 kJ mol-1 Nhiệt đốt cháy 198.2 kJ mol-1 Áp suất hơi ở 20oC 0.63 kPa 2.2. Ứng dụng của butanol trong thực tiễn Một trong những ứng dụng ưu việt lớn của biobutanol (butanol sinh học) là được sử dụng để pha trộn vào xăng dầu làm nhiên liệu chính cho các động cơ. Trong khi ethanol đã nhận được rất nhiều sự quan tâm như là một nguồn nhiên liệu hỗ trợ bởi nhiều lý do (Hansen et al., 2005 và Niven, 2005) thì butanol lại cho thấy nó có thể là một lựa chọn tốt hơnso với ethanol vì có các tính chất hóa học và vật lý phù hợp. Bảng 2: Bảng so sánh tính chất của butanol với xăng và ethanol Tính chất Butanol Xăng Ethanol Nhiệt độ sôi (oC) 117–118 27–221 78 Tỷ trọng ở 20°C (g/ml) 0.8098 0.7–0.8 0.7851 Khả năng tan trong 100g nước Không tan Không tan Tan Mật độ năng lượng (MJ.l-1) 27–29.2 32 19.6 Nhiệt bay hơi (MJ/kg) 0.43 0.36 0.92 Nhiệt dung riêng (kJ/kmol.ºK) 178 160–300 112.3 Chỉ số Octane 96 91–99 129 Độ nhớt (10-3 Pa.s) 2.593 0.24–0.32 1.078 Theo Shapovalop và Ashkinazi, (2008) và Dürre, (2007) butanol thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với ethanol trong việc thay thế nguồn nhiên liệu xăng dầu, cụ thể: Giá trị năng lượng của butanol là 29.2 MJ/L trong khi giá trị năng lượng của ethanol chỉ là 19.6 MJ/L và của xăng là 32 MJ/L thì năng lượng của butanol đã nhiều hơn ethanol khoảng 25%. Dựa vào áp suất hơi có thể thấy butanol sử dụng an toàn hơn so với ethanol do butanol ít bay hơi hơn ethanol và xăng. Butanol ít gây ăn mòn hơn so với ethanol, không ảnh hưởngđến các thiết bị chứa đựng như bể chứa, đường ống, máy bơm… khi sử dụng lâu dài. Khả năng hòa tan thấp trong nước của butanol cho phép nó có thể được pha trong xăng dầu ở nồng độ cao hơn bất kì loại nhiên liệu sinh học nào mà không sợ bị tách pha làm xuất hiện nước, trong khi ethanol chỉ có thể được pha thêm vào xăng khoảng 25% vàchỉ được giữ trong một thời gian ngắn để sử dụng. Áp suất hơi của butanol (4 mmHg ở 20°C) là thấp hơn so với ethanol 11 lần (45 mmHg ở 20°C) cho phép nó có thể pha trực tiếp vào xăng mà không cần quan tâm đến sự bay hơi. Trong quá trình đốt cháy, butanol không thải ra bất kì hợp chất khí nào chứa sulphur và các oxit nitơ, đây là một ưu điểm vượt trội về môi trường so với các nguồn nhiên liệu khác. Với những ưu điểm trên cùng với một nguồn cơ chất phong phú có thể được sử dụng trong quá trình lên men ABE, biobutanol sẽ là một tiềm năng lớn trong việc thay thế nguồn nhiên liệu xăng dầu đang cạn kiệt và góp phần làm giảm hiệu ứng nhà kính. Bên cạnh vai trò là nhiên liệu sinh học cho động cơ, butanol thực sự là một hóa chất quan trọng được sử dụng với lượng lớn trong các ngành công nghiệp. Gần một nửa sản lượng butanol được sản xuất trên toàn thế giới được sử dụng làm dung môi ở dạng butyl acrylate và este methacrylate trong sản xuất các loại sơn nhưenamel,nitrocellulose; keo dán, chất đàn hồi, công nghệ dệt may, sản xuất sợi, nhựa, sản xuất kính an toàn, chất tẩy rửa. Các hợp chất quan trọng có nguồn gốc từ butanol như butyl ete glycol, butylacetate,amin butyl,nhựa amin và chất dẻo. Nó cũng được sử dụng làm dung môi trong ngành công nghiệp mỹ phẩm như nước hoa, các sản phẩm trang điểm cho mắt, sơn móng tay…và được dùng cho việc sản xuất các loại thuốc kháng sinh, vitamin và hormone. CHƯƠNG 3: VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN SẢN XUẤT BUTANOL – CLOSTRIDIUM 3.1. Đặc điểm hình thái Clostridium là một giống trực khuẩn Gram dương, thuộc ngành Firmicutes. Đây là những vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng sinh nha bào khi môi trường sống bất lợi. Đại diện tiêu biểu đó là loài Clostridium acetobutylicum có dạng hình que thẳng, kích thước khác nhau từ 0,5-1,5 × 1,5-6 μm (Robinson, 2000). Clostridium acetobutylicum là vi khuẩn Gram dương khi đang phát triển trong giai đoạn logarite trong canh trường,và chuyển thành Gram âm khi bước sang giai đoạn ổn định và sinh bào tử, lên men dị dưỡng, di động bằng roi. Trong quá trình hình thành bào tử, tế bào phình lên rõ rệt và tích trữ các hạt, một polysaccharide cung cấp nguồn carbon và năng lượng trong giai đoạn solventogenesis. Bào tử được hình thành có dạng bầu dục. Các vi sinh vật thuộc giống Clostridium lên men thường được xếp thành bốn nhóm khác nhau dựa trên đặc tính sinh hóa và di truyền của chúng (Woods, 1995) bao gồm: Clostridium acetobutylicum, C.beijerinckii,C.saccharobutylicum, và C. saccharoperbutylacetonicum. Hai loài được biết đến với nhiều ưu điểm vượt trội là C. acetobutylicum và C. beijerinckii (trước đây gọi là C. butylicum) và hầu hết các tài liệu nghiên cứu về lên men ABE đều dựa trên hai loài này. Hình 2: Hình ảnh của C.acetobutylicum và C.beijerinckii trên kính hiển vi điện tử (SEM) 3.2. Đặc điểm sinh lý của vi khuẩn Clostridium 3.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng Nguồn Carbon: Quá trình tổng hợp acetone, butanol, and ethanol từ các loài thuộc giống Clostridium đều bắt nguồn từ cơ chất là carbohydrate. Nhóm vi sinh vật này có khả năng sử dụng nguồn dinh dưỡng rất đa dạng, có thể sử dụng gần như hoàn toàn các loại đường như glucose, fructose, mannose, sucrose, lactose và sử dụng một phần các đường xylose, galactose, arabinose, raffinose… Nhiều nghiên cứu cho thấy glucose vẫn là loại đường tốt nhất cho Clostridium sử dụng. Nguồn Nitơ: Nitơ là thành phần quan trọng của protein và enzyme, có thể được cung cấp vào môi trường nhân giống và lên men cho vi sinh vật sử dụng dưới dạng các muối NH4+ và NO3- hay các hợp chất hữu cơ phức tạp từ chất chiết nấm men, sản phẩm thủy phân từ đậu nành… Việc bổ sung nitơ là cần thiết cho việc tạo sinh khối vi sinh vật, tuy nhiên nếu bổ sung quá nhiều có thể làm ức chế việc sinh tổng hợp sản phẩm. Khoáng: Sự phát triển tế bào của vi khuẩn phụ thuộc vào các muối khoáng trong môi trường như Mg2+, Fe2+, Mn2+ và K+ . Chúng được cung cấp dưới dạng các muối như MgSO4, MnSO4, FeSO4, KCl, KH2PO4 và K2HPO4;…Nếu nồng độ của Mg2+ và Mn2+ trong môi trường quá cao sẽ gây ức chế đến sự sinh trưởng của tế bào. Yếu tố sinh trưởng: Cũng giống như các loài vi khuẩn khác, quá trình sinh trưởng và phát triển của Clostridium đòi hỏi cung cấp một số yếu tố sinh trưởng như biotin, thiamine hydrochloride, p-aminobenzoic, resazurin… Các yếu tố này hiện diện trong môi trường ở nồng độ tương đối thấp từ 0.1-1 mg/L, nhưng ảnh hưởng nhiều đến hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn trong quá trình lên men. Các loại môi trường thường được sử dụng để nuôi cấy và nhân giống vi khuẩn Clostridium: Môi trường P2: là môi trường tối ưu cho tất cả các loài của Clostidium phát triển, được sử dụng làm môi trường giữ giống và lên men với các nồng độ glucose khác nhau. Thành phần Hàm lượng (g/L) Glucose 60 MgSO4.7H2O 20 MnSO4.H2O 1 FeSO4.7H2O 1 KCl 1 KH2PO4 50 K2HPO4 50 Ammonium acetate 220 p-aminobenzoic acid 0.1 Thiamin 0.1 Biotin 0.001 Dịch trích nấm men 1 Môi trường Tryptone-yeast extract-sucrose(TYS): Thành phần Hàm lượng (g/L) Sucrose 60 Na2SO4 0.18 K2HPO4 3.48 Dịch trích nấm men 5.0 Biotin 0.01 p-aminobenzoic acid 0.01 Tryptone 1.0 Antifoam C 0.5 ml Môi trường CAB: là môi trường được sử dụng làm môi trường giữ giống và lên men tối ưu cho loài Clostridium acetobutylicum Thành phần Hàm lượng (g/L) Glucose 50 Dịch trích nấm men 4 Tryptone 1 K2HPO4 0.7 KH2PO4 0.7 DL-asparagine 0.5 MgSO4.7H2O 0.1 MnSO4.H2O 0.1 NaCl 0.1 FeSO4.7H2O 0.015 resazuin 0.002 3.2.2. Điều kiện nuôi Nhiệt độ hoạt động của Clostridium nằm trong khoảng từ 29-37oC, tùy thuộc vào từng loài mà có nhiệt độ tối thích khác nhau.Clostridium acetobutylicum có nhiệt độ tối thích nằm trong khoảng 35-37 oC, trong khi đó đối với loài Clostridium beijerinckii lại là 31-32 oC và Clostridium saccharobutylicum là 30 oC. Đa số các quá trình nhân giống và lên men sử dụng vi khuẩn Clostridium acetobutylicum đều được duy trì ở 35 oC. pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và tạo sản phẩm của Clostridium. Khoảng pH tối thích của các loài thuộc giống Clostridium nằm trong khoảng từ 5.0-6.5, bất kì một sự thay đổi nào làm giảm pH dưới 4.5 đều có khả năng gây ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn. Đa số các môi trường ban đầu đều được chỉnh về pH=6.5, tuy nhiên cùng với quá trình sinh trưởng thì vi khuẩn lại sinh ra các hợp chất như axit butyric, propionic và acetic làm giảm pH môi trường. Vì vậy, cần kiểm soát và điều chỉnh pH trong suốt quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. 3.3. Các loài vi sinh vật được dùng trong sản xuất butanol Như đã giới thiệu ở trên, các loài có khả năng sinh tổng hợp butanol bao gồm bốn loài chính là: Clostridium acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum và Clostridium saccharoperbutylacetonicum. Clostridium acetobutylicum là loài có đặc tính di truyền khác biệt nhất và ít liên quan đến ba loài còn lại. Những chủng thuộc loài này phát triển tốt trên các môi trường cơ chất từ dịch thủy phân tinh bột nên được sử dụng phổ biến ở quy mô công nghiệp để sản xuất dung môi. Clostridium acetobutylicum là loài được nghiên cứu trong sản xuất dung môi nhiều nhất, nhiều chủng được phát triển từ loài này cho khả năng tổng hợp butanol khá cao. Cho đến nay, một trong số những kết quả lên men tốt nhất là từ chủng C. acetobutylicum PCSIR-10 có khả năng kháng butanol, sử dụng cơ chất là rỉ đường mía được thực hiện bởi Syed (1994). Theo đó, tổng nồng độ dung môi đạt được là 19.2 g/L với hiệu suất là 34%. Loài Clostridium beijerinckii liên quan nhiều đến hai loài C. saccharobutylicum và C. saccharoperbutylacetonicum. Cả ba được biết đến như là các vi sinh vật saccharolytic-sử dụng các loại đường làm cơ chất lên men và hầu hết các chủng lên men đường ở quy mô công nghiệp đều thuộc loài C. beijerinckii. Mặc dù C.acetobutylicum được nghiên cứu nhiều nhất trong sản xuất dung môi nhưng C. beijerinckii lại cho thấy nhiều ưu điểm và có tiềm năng trong việc ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp. C. beijerinckii có một khoảng pH tối thích rộng trong việc sinh trưởng và tạo dung môi. Bên cạnh đó C. beijerinckii là một đối tượng tiềm năng trong việc ứng dụng các kĩ thuật chuyển gene nhằm tạo ra các chủng có khả năng sử dụng đa dạng các nguồn carbohydrate (Ezeji, et al., 2004). Với C. beijerinckii, người ta cho rằng các chủng này có khả năng chịu được tác động của acid ở nồng độ cao nên thích hợp trong các quá trình lên men liên tục hơn so với các chủng từ C.acetobutylicum (theo Grube & Gapes, 2002; Zverlov và các cộng sự, 2006). Trong nghiên cứu của Ezeji và các cộng sự (2004), chủng C. beijerinckii BA101 sử dụng rất linh hoạt nhiều nguồn cơ chất khác nhau và cho nồng độ dung môi đạt từ 14.8-26.1 g/L với năng suất từ 37-50%. Có khá ít nghiên cứu về hai loài C. saccharobutylicum và C. saccharoperbutylacetonicum được sử dụng để lên men ABE. Shaheen và cộng sự (2000) đã tập hợp những chủng đã được sử dụng để lên men và nhận thấy rằng chúng phát triển tốt hơn trên môi trường glucose và rỉ đường mía so với trên môi trường dịch ngô. Kết quả lên men tốt nhất được thực hiện trên chủng C. saccharobutylicum BAS/B3/SW/336(S), khi sử dụng mật rỉ mía với nồng độ dường lên men là 6.5%. Nồng độ trung bình đạt 19.6g/L với hiệu suất 30%. Bảng 3: So sánh khả năng lên men của một số chủng đã được phân lập Chủng Môi trường/cơ chất ( 6% đường lên men) Nồng độ các dung môi (g/L) Hiệu suất ( % ) Năng suất ( g/L.h ) A:B:E C. acetobutylicum PCSIR-10b Rỉ đường 19.2 34.0 0.42 1.8:95.3:2.9 PCSIR-5b Rỉ đường 15.2 30.0 0.24 5.3:79:15.7 ATCC 4259a Rỉ đường 9.5 15.8 - - ATCC 824a Rỉ đường 7.8 13.0 - - ATCC 824d Glucose 20.6 42.0 0.58 20.6:66.5:26.2 C. beijerinckii BA 101c Glucose 24.2 42.0 0.34 17.8:81:1.2 BA 101c Rỉ đường 22.8 39.0 0.19 18.4:80.3:1.3 NCP P260a Rỉ đường* 21.9 33.4 - - NCP P260a Rỉ đường 18.9 31.5 - - C. saccharobutylicum BAS/B3/SW/336(S)a Rỉ đường* 19.6 30.0 - - NCP P108a Rỉ đường* 18.6 28.6 - - NCP P258a Rỉ đường 18.3 30.5 - - C. saccharoperbutylacetonicum N1-504a Rỉ đường 15.6 26.0 - - *: 6.5% các loại đường có thể lên men a: Shaheen và cộng sự (2000) b: Syed (1994) c: Ezeji và cộng sự (2004) d: Roffler và cộng sự (1987) CHƯƠNG 4: QUÁ TRÌNH LÊN MEN ACETON-BUTANOL-ETHANOL 4.1. Sự trao đổi chất trong quá trình lên men của vi khuẩn Clostridium Trong quá trình lên men của Clostridium, hai giai đoạn sinh trưởng riêng biệt xảy ra: giai đoạn acidogenic và giai đoạn solventogenic. Giai đoạn acidogenic xảy ra đầu tiên, khi Clostridium thực hiện quá trình lên men butyrat điển hình và phát triển trên môi trường cơ chất là tinh bột hoặc đường. Các sản phẩm chính trong giai đoạn này là butyrat (butyric acid), acetate (acid acetic), carbon dioxide và hydrogen. Ethanol và acetone được hình thành với một lượng nhỏ. Việc sinh ra các hợp chất có tính acid đã làm giảm pH của môi trường lên men xuống thấp, có thể làm chết tế bào vi khuẩn. Để tránh bị tiêu diệt, vi khuẩn đã bắt đầu một sự thay đổi chuyển hóa diễn ra ở cuối giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân. Điều này cũng đánh dấu sự kết thúc của giai đoạn acidogenic và bắt đầu giai đoạn solventogenic. Các acid bài tiết được sử dụng trong giai đoạn này và được chuyển đổi thành các sản phẩm trung tính, bao gồm aceton và butanol (theo tỷ lệ thông thường là 1:2). Sự chuyển đổi butyrate và acetate thành dung môi làm tăng pH trở lại, nghĩa là các tế bào có thể trở lại hoạt động trao đổi chất trong một thời gian dài hơn. Tuy nhiên, các dung môi này lại cũng gây ức chế các tế bào vi khuẩn, đặc biệt là butanol. Dung môi gây bất hoạt các protein màng tế bào và phá hủy các màng của tế bào, do đó có một giới hạn về nồng độ dung môi tối đa có thể đạt được trong quá trình lên men (khoảng 2% về khối lượng). Quá trình trao đổi chất diễn ra cụ thể theo sơ đồ như sau: Hình 3: Sơ đồ trao đổi chất trong quá trình lên men của Clostidium Quá trình tiền xử lý sinh khối chứa lignocellulosic hoặc thủy phân tinh bột được thực hiện nhờ các enzyme a-amylase, b-amylase, pullulanase, enzym glucoamylase, a-glucosidase do vi khuẩn tiết ra, (1,2). Sự thủy phân cellulose nhờ enzyme cellulase, b-glucosidase tạo ra glucose . Glucose được hấp thu bởi hệ enzyme phophotransf