Đồ án Chitin enzymology

MỞ ĐẦU Công nghiệp chế biến thủy sản đang ngày càng phát triển trên quy mô toàn cầu. rất nhiều nước ở Đông Nam Á và Nam Mĩ đang đẩy mạnh ngành công nghiệp này chủ yếu cho xuất khẩu như Ấn Độ, Indonexia, Thái Lan, Việt Nam…quá trình này bao gồm cả nuôi trồng và đánh bắt ở biển, với một sản lượng đông lạnh rất lớn. như vậy tất yếu một lượng phế thải không nhỏ bị vứt bỏ, để thối rữa và do đó gây ô nhiễm môi trường. Theo ước tính lượng phế thải tôm, cua…hàng năm là 1,44 triệu tấn (trọng lượng khô). Tuy vậy chính lượng phế thải vỏ tôm, cua, mực…này lại là một nguồn tiềm ẩn to lớn về protein, chất màu và chitin – polysaccarit. Chitin là một polyme thiên nhiên có cấu tạo mạch thẳng gồm các đơn vị N-axetyl-Dglucosamin nối với nhau bằng liên kết (1,4)- glucosit hiện đang được ứng dụng nhiều trong y học, dược phẩm, công nghiệp thực phẩm, xử lý nước. Sức ép về kinh tế và môi trường ngày càng tăng của ngành chế biến thủy sản buộc phải sớm lựa chọn những biện pháp xử lý thích hợp nhằm phối hợp giải quyết vấn đề môi trường và thu hồi chitin. Cho đến nay việc thu hồi chitin từ những phế thải thủy sản đã cho những kết quả có triển vọng về kinh tế cũng như bảo vệ môi trường. Hiện nay đang có hai phương pháp chủ yếu hay dùng để tách chitin: phương pháp truyền thống (phương pháp hóa học) và phương pháp sinh học (dung enzym hoặc vi khuẩn). Tuy nhiên, Việc sản xuất chitin và dẫn xuất của chúng là những quá trình hóa học đã và đang là mối quan tâm lớn hiện nay. Chitn thu được phụ thuộc nhiều vào quy trình xử lý với axit và kiềm nóng để khử khoáng và khử protein. Quá trình này tiêu tốn năng lượng, sản ra một thể tích lớn nước thải chứa nhiều NaOH, HCl, gây ăn mòn và ô nhiễm mạnh, đông thời rất khó tách các sản phẩm còn có giá trị như chất màu, protein. Nhưng điều quan trọng hơn cả là tính không ổn định của quá trình làm ảnh hưởng đến chất lượng của chitin. Những bất lợi của phương pháp hóa học này nếu xét theo các yếu tố về môi trường, kinh tế và chất lượng sản phẩm có thể thấy: Về môi trường: quá trình hóa học có thể là được xem như là không hợp lý vì: Cần sử dụng một dung lượng lớn axit, kiềm, nước rửa. Nước thải là một chất ăn mòn và chứa những chất gây ô nhiễm như: protein, khoáng đã hòa tan. Về kinh tế: quá trình hóa học trở nên kém hiệu quả hơn vì 4 lý do: Chi phí cho các yếu tố môi trường (như đã nêu trên) Chi phí năng lượng khi xử lý kiềm để loại protein, và tiếp tục chuyển chitin thành chitosan. Tiêu tốn một lượng lớn nước để rửa kiềm. Không thu hồi được các sản phẩm còn có giá trị khác Về chất lượng sản phẩm: chất lượng giảm vì 2 lý do: Việc sử dụng axit và kiềm nóng dẫn đến việc cắt mạch của chitin làm cho sản phẩm thay đổi trọng lượng phân tử và độ nhớt (tức là chitin không giữ được tính chất nguyên bản củ mình). Việc đề acetyl hóa một cách ngẫu nhiên bằng axit và đặc biệt là kiềm nóng đã tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau(có DA khác nhau) và còn tiếp tục gây biến tính những sản phẩm này thành chitosan và các dạng sản phẩm khác Những lý do dó đã làm cho chitin và những dẫn xuất của nó chưa được thương mại hóa trong các lĩnh vực và ứng dụng. Để khắc phục các vấn đề trên, em đã lựa chọn hướng tách chiết chitin theo phương pháp sinh học. Ưu điểm của phương pháp này được thể hiện ở 3 khía cạnh: Về môi trường: ít gây ô nhiễm môi trường, lượng nước rửa ít hơn. Về kinh tế: giảm thiểu chi phí cho năng lượng, đồng thời có thêm các sản phẩm kèm theo (chất màu và protein cho thức ăn gia súc) do đó giá thành rẻ hơn. Về chất lượng sản phẩm: chitin thu được có trọng lượng phân tử và độ nhớt không bị thay đổi nhiều do điều kiện xử lý êm dịu hơn. Đây là một giải pháp cập nhật, giải quyết được những nhược điểm của phương pháp truyền thống. hiện nay lĩnh vực nghiên cứu sinh thái chitin đã trở thành một ngành khoa học thực thụ, đã có nhiều hội nghị thế giới về “chitin enzymology” và những hoạt động này rất phù hợp với việc bảo vệ môi trường nhất là trong lĩnh vực hóa học xanh. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN I.1: Phế thải trong công nghiệp chế biến Tôm là nguồn thủy sản dồi dào và có giá trị kinh tế cao nhưng việc khai thác, đánh bắt phụ thuộc rất lớn vào điều kiện tự nhiên và mang tính mùa vụ vì vậy ngoài đánh bắt tự nhiên người ta còn đẩy mạnh theo hướng nuôi trồng đảm bảo cung cấp nguyên liệu một cách thường xuyên cho các nhà máy chế biến thủy sản xuất khẩu. Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm từ 30 – 35% tổng sản lượng nguyên liệu ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 – 80% công suất chế biến. Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải ra một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70 000 tấn. Riêng ở tỉnh Khánh Hòa lượng phế liệu này vào khoảng 2257 tấn/năm. Theo thống kê của tổng cục hải quan, tính đến hết tháng 11/2009, xuất khẩu tôm của Việt Nam đạt 190 490 tấn, trị giá trên 1,518 tỉ USD, tăng 7,4% vê lượng và 0,73% về giá trị so với cùng kì năm 2008. Đây là mặt hàng thủy sản duy nhất tăng trưởng trong năm 2009. Hơn 300 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu trong đó 60 doanh nghiệp dẫn đầu chiếm hơn 80% kim ngạch. 120 doanh nghiệp có giá trị xuất khẩu hơn 1 triệu USD. Theo dự báo của ông Trương Đình Hòe, Tổng thư ký Vasep, sang năm 2010, tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu chủ lực trong khi xuât khẩu tôm chân trắng sẽ tăng gấp đôi lên 500 triệu USD, sản lượng đạt khoảng 150000 tấn. Việt Nam có thể sẽ có lợi thế ở thị trường tôm chân trắng cỡ nhỏ do có nguồn lao động. Kim ngạch xuất khẩu tôm sú dự kiến sẽ đạt 1,4 tỷ USD. Theo ông Hòe, sang năm mới, giá thành tôm sú sẽ tác động trực tiếp lên xuất khẩu chứ không phải là thị trường. Năm 2010, tôm Việt Nam sẽ là lựa chọn của các nhà nhập khẩu Nhật Bản trong khi Hàn Quốc sau khủng hoảng sẽ là thị trường quan trọng đôi với Việt Nam (theo Vasep.com.vn). Việc tiêu thụ một số lượng lớn tôm nguyên liệu của các nhà máy chế biến thủy sản đã thải ra một lượng lớn phế liệu trong đó phế liệu vỏ, đầu tôm là chủ yếu. Các loại phế liệu này nếu thải trực tiếp ra môi trường sẽ gây ô nhiễm môi trường trầm trọng và nếu đem xử lý chất thải thì chi phí sẽ rất lớn. Ngày nay đã có rất nhiều hướng nghiên cứu sử dụng phế liệu tôm để sản xuất các chế phẩm có giá trị trong đó quan trọng nhất là việc sản xuất chitin – chitosan từ vỏ giáp xác. I.2: Thành phần phế phẩm tôm: Tôm là đối tượng quan trọng của ngành nuôi trồng và chế biến thủy sản Việt Nam. Hiện nay ở nước ta, kĩ thuật khai thác và nuôi tôm rất phát triển và ngày càng cung cấp nhiều nguyên liệu cho các nhà máy chế biến thủy sản trong nước và xuất khẩu nhiều mặt hang như: Tôm tươi còn vỏ, đầu (nguyên con) cấp đông IQF hoặc Block. Tôm vỏ bỏ đầu cấp đông IQF hoặc Block. Tôm bóc vỏ, bỏ chỉ lưng cấp đông IQF. Tôm bóc vỏ, còn đốt đuôi cấp đông IQF. Tôm dạng sản phẩm định hình, làm chín. Tôm bóc vỏ, đóng hộp. Điều này chứng tỏ tôm là một mặt hang đem lại nguồn lợi kinh tế lớn cho đất nước nhưng đồng thời cũng thải ra một lượng lớn đáng kể phế liệu, chủ yếu là vỏ và đầu tôm. Ngoài ra, có một lượng lớn đáng kể thịt vụn do bóc nõn không cẩn thận hoặc một số tôm bị thải loại do biến màu, chất lượng không đảm bảo. Tùy theo giống, loài và phương pháp gia công chế biến mà lượng phế liệu này có thể thay đổi từ 40% (đối với tôm sú) đến 60% (đối với tôm càng xanh) lượng nguyên liệu thu mua. Đối với sản phẩm tôm bóc nõn và rút ruột thì mất mát theo vỏ tôm và đuôi khoảng 25%. Nhìn chung, trong phế liệu tôm thì trọng lượng phần đầu thường gấp 3 – 4 lần so với phần vỏ và đuôi. Theo giáo trình “Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thuỷ sản”[11] của trường Đại học Nha Trang ta có các bảng sau: Bảng 1.1: Thành phần và trọng lượng của tôm (%) I.3 Cấu tạo và thành phần hóa học của phế liệu tôm I.3.1: cấu tạo vỏ tôm: Vỏ tôm chia làm 4 lớp chính: Lớp biểu bì (epicucle). Lớp màu. Lớp canxi hóa. Lớp không bị canxi hóa. Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa cứng do sự lắng đọng của canxi. Lớp màu, lớp canxi hóa, lớp không bị canxi hóa chứa nhiều chitin nhưng lớp biểu bì thì không. Ta gọi các lớp có chứa chitin là endocuicle. Lớp màu: tính chất của lớp này do sự có mặt của những thể hình hạt của vật chất mang màu giống dạng melanin. Chúng gồm những túi khứ hoặc những không bào. Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh, là con đường cho canxi thẩm thấu vào. Lớp biểu bì (epcuticle): những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ bởi Fucxin, có điểm pH = 5,1 không chứa chitin. Nó khác với các vỏ còn lại, bắt màu với anilin xanh. Lớp epicuticle có lipit vì thế nó cản trở tác động của axit ở nhiệt độ thường trong công đoạn khử khoáng bằng axit hơn là các lớp bên trong. Màu của lớp này thường vàng rất nhạt có chứa polyphenoloxidase và bị hóa cứng bởi puinone – tannin. Lớp epicuticle liên kết với một số màng mỏng bên ngoài cản trở hòa tan ngay cả trong môi trường axit đậm đặc do nó có chứa các mắt xích paratin mạch thẳng. Lớp canxi hóa: lớp này chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp, chitin ở trạng thái tạo phức với canxi. Lớp không bị canxi hóa: vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo thành bởi một phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền vững không có canxi và quinine. I.3.2: Thành phần hóa học của vỏ tôm: Protein: thành phần protein trong phế liệu tôm thường tôn tại ở 2 dạng: dạng tự do và dạng liên kết Dạng tự do: dạng này là tồn tại ở phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi và vứt đi lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của tôm. Nếu công nhân vặt đầu không đúng kĩ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu này khó xử lý hơn. Dạng phức tạp: ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chitin, canxicacbonat, với lipit tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit…như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm. Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các protein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng. Canxi: trong vỏ, đầu tôm, vỏ ghẹ…có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó khăn cho quá trình khử khoáng. Sắc tố: trong vỏ tôm thường có nhiêu loại sắc tố nhưng chủ yếu là astaxanthin. Enzym: theo tạp chí thủy sản (số 5/1993) hoạt độ enzym proteaza của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/gam tươi. Các enzym chủ yếu là enzym của nội tạng trong đầu tôm và của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu. Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần khác như: nước, lipit, photpho. Bảng 1.1: Thành phần hóa học của phế liệu tôm Phế liệu protein chitin lipit tro canxi photpho Đầu tôm 53,10 11,10 8,90 22,60 7,20 1,68 Vỏ tôm 22,80 27,20 0,40 31,70 11,10 3,16 Như vậy, trong phế liệu tôm hàm lượng chitin chiếm khá cao (từ 11,10 – 27,2%) và đây là nguồn nguyên liệu lý tưởng để sản xuất chitin. I.4: Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin – chitonsan trong tự nhiên Chitin – chitosan là một polysaccarit tôn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ 2 sau xenluloza). Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật. Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao monomer của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo[1]. Chitin - chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn liên kết cộng hóa trị với các protein, các chất khoáng và các hợp chất hữu khác. Hình 1: chitin và vỏ tôm Trong các loài thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ hàm lượng chitin – chitosan chiếm khá cao, dao động từ 14 – 35% so với trọng lượng khô [2]. Vì vậy, vỏ tôm, cua, ghẹ là nguôn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan. Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loài nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguôn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của Nito trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống xenlulose. Hình 2: 1) chitin; 2) chitosan; 3) xenlulose I.5: Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý của chitin I.5.1: Cấu trúc hóa học của chitin: Chitin I có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ – chitin [3]. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N – acetyl – D – glucosmin) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm – CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm – NHCOCH3, thì các cầu trúc α, β, γ – chitin được mô tả như sau: Hình 3: sắp xếp các mạch trong phân tử chitin α – chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuậ lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên. β, γ – chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β – chitin) và hai song song một ngược chiều (γ – chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Dạng β – chitin cũng có thể chuyển sang dạng α – chitin nhờ quá trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Qua nhiều nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzym hay axit HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N – acetyl – β – D – glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β – 1,4 – glucozit. Công thức cấu tạo của chitin: Tên gọi: poly(1,4) – 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D – glucose; poly(1,4) – 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose. Công thức phân tử: [C8H13O5N]n. Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n. I.5.2: Tính chất hóa lý của chitin [4] Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu… nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid – LiCl 8% [5], tan trong hexafluoro – isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafuoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O) [6]. Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng 884 – 890 cm-1. Chitin tồn tại với các chất oxy hóa mạnh như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước javen (NaOCl – NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin. Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 – 50%), ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan: Lợi dụng tính chất này người ta điều chế ra chitosan – chất có nhiều ứng dụng như: ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm (màng bao gói, bảo quản thực phẩm), là chất trung gian điều chế ra glucosamine có nhiều tác dụng trong y học. Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt mạch thu được glucosamine: Lợi dụng tính chất này người ta điều chế ra Glucosamine là một loại thuốc có tác dụng chống thoái hóa khớp. Phản ứng este hóa : - Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat. - Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat. I.6: Phương pháp thu nhận chitin I.6.1: Phương pháp hóa học chitin Phế liệu tôm tươi Khử protein bằng NaOH 4%, T = 300 0C , = 24 giờ, w/v = 1/ 2,5 Rửa trung tính Kiểm tra hàm lượng protein Rửa trung tính Khử khoáng bằng HCl 4%, 24 giờ, 3000C Kiểm tra hàm lượng protein Cao hơn 5% Cao hơn 5% Chitin có thể được sản xuất theo phương pháp hóa học như sau: Hiệu quả của quá trình khử protein phụ thuộc vào nhiệt độ, nồng độ và tỉ lệ của dung dịch với khối lượng vỏ giáp xác. Nồng độ NaOH thường dùng được sử dụng trong khoảng 1 – 10 % và ở nhiệt độ 50 – 100 0C. Quá trình khử protein thích hợp cũng có thể đạt được bằng việc xử lý với dung dịch KOH. Quá trình khử khoáng cũng diễn ra với thời gian dài, nồng độ axit cao, nhiệt độ cao. Như vậy phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến chất lượng chitin, không tận thu được các thành phần có giá trị khác (chất màu, protein làm thức ăn cho gia súc…) và như thế không giảm được giá thành sản phẩm, không nâng cao được hiệu quả cho việc sản xuất chitin. I.6.2: Phương pháp cơ học Nguyên lý: sử dụng các lực cơ học để tách một phần protein ra khỏi nguyên liệu vỏ tôm. Quá trình được tiến hành như sau: đầu tôm còn tươi đem rửa sạch, sau đó ép bằng trục lăn hoặc trục vít, thu protein đem sấy khô và bảo quản. hiệu quả thu hồi protein của phương pháp này không cao. Tuy nhiên, quá trình này đã loại bỏ được một phần protein tự do trong đầu tôm vì vậy giảm thiểu được hóa chất sử dụng cho các công đoạn tiếp theo. I.6.3: Phương pháp hóa lý Áp dụng phương pháp này nhằm thu hồi protein từ dịch thủy phân của công nghệ sản xuất chitin – chitosan theo phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Nguyên lý dựa trên việc kết tủa protein bằng cách dung axit để điều chỉnh pH dung dịch chứa protein về điểm đẳng điện của protein, sau đó dùng các phương pháp lắng, lọc để thu hồi protein. Dịch protein Kết tủa protein Lắng, gạn Kết tủa protein Lọc thu protein Lọc thu protein Phơi sấy Bột protein Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ làm, có thể thu hồi với hiệu suất cao. Cho phép thu được hầu hết các protein hòa tan do đó có thể ứng dụng để thu hồi protein trong nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm, chế biến thủy sản. I.6.4: Phương pháp sinh học Trong phương pháp sinh học chỉ khác ở công đoạn khử protein và deacetyl không sử dụng hóa chất mà có thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các enzym để loại bỏ protein một cách triệt để. Sản phẩm chitosan thu được có chất lượng cao do không bị ảnh hưởng nhiều bởi hóa chất. Việc sử dụng phương phap sinh học cũng gặp phải rất nhiều khó khăn như giá thành sản phẩm có thể cao, tùy thuộc vào loại enzym sử dụng. Việc loại bỏ hoàn toàn protein có thể đạt được bằng phương pháp hóa học nhưng rất khó đạt được bằng phương pháp sinh học. Vì vậy, người ta có thể kết hợp hai phương pháp này nhằm khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp. Hiện nay, một trong những khó khăn trong phương pháp hóa học để sản xuất chitin là thể tích chất thải lớn và trong đó có chứa các chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý với khối lượng lớn. Những chất này do công đoạn khử khoáng và khử protein sinh ra. Chính vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp xử lý trước khi thải ra môi trường và điều này làm cho giá thành sản phẩm tăng lên. Quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp hóa học có thể gây nên sự thủy phân polymer, biến đổi tính chất vật lý và gây ô nhiễm môi trường. Ngược lại, trong phương pháp sinh học khối lượng chất thải không lớn, protein sau thủy phân có thể thu hồi làm thức ăn gia súc và bên cạnh đó có thể thu hồi các chất màu. Hơn nữa sẽ hạn chế được việc xử lý môi trường. Vì vây, muốn sản phẩm chitin có được sự đồng nhất hơn về các đặc tính lý hóa thì chúng ta phải áp dụng những phương pháp xử lý êm dịu hơn như viêc sử dụng enzym. Legarraeta