Đề tài Ứng dụng của enzyme trong y học, trong phân tích, nghiên cứu

GIỚI THIỆU ĐỀ TÀI Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật, mà còn được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, kĩ thuật phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường. Cụ thể, trong bài tiểu luận này chúng em sẽ đề cập đến ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG Y HỌC, TRONG PHÂN TÍCH, NGHIÊN CỨU nhằm cung cấp thêm một số hiểu biết về vấn đề này. Trong quá trình làm tiểu luận, chúng em đã rất cố gắng trình bày những kiến thức kỹ thuật mới và có hệ thống. Tuy nhiên, chắc chắn không thể tránh khỏi sai sót. Chúng em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của cô để rút kinh nghiệm cho những lần sau. MỤC LỤC GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG Y HỌC II.1 Giới thiệu enzyme chữa bệnh. II.2 Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh. II.3 Ứng dụng trong chữa bệnh và sản xuất thuốc. ỨNG DỤNG ENZYME TRONG PHÂN TÍCH III.1 Sử dụng enzyme để phân tích, định lượng các chất III.2 Ứng dụng enzyme trong phân tích thực phẩm III.3 Điện cực enzyme không tan ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU MỞ RỘNG V.1 Ứng dụng khác của enzyme. V.2 Tình hình sử dụng enzyme trong nước và thế giới. KẾT LUẬN I. GIỚI THIỆU ENZYME: Enzyme là chất xúc tác cho phản ứng sinh hóa. Bản chất của enzyme là protein. Nhưng so với chất xúc tác cơ, enzyme có những đặc tính ưu việt hơn: Phản ứng thực hiện gần như có hiệu quả 100% và không kèm theo phụ phẩm thừa. Đồng thời có thể xảy ra nhiều phản ứng độc lập khác nhau, không bị rối bởi các sản phầm phụ. Vận tốc phản ứng nhanh hơn, cường độ xúc tác mạnh hơn. Điều kiện phản ứng ôn hòa, đại đa số xảy ra ở môi trường trung tính. Các phản ứng chịu sự điều hòa hợp lý và tiết kiệm nhất, tiêu tốn năng lượng là tối thiểu. Một đặc tính rất quan trọng nữa của enzyme là trong quá trình thực hiện phản ứng nó không bị phá hủy. Khi phản ứng xúc tác kết thúc, chúng được tự do và tiếp tục xúc tác các phân tử cơ chất mới. Chính vì vậy enzyme ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và kỹ thuật. Sau đây, chúng ta sẽ tìm hiểu sâu hơn về ứng dụng của enzyme trong y học, trong phân tích, nghiên cứu. II. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG Y HỌC II.1 Giới thiệu enzym chữa bệnh Enzym cũng như một số chất dùng trong chữa bệnh cho người và gia súc có những đặc tính không phù hợp chung như sau: Khối lượng phân tử lớn, khó qua màng tế bào. Dễ dàng bị phân huỷ trong đường tiêu hoá. Dễ bị mất hoạt tính sinh học do hoạt động ức chế của các chất hiện diện trong hệ dịch và trong mô. Có thể biểu hiện như một kháng nguyên. Tuy nhiên, enzym cũng có những đặc tính riêng, được sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh có hiệu quả. II.2 Ứng dụng của enzym trong chuẩn đoán bệnh II.2.1 Ứng dụng enzym trong xác định nồng độ cơ chất Nồng độ cơ chất được xác định theo hai phương pháp: - Phương pháp xác định điểm cuối (end-point methods) - phương pháp đo tốc độ phản ứng (measurement of reaction rate) Phương pháp xác định điểm cuối Nguyên tắc: khi cho enzym tác động vào cơ chất, cơ chất sẽ giảm và sản phẩm cuối sẽ tăng lên. Ta có thể xác định được những chỉ số này. Đối với nồng độ cơ chất thấp hơn giá trị của của hằng số Michaelis (Km), tốc độ phản ứng tuân theo phương trình sau: u = es x u/Km Thời gian cần cho kết thúc phản ứng phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và hằng số (Km) của enzym sử dụng. · Phương pháp xác định glucose với glucose-oxydase Trong phản ứng đầu tiên, glucose bị oxy hoá bởi glucose-oxydase (EC.1.1.3.4), tạo thành peroxide hydro theo phương trình sau: glucose + O2 + H2O glucose-oxidase 10 UI/ml gluconate + H2O2 Trong phản ứng thứ hai peroxide hydro, dưới tác dụng của enzym horse-radish peroxidase (EC.1.11.1.7) sẽ tạo màu theo phản ứng sau: H2O2 + chromogen horse-radish peroxidase màu + H2O Trong phân tích này, 2,2’-azino-bis (3-ethyl 2,3-dihydrobenzothiazol sulfonate (ABTS) ) được sử dụng như chromogen. · Phương pháp xác định urea Urea bị thuỷ phân bởi urease (EC.3.5.3.1) ở 0.7 UI/ml. Và amoniac được tạo thành khi cho enzym glutamate dehydrogenase (EC.1.4.1.3) có hoạt tính 6.2 UI/ml tác động. Urea + H2O 2NH3 + CO2 2-Cetoglutarate + 2NH4+ + 2NADH 2L-glutamate + 2NAD+ + 2H2O Phương pháp động học (kinetic methods) Phương pháp này chỉ xác định nồng độ cơ chất dưới giá trị Km · Xác định glucose: D–glucose + ATP D–glucose–6–phosphate + ADP D–glucose–6–phosphate + NADP+ D–glucono–d–lactose – 6 – phosphate + NADPH + H+ Ở phản ứng đầu, glucose được phosphoryl hóa bởi hexokinase(EC.2.7.1.1), sau đó glucose–6–phosphate bị hydrogen hóa bởi tác động của glucose–6–phosphate dehydrogenase (EC.1.1.1.49). Sự tạo thành NADPH sẽ được xác định bằng máy quang điện. · Xác định triglyceride: Triglyceride + 3 H2O glycerol + 3 acid béo Glycerol + ATP glycerol–3–phosphate + ADP ADP + phosphoenolpyruvate ATP + pyruvate Pyruvate + NADH + H+ L–lactate + NAD+ Chất béo được thủy phân bằng lipase(EC.3.1.1.3) carboxylesterase (EC.3.1.1.1) tạo ra glycerol và sẽ được phosphoryl hóa bởi glycerol kinase(EC.2.7.1.30), ADP tạo thành sẽ tiếp tục được phosphoryl hóa đến ATP với phosphoenolpyruvate và pyruvate kinase(EC.2.7.1.40), cuối cùng pyruvate được hydrogen hóa bởi L–lactate dehydrogenase (EC.1.1.1.27) và NADH giảm dần. II.1.2 Xác định hoạt tính của enzym Xác định hoạt tính của alkaline phosphatase (EC.3.1.3.1) 4–nitrophenylphosphate + H2O phosphate + 4–nitrophenolate Ở pH tối ưu 9.8 sản phẩm sẽ phân tán và tốc độ phản ứng sẽ tăng theo độ hấp thụ ở bước sóng 405 nm. Xác định hoạt tính của creatine kinase (EC.2.7.3.2) creatine phosphate + ADP createne + ATP ATP tạo thành trong phản ứng này nhờ xúc tác của enzym creatine kinase. II.1.3 Thực hành miễn dịch Enzym được sử dụng ở đây để xác định hỗn hợp kháng nguyên-kháng thể, tạo thành trong phản ứng miễn dịch. Ta có thể sử dụng máy so màu quang điện, hùynh quang để xác định phản ứng. Alkaline phosphatase Enzym này được ứng dụng trong phản ứng miễn dịch. Để xác định hoạt tính alkaline phosphatase có thể sử dụng máy huỳnh quang với 4–methylumbelliferyphosphate làm cơ chất. enzym này thường được sử dụng với hoạt tính 2500UI/mg ở nhiệt độ 370C b-galactosidase (EC.3.2.1.23) Hoạt tính của b-galactosidase được đo bằng máy quang điện với 4-methylumbelliferyl-b-galactosidase hoặc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-galactoside. Horseral peroxidase (EC.1.11.1.7) Enzym này chứa hai đến ba nhóm họat động aminE trong phân tử và chứa 12-14.5% carbohydrate. Xác định hoạt tính enzym này bằng máy quang điện với cơ chất thường sử dụng là chromogen-2,2’-azinobis hay 3-ethylbenzothiazoline-sulfonate (ABTS) Trong miễn dịch người ta thường sử dụng cơ chấtlà 3,3’ hay 5,5’-tetramethyl benzidine. II.3 Ứng dụng trong chữa bệnh và sản xuất thuốc: Hiện nay, enzym được sử dụng chủ yếu chữa các bệnh như sau: Enzym như chất cho thêm vào cơ thể để chữa bệnh kém tiêu hoá. Enzym được sử dụng như chất làm sạch vết thương và làm lành vết thương. Enzym được sử dụng trong các phản ứng miễn dịch. Dùng enzyme làm thuốc ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làmthuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong daliễu và mỹ phẩm… Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trườngdinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất khángđộc… Ngoài ra người ta c.n dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chếcác huyết thanh kháng độc để chữa bệnh. Amylase được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C,ATP, carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa. Phát hiện enzyme giúp điều trị bệnh Alzheimer Các nhà khoa học Mỹ vừa phát hiện một enzyme có thể chữa lành các tế bào não bị bệnh Alzheimer - một chứng bệnh mất trí nhớ. Nhóm nghiên cứu tại Trường ĐH Columbia đặt tên cho enzyme này là Uch-L1. Alzheimer là căn bệnh ăn mòn trí nhớ con người. Theo nhóm nghiên cứu, não người bị tác động bởi bệnh này có khuynh hướng giảm Uch-L1. Trong nghiên cứu của mình, nhóm đã tiêm Uch-L1 vào não của chuột thí nghiệm bị bệnh Alzheimer. Kết quả họ phát hiện enzyme này đã giúp trí nhớ của loài gặm nhấm này phục hồi. Điều đặc biệt là enzyme này không tiêu diệt các protein amyloid beta bám ở não - được cho là nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer - mà làm cho nó trở nên bình thường và không có hại cho trí nhớ. Theo nhà nghiên cứu Ottavio Arancio, điều này rất quan trọng bởi protein amyloid beta giữ một vai trò quan trọng trong cơ thể. Hiện các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu chuyên sâu hơn trước khi đưa enzyme này vào thử nghiệm ở con người. Dù vậy, họ tỏ ra rất lạc quan bởi hiệu quả điều trị của nó. Tính đến nay đã có hàng triệu người trên thế giới mắc bệnh Alzheimer, trong đó chỉ riêng tại Mỹ có 4,5 triệu bệnh nhân, và số lượng người bệnh dự kiến sẽ bùng nổ trong vài thập kỷ tới khi số người già tăng lên, trong khi một số loại thuốc điều trị hiện có hầu như ít có tác dụng. Kết quả nghiên cứu này có thể giúp các nhà khoa học phát triển loại thuốc mới điều trị bệnh Alzheimer hiệu quả hơn. Nhận dạng enzym chống dị ứng nặng Một nghiên cứu của Canada vừa khẳng định rằng nồng độ của một enzym trong máu ảnh hưởng đến tính nghiêm trọng của các phản ứng dị ứng. Vai trò của enzym này từng được chứng minh ở loài động vật, nhưng nghiên cứu mới trên lần đầu tiên khẳng định hiện tượng này ở người. Các nhà nghiên cứu thuộc các trường Đại học Toronto và Manitoba đã chứng minh rằng những người có nồng độ enzym acyl-hydrolase PAF trong máu thấp bị phản ứng dị ứng nặng hơn so với những người có nồng độ enzym này thấp hơn. Theo tác giả nghiên cứu Peter Vadas, enzym này tiêu hủy một hóa chất được gọi là thành phần hoạt hóa tiểu cầu. Hóa chất này được hình thành trong quá trình phản ứng dị ứng. Những người có nồng độ enzym acyl-hydrolase PAF thấp không thể làm trung hòa hóa chất PAF nhất để ngăn ngừa phản ứng dị ứng nặng. Phát hiện này có thể giúp điều chế những loại thuốc chống dị ứng do thức ăn gây nguy cơ chết người tiềm ẩn như đậu phộng, các loại hải sản, hay một số phản ứng do thuốc hoặc vết chích côn trùng. III. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG PHÂN TÍCH: III.1 Sử dụng enzyme để phân tích, định lượng các chất: Có thể xác định các chất đặc biệt với hàm lượng rất thấp và bị lẫn với các chất tương tự về mặt hóa học, mà với phương pháp hóa học khó lòng xác định định được chính xác. Có thể phân tích các chất không bền, sử dụng enzyme để phân tích có thể tiến hành ở những điều kiện nhẹ nhàng về pH ( gần trung tính), nhiệt độ ( gần nhiệt độ phòng). Có thể sử dụng enzyme để định lượng cơ chất, coE, các chất hoạt hóa, các chất kìm hãm enzyme. III.1.1 Những nguyên tắc chung khi sử dụng enzyme để phân tích: Xác định cơ chất enzyme: thông qua việc xác định sản phẩm được tạo thành dưới tác dụng của enzyme. Do đó phải tạo điều kiện như thế nào để toàn bộ cơ chất được chuyển hóa thành sản phẩm, và co sự phụ thuộc tuyến tính giữa vận tốc đầu phản ứng với nồng độ chất cần phân tích, cụ thể như sau: Nồng độ enzyme phải đủ cao. Nồng độ cơ chất đủ thấp để đảm bảo phản ứng tiến hành là pản ứng bậc một, chỉ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất cần xác định. Khi cần thiết phải thử với các nồng độ cơ chất khác nhau để lựa chọn nồng độ thích hợp đạt yêu cầu phân tích. Nếu sử dụng enzyme cần coE thì nồng độ coE phải đủ lớn để đảm bảo không làm thay đổi đặc tính của phản ứng bậc một. Phải đảm bảo sản phẩm phản ứng ( hoặc đồng sản phẩm phản ứng, ví dụ NADPH, NADH đối với cá phản ứng trong đó NADP+ hoặc NAD+ là cơ chất hoặc cofactor) hoàn toàn không có mặt khi phản ứng chưa bắt đầu. Nếu như vậy thì phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ cơo chất ban đầu ( ví dụ NAD+ hoặc NADP+) mà ta cần phân tích, và có thể đo trực tiếp sản phẩm được tạo thành ( đo độ hấp thụ của NADH ở 340 nm, vì NAD+ hoặc NADP+ không hấp thụ ở bước sóng này) để tính nồng độ cơ chất ban đầu. Nói chung việc sử dụng enzyme để định lượng cơ chất của nó được tiến hành thuận lợi khi sản phẩm của phản ứng có thể được định lượng dễ dàng. III.1.2 Một số ví dụ: Xác định cơ chất sử dụng amylase (sau đó kết hợp với thủy ngân bằng acid) để định lượng tinh bột sẽ cho kết quả chính xác hơn khi dùng acid (vì một số polysaccharide khác như hemicellululose cũng bị thủy phân bởi acid ở các điều kiện giống với tinh bột). Xác định coE, vì coE có vai trò như là chất đồng cơ chất nên có thể định lượng coE theo cách hoàn toàn giống như định lượng cơ chất. Xác định chất hoạt hóa enzyme: có thể sử dụng enzyme để định lượng chất hoạt hóa của nó trong trường hợp nó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa vận tốc đầu phản ứng với một khoảng nồng độ thấp của chất hoạt hóa, ở nồng độ enzyme, cơ chất và nồng độ coE giữ cố định khi tiến hành phản ứng. Ở nồng độ chất hoạt hóa cao, toàn bộ phân tử enzyme được hoạt hóa, vận tốc đầu phản ứng (vo) đạt cực đại. Lập đồ thị chuẩn biểu diễn ảnh hưởng của chất hoạt hóa đến v, từ đó tính nồng độ của chất hoạt hóa trong dung dịch phân tích. V0 Nồng độ chất hoạt hoá Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của v0 vào nồng độ chất hoạt hoá Nồng độ E,S và coE (nếu có) giữ cố định Dựa vào đồ thị ta thấy nên pha loãng dung dịch có chứa chất hoạt hóa cần phân tích sao cho vo nằm trong phần thẳng của đường biểu diễn để có thể có được kết quả phân tích chính xác. Ví dụ: Mn2+ là chất hoạt hóa isocitrate dehydrogenase, sử dụng enzyme này có thể xác định chính xác hàm lượng Mn2+ ở nồng độ rất thấp. Xác định các chất kìm hãm enzyme, tiến hành xác định ở những điều kiện đã nêu giống như khi xác định chất hoạt hóa, lập đồ thị chuẩn với các nồng độ I khác nhau. Tiến hành xác định chất kìm hãm (I) trong dung dịch nghiên cứu, đối chiếu với đồ thị chuẩn và tính hàm lượng I trong mẫu nghiên cứu. Có thể lập đồ thị chuẩn theo 2 cách: vo đối với [I], hoặc tính % bị kìm hãm theo sự tăng nồng độ I. Đôi khi người ta cũng dùng I50 để biểu diễn nồng độ các chất kìm hãm làm giảm 50% hoạt độ ở những điều kiện xác định. Ví dụ: sử dụng cacboxyl esterase của gan để định lượng fluoride trong dung dịch có lượng lớn phosphate ( vì phosphate ảnh hưởng đến việc xác định chính xác fluoride khi dùng phương pháp hóa học). Nguyên lý thử như sau: enzyme acetylcholinesterase (AchE) xúc tác thủy phân cơ chất acetylcholin thành cholin và axetic. Acid acetic sẽ phản ứng với chất chỉ thị màu màu vàng. Nếu mẫu phân tích có thuốc trừ sâu lẫn hữu cơ, cacbamat sẽ kìm hãm hoạt động của AchE, hàm lượng acid acetic giảm, màu sẽ thay đổi. Dựa vào sự đổi màu so với mẫu đối chứng (không có thuốc trừ sâu) hoặc dựa vào thang màu chuẩn có thể định tính hoặc bán định lượng thuốc trừ sâu trong mẫu phân tích. Nếu enzyme bị kìm hãm đặc hiệu, nhạy với một chất nào đó, có thể dùng enzyme để phát hiện và định lượng chất đó. Ví dụ: sử dụng acetylcholineesterase để phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu cơ. Các chất độc thần kinh,… Do enzyme có thể bị kìm hãm hoặc hoạt hóa bởi nhiều chất khác như ion kim loại do đó khi sử dụng enzyme để định lượng các chất cần lưu ý đến các chất này mới có kết quả chính xác được. %Kìm hãm 100 Không thuận nghịch V0 Thuận nghịch Thuận nghịch Không thuận nghịch a) b) [I] [II] Lập đồ thị chuẩn để xác định chất kìm hãm enzyme trong dung dịch nghiên cứu vo đối với [I] % hoạt độ bị kìm hãm ở các chất [I] khác nhau. Vo vận tốc đầu phản ứng không có I, voi vận tốc đầu phản ứng có, xác định ở cùng điều kiện giống nhau. Đồ thị trên cũng cho thấy: khi sử dụng enzyme để định lượng các chất kìm hãm, cần pha loãng dung dịch sao cho có được sự phụ thuộc tuyến tính giữa vận tốc với nồng độ chất kìm hãm (đoạn đầu của đường biểu diễn). Các I không thuận nghịch, theo định nghĩa sẽ làm mất hoàn toàn (kìm hãm 100%) hoạt độ enzyme khi nồng độ của nó đủ lớn, còn đối với chất I thuận nghịch thì dù nồng độ cao bao nhiêu cũng không kìm hãm 100% được. III.2 Ứng dụng của enzyme trong phân tích thực phẩm: III.2.1. Xác định cacbohydrate Trong thực phẩm, cacbohydrate chieám khối lượng lớn và đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng. Các loại đường là những đối tượng được phân tích thường xuyên. ôGlucose : được xác định bằng phương pháp enzym hexokinase. Phản ứng của quá trình đó xảy ra như sau: D-glucose + ATP hexokinase ADP + glucose-6-phosphate glucose-6-phosphate + NADP+ glucose-6-phosphate dehydrogenase D-glucose-6-phosphate + NADPH + H+ ôFructose : enzym hexokinase cũng tác động lên fructose. Ta có thể xác định fructose sau khi xác định glucose. D-glucose + ATP ADP + fructose-6-phosphate fructose-6-phosphate glucose phosphate isomerase glucose-6-phosphate ô Galactose : được xác định theo phản ứng sau D-galactonic acid + NADH + H+ galactose dehydrogenase D-galactose + NAD+ ô Mannose : xác định mannose tự do theo phương trình phản ứng sau D-mannose + ATP hexokinase ADP + mannose-6-phosphate mannose-6-phosphate phosphomannose isomerase fructose-6-phosphate ô Saccharose : thường không có trong tế bào động vật. Saccharose + H2O P–fructosidase D-glucose + D-fructose ô Maltose : xác định maltose theo phương trình phản ứng sau Maltose + H2O a-glucosidase 2-D-glucose ôLactose : thường có trong sữa. Lactose + H2O b-galactosidase D-galactose + D-glucose ôRafinose : rafinose có trong củ cải đường. Rafinose + H2O a-galactosidase D-galactose + saccharose ôTinh bột : tinh bột có nhiều trong thực vật và có cả ở một số loài vi sinh vật. Xác định tinh bột theo phương trình phản ứng sau. Tinh bột + (n-1)H2O amyloglucosidase n D-glucose III.2.2. Xác định acid hữu cơ Acid hữu cơ và muối của chúng có nhiều trong nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm. Chúng đóng vai trò rất quan trọng trong sinh lý người, động vật, thực vật và vi sinh vật. Chúng còn được tạo ra do quá trình lên men. ôAcetic acid : Thuộc nhóm acid bay hơi, người ta sử dụng enzym để xác định acetic acid. Acetate có nhiều trong vang. Acetate + ATP + CoA acetyl-CoA-synthetase Acetyl-CoA + AMP + Pyrophosphate Acetyl-CoA + oxaloacetate + H2O citrate synthetase citrate + CoA L-malate + NAD+ L-malate dehydrogenase oxaloacetate + NADH + H+ Phản ứng sau cùng được xem như phản ứng chỉ thị. ô Ascorbic acid : giống như vitamin, ascorbic acid đóng vai trò sinh học lớn trong sinh lý người và động vật. Chúng được sử dụng như chất phụ gia trong thực phẩm. Người ta sử dụng enzym để xác định ascorbic acid. L-ascorbic acid (XH2) + MTT PMS dehydro ascorbic acid (X) + formazan + H+ PMS: 5-methylphenazinium sulfate MTT: 3-(4,5 dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Ascorbate được oxy hóa tiếp: L-ascorbic acid ascorbate oxidase dehydro ascorbic acid + H2O Người ta thường xác định ascorbic acid trong nước quả, trong rau, quả, trong sữa, trong sản phẩm thịt. dehydro ascorbic acid + dithiothreitol (chất khử) L-asco