Đề tài Xác định thành phần trái mướp đắng (momordica charantina Linn) thuộc họ bầu bí bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

MỤC LỤC Trang phụ bìa ...................................................................................................... i Lời cam đoan...................................................................................................... ii Lời cảm ơn ........................................................................................................ iii Mục lục .............................................................................................................. 1 Danh mục các từ viết tắt ..................................................................................... 3 PHẦN MỞ đẦU ................................................................................................ 4 PHẦN NỘI DUNG ........................................................................................... 6 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây mướp đắng ......................................................... 6 1.1.1. Mô tả cây mướp đắng .............................................................................. 6 1.1.2. Phân bố - Sinh thái ................................................................................... 7 1.1.3. Tính chất và công dụng chữa bệnh của các bộ phận của cây mướp đắng trong dân gian ............................................................................................ 8 1.2. Các nghiên cứu hóa học về trái mướp đắng ........................................... 10 1.2.1. Các nghiên cứu trong nước .................................................................... 10 1.2.2. Các nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 10 1.3. Cơ sở lý thuyết của các phương pháp phân tích .................................... 11 1.3.1. Phương pháp sắc kí................................................................................. 11 1.3.1.1. Phương pháp phân tích bằng sắc kí cột ................................................ 13 1.3.1.2. Phương pháp phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (TLC)............................ 16 1.3.1.3. Phương pháp phân tích bằng sắc kí khí (GC) ....................................... 18 1.3.1.4. Phương pháp phân tích bằng sắc ký khí – khối phổ (GC/MS) .............. 19 1.3.2. Phương pháp phân tích bằng phổ hồng ngoại (IR)................................... 20 1.3.3. Phương pháp phân tích bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ................. 21 CHƯƠNG 2: KĨ THUẬT THỰC NGHIỆM 2.1. Dụng cụ và hóa chất .............................................................................. 23 2.1.1. Dụng cụ ................................................................................................. 23 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................. 23 2.2. Phương pháp thực nghiệm ...................................................................... 23 2.2.1. Thu mẫu và xử lí mẫu ............................................................................. 23 2.2.2. Xác định độ ẩm nguyên liệu ................................................................... 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1. định tính thành phần trái mướp đắng tươi ........................................... 25 3.1.1. điều chế cao EtOAc từ trái mướp đắng tươi ......................................... 25 3.1.2. Khảo sát sự hiện diện các thành phần hợp chất hữu cơ trong trái mướp đắng tươi ................................................................................................ 26 3.1.2.1. Khảo sát sự hiện diện của Sterol .......................................................... 26 3.1.2.2. Khảo sát sự hiện diện của Tanin........................................................... 28 3.1.2.3. Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid ................................................... 29 3.1.2.4. Khảo sát sự hiện diện của Glycosid...................................................... 30 3.2. định tính thành phần bột trái mướp đắng khô ...................................... 31 3.2.1. Khảo sát sự hiện diện các thành phần hợp chất hữu cơ trong bột trái mướp đắng khô................................................................................................. 31 3.2.1.1. Khảo sát sự hiện của Sterol .................................................................. 31 3.2.1.2. Khảo sát sự hiện của Tanin .................................................................. 31 3.2.1.3. Khảo sát sự hiện của Flavonoid ........................................................... 32 3.2.1.4. Khảo sát sự hiện của Glycosid ............................................................. 32 3.2.2. điều chế cao EtOAc từ bột trái mướp đắng khô ...................................... 33 PHẦN KẾT LUẬN – đỀ XUẤT ..................................................................... 38 1. Kết luận ........................................................................................................ 38 2. đề xuất ......................................................................................................... 38 Tài liệu tham khảo ............................................................................................ 39 DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT EtOAc : Etyl axetat SKLM : Sắc kí lớp mỏng PE : Ete dầu hỏa PHẦN MỞ đẦU 1. Lý do chọn đề tài: Ngày nay, với sự tiến bộ của con người cùng với sự phát triển vượt bậc của ngành khoa học công nghệ đã tạo ra hàng loạt các dược phẩm có nguồn gốc nhân tạo với tính năng chữa bệnh rất công hiệu và mang lại kết quả rất nhanh chóng. Nhưng đằng sau đó còn có những hạn chế, tác dụng phụ…gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Do vậy khuynh hướng quay về với thiên nhiên sử dụng những loài thực vật vừa có giá trị dinh dưỡng và dược tính chữa bệnh đang ngày càng được quan tâm. Trong đó trái mướp đắng (hay còn gọi là trái khổ qua) được xem là một loại thực vật hội đủ các nhu cầu thiết yếu của con người hơn hẳn các loại thực vật khác trong tự nhiên. Trong cuộc sống hàng ngày, trái mướp đắng được con người sử dụng như một loại thực phẩm thông dụng gần như không thể thiếu trong mỗi gia đình. Trong y học dược tính được của mướp đắng ứng dụng điều trị các loại bệnh như: tiểu đường, viêm phổi, sốt cao…Theo các nghiên cứu gần đây thì thành phần trong trái mướp đắng còn có tính diệt khuẩn cao và có cả hiệu lực chống ung thư. Vào năm 1990, Liên Hiệp Quốc đã chọn mướp đắng là một trong sáu cây thuốc trị bệnh tiêu biểu trên thế giới. Nước ta ở vùng nhiệt đới, thực vật phát triển quanh năm nên việc nghiên cứu trái mướp đắng có nhiều triển vọng nhưng còn nhiều hạn chế về trình độ khoa học và phương pháp nghiên cứu về mặt hóa học. Với mong muốn tìm hiểu một số hoạt chất có trong trái mướp đắng nhằm nâng cao hiệu quả nghiên cứu về tầm quan trọng của mướp đắng trong công nghệ hóa học và dược phẩm đã thúc đẩy người nghiên cứu chọn nghiên cứu đề tài “Xác định thành phần trái mướp đắng (momordica charantina Linn) thuộc họ bầu bí bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng”. 2. Mục đích nghiên cứu: đề tài nghiên cứu này nhằm xác định các thành phần sẵn có trong quả mướp đắng bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng: + Thành phần dinh dưỡng. + Thành phần hóa học. 3. đối tượng nghiên cứu: đề tài có đối tượng nghiên cứu như sau: + Nguyên liệu: Trái mướp đắng tươi (xanh). + Phương pháp sắc kí lớp mỏng. 4. Phạm vi nghiên cứu: - Do nội dung kiến thức khá rộng, cũng như khả năng nghiên cứu của bản thân nên đề tài cần xoáy sâu vào xác định thành phần của quả mướp đắng bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng. - đề tài thực hiện nghiên cứu quả mướp đắng ở một số địa bàn và tiến hành phân tích thực nghiệm tại phòng thí nghiệm. 5. Phương pháp nghiên cứu: - Phương pháp nghiên cứu tài liệu. - Phương pháp quan sát. - Phương pháp thực nghiệm: + Dùng phương pháp sắc kí cột để ly trích dịch chiết. + Dùng phương pháp sắc kí lớp mỏng để xác định thành phần. PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA VẤN đỀ 1.1. Giới thiệu chung về cây mướp đắng: - Tên Khoa Học: Momordica Charantia Linn. - Tên gọi khác: Khổ qua, lương qua, cẩm lệ chi. - Tên nước ngoài: Carilla fruit, balsam apple, balsam pear, bitter ground (Anh). - Thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae). 1.1.1. Mô tả cây mướp đắng: Cây mướp đắng là một loại dây leo, thân màu xanh lợt có góc cạnh, ở ngọn hơi có lông tơ, cây mướp đắng có đời sống khoảng một năm. Kích thước dây mướp đắng khoảng bằng ngón tay út, dây bò từ 5 - 7m, dây leo được nhờ nhiều tua cuốn. Lá đơn nhám, mọc so le, dài 5 - 10cm, rộng 4 - 8cm, phiến lá chia 5 - 7 thùy hình trứng, mép có răng cưa đều, mặt dưới lá có màu xanh nhạt hơn mặt trên, gân lá nổi rõ ở mặt dưới, phiến lá có lông ngắn. Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, hoa đực, hoa cái cùng gốc, có cuống dài, cánh hoa màu vàng nhạt, đường kính của cánh hoa chừng 2cm, hoa đực có ống đài ngắn, tràng gồm 5 cánh mỏng hình bầu dục, nhị (nhụy) rời nhau. Hoa cái có đài và tràng giống với hoa đực. Trái hình thoi dài 8 - 15cm, gốc và đầu thon nhọn, trên mặt vỏ quả có nhiều u sần sùi nổi lên to nhỏ không đồng đều. Trái chưa chín có màu xanh, khi chín có màu vàng hồng. Vì thế ở Trung Quốc mướp đắng (khổ qua) còn có tên là hồng dương, hồng cô nương. Khi chín, trái tét từ đầu, tách ra làm 3 phần. Trái mướp đắng có nguồn vitamin C khá phong phú cùng với nhiều loại axit cần thiết cho cơ thể con người. Trái mướp đắng khi còn xanh chứa 188g vitamin C trong 100g phần ăn được, nếu để chín tỷ lệ vitamin C còn một nữa. Trái mướp đắng khi nấu mất đi 40% lượng vitamin này. Ở Ấn độ và Philipin người ta còn dùng ngọn non và lá non của dây mướp đắng để làm rau ăn. Hạt mướp đắng dẹt dài 13 - 15mm, rộng 7 - 8mm, trông gần giống hạt bí ngô nhưng có khứa và có màng bao bọc, quanh hạt khi chín màng có màu đỏ máu như màng gấc. Hình 1.1.Cây và trái mướp đắng tươi Hình 1.2. Cây, trái và hoa mướp đắng 1.1.2. Phân bố - Sinh thái: Chi Momordica.L có tổng số 45 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở khắp các châu lục. Ở Châu Á có 5 - 7 loài. Trên thế giới mướp đắng có mặt ở hầu hết các nước nhiệt đới từ châu Phi sang Châu Á và Châu Mỹ. Có tài liệu cho rằng cây mướp đắng được trồng lần đầu tiên từ thời xa xưa ở Ấn độ, Nam Trung Quốc và Châu Phi. Cùng với việc buôn bán nô lệ cây được du nhập sang Châu Mỹ. Ở Ấn độ, Châu Phi vẫn đang tồn tại quần thể mướp đắng mọc hoang dại và trồng trọt với nhiều thứ khác nhau. Quần thể mướp đắng trồng đã trở nên rất phong phú với các giống cây đa dạng được tạo ra trong quá trình chọn giống và lai tạo. Mướp đắng cũng thấy nhiều ở các tỉnh miền nam Trung Quốc như : Phúc Kiến, Quảng đông, Quảng Tây, Giang Tô, Triết Giang…Tại Ấn độ, cũng như một số nước ở đông Nam Á như Mã Lai, Thái Lan, Philipin…cũng có mướp đắng. Nói chung mướp đắng được trồng nhiều ở các nước thuộc khí hậu nhiệt đới như: các nước đông Nam Á, đông Phi Châu, các nước ở Nam Mỹ. Ở Việt Nam cây được trồng ở khắp nơi trong nước ta từ Nam đến Bắc, hầu hết các tỉnh từ đồng bằng, trung du đến miền núi để lấy trái làm thực phẩm. Mướp đắng thường được trồng xen với bầu, bí, mướp… Mướp đắng ở Việt Nam hiện nay bao gồm nhiều giống. Theo Phan văn Thanh và Nguyễn Tập, 1999, căn cứ vào hình dạng, kích thước và màu sắc chia thành 3 nhóm giống khác nhau. Cây có biên độ sinh thái tương đối rộng, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng từ 20 - 240C, hoặc cao hơn. Cây sinh trưởng nhanh trong mùa mưa ẩm, ra hoa và quả sau 7 - 8 tuần gieo trồng. Hoa thụ phấn nhờ côn trùng. Sau khi trái già, cây tàn lụi và kết thúc vòng đời sau 4 - 5 tháng tồn tại. 1.1.3. Tính chất và công dụng chữa bệnh của các bộ phận của cây mướp đắng trong dân gian: Hầu hết các bộ phận của cây mướp đắng đều có công dụng chữa bệnh. Trong Y Học Cổ Truyền thì người ta đã sử dụng các thành phần của cây mướp đắng để chữa một số bệnh như sau: Rễ Rễ mướp đắng dùng để trị lị. Tại Ấn độ, dịch rễ (cũng như lá và quả) mướp đắng được dùng để trị bệnh đái đường tốt, do có tác dụng làm giảm đường glucose trong máu. Rễ mướp đắng có thể trị bệnh gan và ta có thể áp dụng ở mọi dạng bệnh. Thân (dây) Thân cây mướp đắng dùng để trị một số bệnh như: uống xổ lòng (dùng cho phụ nữ uống sau khi sinh), bệnh gan vàng da. Lá Lá có vị đắng, tính mát. Lá non ăn trị bệnh nóng bức trong mình. Giã lá, vắt nước, thêm chút muối uống trị bệnh nóng mê man. Chữa chứng “ đơn độc sưng đỏ, mụt nhọt, đau nhức”, chữa rắn cắn, giúp cơ thể mau bình phục khi mệt mỏi, háo khát, hồi hộp, đi đường xa vất vả, lao động quá sức...có thể dùng lá mướp đắng non nấu canh ăn. Ngoài ra lá cây mướp đắng còn chữa được nhọt độc, sưng tấy, vết thương nhiễm độc...Dịch lá mướp đắng còn có tính chất hơi nhuận trường, là hạ sốt, diệt giun. Hoa Hoa có công dụng chữa dạ dày, chữa đau mắt và chữa chứng lị cấp tính. Trái Ngoài công dụng làm rau ăn, trái mướp đắng còn được dùng để trị nhiều bệnh như: trị ho, sốt, kiết lị, làm lành da non các vết thương các vết loét ác tính. Trái mướp đắng có tính hàn, mát không độc. Lúc còn xanh nó có tính giải nhiệt, làm tiêu đờm, nhuận trường, bổ thận, lợi tiểu, làm bớt đau khớp xương. Khi chín, trái mướp đắng có tính bổ thận, dưỡng huyết. Ở Trung Quốc trái mướp đắng còn dùng để trị đột quị tim, bệnh sốt, khô miệng, viêm họng. Ở Ấn độ, dịch trái mướp đắng dùng để trị rắn cắn. Ở Thái Lan dịch quả dùng để trị bệnh về gan và lá lách, đặc biệt làm hạ đường máu ở bệnh nhân tiểu đường. Hạt Hạt có chất béo, vị đắng, hơi ngọt, tính ấm, thanh nhiệt, giải độc, giải cảm, lợi tiểu, chữa ho viêm họng, rắn cắn, trẻ động kinh. Theo “Từ điển Cây Thuốc Việt Nam” của Võ Văn Chi thì hạt mướp đắng có tính bổ dương, tráng khí, trẻ em lên cơn co giật do sốt cao hoặc kinh phong. Theo sách “ Những cây thuốc Việt Nam và vị thuốc Việt Nam ” của đỗ Tất Lợi thì hạt mướp đắng dùng với liều 3 gam hạt khô, dưới dạng sắc lấy nước uống, có thể chữa ho, làm hạ sốt. Ngoài ra, theo một số nghiên cứu gần đây, cho biết các hoạt chất trong mướp đắng còn có tác dụng chống thụ thai, chống ung thư (do sự ức chế tổng hợp protein), làm hạ huyết áp, chống virus HIV… 1.2. Các nghiên cứu hóa học về trái mướp đắng: 1.2.1. Các nghiên cứu trong nước: - Ths.Võ Hồng Thái đã nghiên cứu Khảo sát thành phần Triterpen Glycosid trong hạt mướp đắng, Momordica Charantia L, họ bầu bí (Cucurbitaceae). - Theo tạp chí Dược liệu, tập 6, số 2 + 3/2001, nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, đoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng, Lê Minh Phương đã Nghiên cứu thành phần hóa học cây mướp đắng. Nhóm này chứng minh tác dụng hạ đường huyết của cây mướp đắng trên thỏ gây gây đái tháo đường là do sự hiện diện của các glucosid có trong trái mướp đắng. - Một số kết quả nghiên cứu bước đầu về mặt thực vật của cây mướp đắng trồng ở Việt Nam của nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Nguyễn Tập. 1.2.2. Các nghiên cứu trên thế giới: - Theo Yumiko Kimura, Toshihidro Akihisa, Motohiko Ukiya của trường đại học Nihon Nhật Bản đã nghiên cứu Dịch chiết của trái mướp đắng từ metanol và xác định dựa trên cơ sở phương pháp phổ. - Theo nhóm nghiên cứu của trường đại học Deakin ở Australia Phân tích thành phần hóa học của quả mướp đắng cho thấy dịch chiết của quả mướp đắng trong CHCl3 - Metanol có chứa lipid, axit béo, amino axit, protein, chất khoáng. - Theo ông Hikaru Okabe và các cộng sự của ông đã Cô lập và nhận danh được một số triterpen glycoside từ quả và hạt của cây mướp đắng. 1.3. Cơ sở lý thuyết của các phương pháp phân tích: 1.3.1. Phương pháp sắc kí: Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) là người đã đặt nền móng phát minh ra kĩ thuật sắc kí, vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. Chữ sắc trong sắc kí có nghĩa là màu, nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn tiếp tục được dùng dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc. Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc kí phân bố. Kĩ thuật sắc kí phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc kí Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau. đồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc kí cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau. - Phương pháp sắc kí là một trong các kĩ thuật hóa học phân tích dùng để tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động khi cho pha động đi xuyên qua pha tĩnh. Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong “pha động” thường là do dòng chảy của dung môi, di chuyển qua “pha tĩnh”, pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau chúng sẽ được tách ra khỏi nhau theo thời gian khác nhau. Sắc kí cũng là quá trình trao đổi chất như các phương pháp hóa lí khác: chưng cất, chiết, kết tinh…nhưng khác với phương pháp khác đó ở chỗ sự phân chia sắc kí được thực hiện do quá trình hấp phụ - giải hấp phụ được lặp đi lặp lại trong suốt quá trình tách. - Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào hiện tượng hấp phụ của các chất hữu cơ trên chất hấp phụ (trong phương pháp này chất hấp phụ gọi là pha tĩnh và tính tan của chúng trong dung môi hữu cơ gọi là pha động khi đi qua chất hấp phụ). Sự hấp phụ phụ thuộc vào cấu tạo phân tử của chất hấp phụ, theo nguyên tắc chất phân cực hấp phụ chất phân cực và ngược lại chất không phân cực hấp phụ chất không phân cực. độ tan của chất hữu cơ trong dung môi phụ thuộc vào cấu trúc của chất và dung môi. Tùy thuộc vào cách thức thực hiện, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau như: - Sắc kí khí - Sắc kí lớp mỏng - Sắc kí cột - Sắc kí trao đổi ion - Sắc kí giấy - Sắc kí lỏng cao áp Khi tiến hành sắc kí thường xảy ra sự cạnh tranh giữa tính chất bị hấp phụ của chất nghiên cứu trên chất hấp phụ và tính giải hấp phụ của nó khi có dung môi đi qua. dội qua  + Nếu chất bị hấp phụ hoàn toàn thì chất không bị di chuyển khi dung môi + Nếu chất hòa tan hoàn toàn trong dung môi đi qua (giải hấp phụ) thì chất được giải phóng và đi cùng dung môi. + Nếu quá trình giải hấp chỉ mạnh hơn sự hấp phụ một ít thì quá trình hấp phụ và giải hấp xảy ra một cách liên tục khi dung môi đi qua. Kết quả là chất nghiên cứu sẽ đi được một khoảng nhất định được gọi là độ chuyển dịch sắc kí. độ chuyển dịch sắc kí này gọi là thời gian lưu tính bằng thời gian, đó là thời gian tính từ lúc bơm mẫu cho đến lúc xuất hiện chất trong sắc kí đồ của sắc kí khí, sắc kí khí lỏng cao áp. Còn trong sắc kí giấy và sắc kí lớp mỏng, thời gian lưu này được đặc trưng bởi giá trị Rf. Mỗi chất, mỗi hệ chạy khác nhau có các giá trị Rf khác nhau. Dựa vào độ phân cực mà chia chất hấp phụ làm hai loại chính: loại chất hấp phụ phân cực (như Fe2O3 > Al2O3 > Silicagel > cacbohidrat) và chất hấp phụ không phân cực (như than hoạt tính, nhựa vonphatit EW). Các chất hấp phụ phân cực thường hay hút nước trong không khí ẩm, làm cho bề mặt của nó không có khả năng hấp phụ được nữa. Vì vậy trước khi làm thí nghiệm người ta phải hoạt hóa lại để đuổi nước khỏi bề mặt chất hấp phụ ở nhiệt độ 110 - 1200C từ 1, 5 giờ đến 2 giờ. Tùy theo lượng nước có trong oxit nhôm trung tính (hãng Merk) cỡ hạt 0,063 - 0,200nm mà chia chúng thành 5 độ hoạt hóa khác nhau: Hoạt độ I: 0 – 0, 50 % nước II: 2, 4 – 3 % nước III: 4, 3 – 4, 5 % nước IV: 6, 5 – 9, 5 % nước V: 13 – 15 % nước đối với các chất bị hấp phụ, khả năng phân cực của chúng được xếp theo thứ tự tăng dần độ phân cực: hidrocacbon < ankyl halogenua < các ete < amin bậc 3 và hợp chất nitro < andehit, xeton < amin bậc 1< amit của axit < ancol < axit cacboxylic. để có thể đẩy được các chất nghiên cứu ra khỏi chất hấp phụ thì ái lực của chất hấp phụ với dung môi phải mạnh hơn ái lực của chất nghiên cứu. Do đó dung môi sẽ thế chỗ chất nghiên cứu. Tác dụng này của dung môi gọi là tác dụng rửa giải của nó. Trên các chất hấp phụ phân cực tác dụng rửa giải của dung môi được sắp xếp theo thứ tự tă