Đồ án Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang

GVHD : PGS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN SVTH : NGÔ LÂM TUẤN ANH NGÀY : 22 / 06 / 2007 NỘI DUNG PHẦN 1 : GIỚI THIỆU CHUNG PHẦN 2 : VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN MALOLACTIC PHẦN 3 : QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALOLACTIC PHẦN 4 : CHUYỂN HÓA ACID MALIC TRONG SX VANG PHẦN 5 : KẾT LUẬN LÊN MEN MALOLACTIC TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG NỘI DUNG phần 1---GIỚI THIỆUCHUNG Định nghĩa quá trình lên men malolactic L-acid malic  L-acid lactic Tác nhân VSV: Pediococcus, Lactobacillus, Oenococcus, Leuconostoc 1- KHÁI NIỆM 1 2 3 4 5 H phần 1---GIỚI THIỆUCHUNG Vị trí của lên men malolactic trong sx rượu vang Mục đích Làm giảm vị chua gắt Điều chỉnh hương vị Ổn định độ bền sinh học Ứng dụng Hầu hết các loại vang đỏ, một số ít vang trắng Vang có độ chua cao, khí hậu lạnh Không áp dụng cho một số vang trái cây như vang từ quả mâm xôi (blackberry) hay quả anh đào (cherry) vang ngọt 2- MỤC ĐÍCH VÀ ỨNG DỤNG 1 2 3 4 5 H phần 2---TÁC NHÂN LÊN MEN MALO-LACTIC Các giống vi khuẩn lactic lên men malolactic Pediococcus Lactobacillus Leuconostoc Oenococcus 1- VI KHUẨN MALOLACTIC 1 2 3 4 5 H phần 2---TÁC NHÂN LÊN MEN MALO-LACTIC Oenococcus oeni: Giới thiệu: tên ban đầu Leuconostoc oenos Đặc điểm hình thái: cầu khuẩn, gram (+), … 1- VI KHUẨN MALOLACTIC 1 2 3 4 5 H phần 2---TÁC NHÂN LÊN MEN MALO-LACTIC Oenococcus oeni: Đặc điểm sinh lý: Kỵ khí chịu dưỡng Lên men lactic dị hình Điều kiện sinh trưởng: 20-25oC, pH min 3.1 – opt 4.8 – max 6.5 (chuyển hóa đường: >3.5; acid malic: <3.2) Sơ đồ các kiểu trao đổi chất 1- VI KHUẨN MALOLACTIC 1 2 3 4 5 H phần 2---TÁC NHÂN LÊN MEN MALO-LACTIC Chế phẩm canh trường giống vi khuẩn malolactic Chế phẩm sử dụng ngay (fresh starter cultures) Chế phẩm dạng sấy thăng hoa (freeze-dried cultures) Ưu điểm Lên men malolactic thuận lợi Hạn chế lên men tạp  dễ điều khiển Cải thiện hương vị đặc trưng Cách sử dụng Cấy trực tiếp (direct inoculation) Hoạt hóa trước (build-up inoculation) 2- GIỐNG VI KHUẨN MALOLACTIC TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 1 2 3 4 5 H phần 2---TÁC NHÂN LÊN MEN MALO-LACTIC Điều kiện sử dụng: tùy từng điều kiện lên men cụ thể 2- GIỐNG VI KHUẨN MALOLACTIC TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 1 2 3 4 5 H phần 2---TÁC NHÂN LÊN MEN MALO-LACTIC Yêu cầu tuyển chọn giống vi khuẩn lên men ML Tiêu chí 1: hoạt tính TĐC và tạo sp chính Điều kiện nuôi cấy: ethanol, pH, SO2, nhiệt độ... Phân giải acid malic v/s đường pentose và hexose Tiêu chí 2: Khả năng thích nghi và tốc độ ST Tiêu chí 3: Một số yêu cầu khác Không sinh độc tố: biogenic amine, ... Tương tác với nấm men và vi khuẩn lactic khác Khả năng chống bacteriophage, kháng sinh, thuốc BVTV Không hình thành các acid dễ bay hơi (acetic acid) Lên men giới hạn đường pentose, hexose, acid hữu cơ (\acid malic) Điều chỉnh hương và vị đặc trưng cho vang... 2- GIỐNG VI KHUẨN MALOLACTIC TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 1 2 3 4 5 H phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Chuyển hóa cơ chất và sinh tổng hợp năng lượng Sự chuyển hóa L-acid malic thành L-acid lactic và tạo thành năng lượng dưới dạng ATP Cơ chế tạo thành NL: lực chuyển vận proton (proton motive force) theo thuyết hóa thấm (chemiosmotic) 1- BẢN CHẤT QUÁ TRÌNH 1 2 3 4 5 H phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Biến đổi sinh học (1) Sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi khuẩn malolactic Các giai đoạn sinh trưởng: Pha thích nghi, pha sinh trưởng lũy thừa, pha ổn định và pha suy vong... Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn malolactic bởi các pp lên men khác nhau (2) Tương tác sinh học giữa VK và nấm men 2- CÁC BIẾN ĐỔI CHÍNH 1 2 3 4 5 H Lên men tự nhiên Lên men có kiểm soát phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Biến đổi hóa học và hóa sinh (1) Sự phân giải các loại đường: Glucose, fructose, mannose Arabinose, ribose, xylose 2- CÁC BIẾN ĐỔI CHÍNH 1 2 3 4 5 H phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Biến đổi hóa học và hóa sinh (tt) (2) Sự thay đổi pH và độ acid tổng: Sự thay đổi pH: tăng 0,1  0,3 đơn vị Sự biến đổi hàm lượng một số acid L-acid malic: giảm 3g/l 2- CÁC BIẾN ĐỔI CHÍNH 1 2 3 4 5 H B Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid malic trước và sau khi lên men malolactic bởi các chủng vi khuẩn thuộc giống O. oeni (Maurizio Ugliano và Luigi Moio, 2005) phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Biến đổi hóa học và hóa sinh (tt) (2) Sự thay đổi pH và độ acid tổng (tt): Sự biến đổi hàm lượng một số acid khác 2- CÁC BIẾN ĐỔI CHÍNH 1 2 3 4 5 H B pH A. acetic A. lactic A. citric A. malic A. fumaric phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Biến đổi hóa học và hóa sinh (tt) (3) Sự thay đổi hàm lượng các acid amin 2- CÁC BIẾN ĐỔI CHÍNH 1 2 3 4 5 H B phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Biến đổi hóa học và hóa sinh (4) Sự thay đổi hàm lượng các cấu tử hương Acid dễ bay hơi: acid acetic... Alcohol: isoamyl alcohol, 2-phenyl alcohol... Hợp chất carbonyl: acetaldehyde, diacetyl, acetoin... Esters: isoamylacetate, ethylphenyl acetate, ethyl lactate... Glucosides: glucoside của monoterpenoid (không mùi)  monoterpenoid (thơm) Acid phenolic: p-coumaric, ferulic  4-vinylphenol  4-ethylphenol Các hợp chất chứa S: methionol Điều chỉnh hương 2- CÁC BIẾN ĐỔI CHÍNH 1 2 3 4 5 H B phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Biến đổi hóa học và hóa sinh Bảng tóm tắt 2- CÁC BIẾN ĐỔI CHÍNH 1 2 3 4 5 H B phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Giống: Oenococcus oeni Tỉ lệ giống cấy: 106-107 tế bào/mL canh trường Hình thức cấy: Dạng khô (dried stater)  cấy trực tiếp Dạng hoạt hóa Môi trường lên men: dịch nho sau lên men chính Hàm lượng acid malic Đường sót Nồng độ ethanol, sulphite, ... Hàm lượng các chất khác: acid béo, phenolic acid, ... 2- CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG 1 2 3 4 5 H B phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Điều kiện lên men pH đầu: pHopt = 3,2-4,0 Nhiệt độ: topt = 18-25oC Thời điểm cấy giống Cấy giống đồng thời với nấm men Cấy giống đầu giai đoạn tàng trữ Thế oxy hóa-khử 2- CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG 1 2 3 4 5 H B phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC 3- PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 1 2 3 4 5 H B Phương pháp tiến hành Lên men tự nhiên Cấy giống Oenococcus oeni Cấy trực tiếp Hoạt hóa trước Đầu gđ LM ethanol Giữa lên men chính Đầu gđ tàng trữ Đầu gđ tàng trữ phần 4---CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN HÓA ACID MALIC TRONG SX VANG Các con đường chuyển hóa acid malic thành acid lactic bởi vi khuẩn lactic (1) Chuyển hóa acid malic nhờ enzyme malate carboxylase (2) L- acid malic  acid pyruvic  acid lactic (malic enzyme và lactate dehydrogenase) (3) L- acid malic  oxaloacetate  acid pyruvic  L-acid lactic Chuyển hóa acid malic bởi nấm men Acid malic  acid pyruvic  acetaldehyde  ethanol Schizosacchromyces pombe và Saccharomyces cerevisiae (đột biến hay chuyển gen) 1- CÁC CON ĐƯỜNG CHUYỂN HÓA ACID MALIC 1 2 3 4 5 H B phần 4---CHUYỂN HÓA ACID MALIC THÀNH LACTIC TRONG SẢN XUẤT VANG Phương pháp hóa học: Sử dụng chất kết lắng acid tartaric (chemical precipitation) Phương pháp sinh học: Chuyển hóa L-acid malic bởi vi khuẩn ML cố định Chuyển hóa L-acid malic bởi Schizosaccharomyces pombe Chuyển hóa L-acid malic bởi Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp Phương pháp hóa sinh Chuyển hóa L-acid malic bằng enzyme malate carboxylase cố định 2- CÁC PHƯƠNG PHÁP LÀM GIẢM ĐỘ CHUA VANG 1 2 3 4 5 H B phần 4---CHUYỂN HÓA ACID MALIC THÀNH LACTIC TRONG SẢN XUẤT VANG 3- HỆ THỐNG THIẾT BỊ 1 2 3 4 5 H B phần 5---KẾT LUẬN Vấn đề chuyển hóa acid malic trong vang Thuận lợi và khó khăn Thực trạng và tương lai KẾT LUẬN CHUNG 1 2 3 4 5 H B phần 1---GIỚI THIỆUCHUNG Phát hiện vào thế kỷ XIX Một số vấn đề lý thuyết được làm sáng tỏ thế kỷ XX 1920, Ferré và Ribéreau chứng minh vai trò của lên men malolactic trong rượu vang 1960-1980, các nổ lực tìm kiếm tác nhân lên men ML Từ 1980, nghiên cứu thúc đẩy quá trình lên men ML bằng nhiều cách khác nhau Nghiên cứu giống vi khuẩn thuần khiết lên men ML Nghiên cứu điều khiển các thông số công nghệ Xác định thời điểm cấy giống Lên men malolactic bằng một số kỹ thuật thay thế Lên men ML bởi VK cố định Lên men ML bởi nấm men đột biến hay chuyển gen Lên men ML bằng enzyme malolactic cố định 1- Lịch sử hình thành và phát triển 1 2 3 4 5 H phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Biến đổi sinh học Tương tác sinh học giữa vi khuẩn và nấm men Không tương tác/ trung lập (Neutral) Kích thích (Stimulation): peptide, các phân đoạn N, mannoprotein, dịch tự phân một phần của nấm men Kìm hãm/ ức chế (Inhibition): ethanol, SO2, acid béo, ... 2- CÁC BIẾN ĐỔI CHÍNH 1 2 3 4 5 H phần 4---CHUYỂN HÓA ACID MALIC THÀNH LACTIC TRONG SẢN XUẤT VANG Mục đích: Hoạt tính lên men tăng & ổn định tốt Khả năng thích nghi và chống chịu cao Rút ngắn thời gian lên men Cơ giới hóa, tự động hóa Tiết kiệm chi phí năng lượng, giống, thời gian, công sức Cải thiện hương vị tốt hơn Thành tựu công nghệ Sự phù hợp giữa vi khuẩn và cấu trúc gel Khả năng chuyển hóa của các giống/loài/chủng vi khuẩn khác nhau Phương pháp: Lên men tĩnh/ liên tục 4.2 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC1- Vi khuẩn malolactic cố định 1 2 3 4 5 H B phần 4---CHUYỂN HÓA ACID MALIC THÀNH LACTIC TRONG SẢN XUẤT VANG 4.2 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC1- Vi khuẩn malolactic cố định 1 2 3 4 5 H B phần 4---CHUYỂN HÓA ACID MALIC THÀNH LACTIC TRONG SẢN XUẤT VANG Đặc điểm: Chuyển hóa L-acid malic theo con đường khác Sản phẩm chính là ethanol 4.2 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC2- Sử dụng nấm men Sch. pombe 1 2 3 4 5 H B < phần 4---CHUYỂN HÓA ACID MALIC THÀNH LACTIC TRONG SẢN XUẤT VANG Mục đích: Tốc độ sinh trưởng & chuyển hóa nhanh  rút ngắn thời gian Chịu được môi trường [ethanol] và [SO2] cao, pH thấp Sản phẩm chính là ethanol  giảm nhanh độ acid và tăng hiệu suất lên men ethanol Nhược điểm chính Ảnh hưởng của Sch. pombe lên chất lượng cảm quan Việc tách loại Sch. Pombe 4.2 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC2- Sử dụng nấm men Sch. pombe 1 2 3 4 5 H B phần 4---CHUYỂN HÓA ACID MALIC THÀNH LACTIC TRONG SẢN XUẤT VANG Đặc điểm: Nấm men được tái tổ hợp di truyền từ chuyển gen: Gen mleS mã hóa STH enzyme malate carboxylase Gen mea1 mã hóa STH protein vận chuyển acid malic (malate permease) Ưu điểm Thời gian lên men và thời gian sx Điều khiển Chi phí sản xuất (giống, CSVC-TB, năng lượng...) Khả năng cơ giới hóa, tự động hóa An toàn 4.2 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC3- Sử dụng nấm men S. cerevisiae 1 2 3 4 5 H B phần 4---CHUYỂN HÓA ACID MALIC THÀNH LACTIC TRONG SẢN XUẤT VANG S92: chủng thuần ML01: chủng tái tổ hợp 4.2 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC3- Sử dụng nấm men S. cerevisiae 1 2 3 4 5 H B phần 4---CHUYỂN HÓA ACID MALIC THÀNH LACTIC TRONG SẢN XUẤT VANG Đặc điểm: Chuyển hóa bằng enzyme malate carboxylase (EC 1.1.1.38) cố định Nguồn thu nhận: Từ Lactobacillus spp. Từ Leuconostoc spp. Từ Oenococcus oeni Từ Lactococcus lactis Đặc điểm enzyme từ Lactobacillus sp. 89: 2 tiểu đơn vị 120.000 và 60.000 Da 2 cofactor NAD+ và Mn2+ HS Michealis Km với acid malic là 4,1 mM Nhiệt độ tối thích 48oC Chất ức chế cạnh tranh: a. citric, a. succinic, a. tartaric 4.3 PHƯƠNG PHÁP HÓA SINHSử dụng enzyme malate carboxylase 1 2 3 4 5 H B phần 4---CHUYỂN HÓA ACID MALIC THÀNH LACTIC TRONG SẢN XUẤT VANG Thành tựu: Khả năng ứng dụng trong sx rượu vang Vấn đề công nghệ cần giải quyết 4.3 PHƯƠNG PHÁP HÓA SINHSử dụng enzyme malate carboxylase 1 2 3 4 5 H B phần 3---QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALO-LACTIC Phương pháp lên men tĩnh Tiến hành: Cấy trực tiếp (direct-inoculation) Cấy giống đã hoạt hóa trước (build-up inoculation) 3- PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 1 2 3 4 5 H B