Đồ án Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC –˜™—–˜™— ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN RƯỢU VANG SVTH : PHẠM THỊ HỒNG NGA CBHD: THS.TÔN NỮ MINH NGUYỆT BỘ MÔN : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Năm học 2006-2007 Nhận xét của giáo viên hướng dẫn Mục lục Mục lục bảng Bảng I.1 Các đặc tính mong muốn của nấm men vang [15] 8 Bảng III.1 Kết quả kiểm tra mùi và vị của rượu sản xuất từ tế bào Saccharomyces cerevisiae cố định trên miếng táo trong suốt quá trình lên men liên tục so sánh với rượu thương mại:[19] 21 Bảng III.2. Một số chế phẩm polyvinyl alcohol thương mại 32 Bảng III.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ nhớt của dung dịch 10% polyvinyl alcohol có phân tử lượng là 115.000: 34 Bảng III.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đến độ nhớt của dung dịch polyvinyl alcohol có phân tử lượng là 115.000: 34 Bảng III.5 So sánh phương pháp nhốt trong gel và phương pháp vi bao: 54 Mục lục hình Hình II.1 Các kỹ thuật cơ bản để cố định tế bào [20] 10 Hình III.1 Hiệu suất sản xuất cồn ở những nhiệt độ lên men khác nhau. 17 Hình III.2 Năng suất riêng của việc sản xuất cồn ở những nhiệt độ khác nhau. 17 Hình III.3 Nấm men cố định trên miếng táo trong quá trình lên men rượu. 20 Hình III.4 Đá kissiris. 25 Hình III.5 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl alcohol. 30 Hình III.6 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl acetate. 31 Hình III.7 Mức độ thuỷ phân của phân tử polyvinyl alcohol: (a) thuỷ phân hoàn toàn, (b) thuỷ phân một phần. 32 Hình III.8 Khả năng hoà tan phụ thuộc vào mức độ thuỷ phân và nhiệt độ. 33 Hình III.9 Cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate, (b) chuỗi alginate, (c) sự phân bố các block [186] 42 Hình III.10 Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài 43 Hình III.11 Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong 44 Hình III.12. Phương pháp chuẩn bị bao Alg(PEG) 49 Hình III.13 Hệ thống tạo bao cố định tế bào 50 Hình III.14 Ảnh hưởng của thời gian tạo gel lên sự hình thành bao Alg(PEG). Bao Alg(PEG) được sản xuất bằng cách dùng dung dịch PEG 6000 20% (w/w) chứa 2% CaCl2 (w/w). 51 Hình III.15. Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên bán kính và bề dày của lớp gel alginate của bao Alg(PEG). Bao được sản xuất bằng cách dùng dung dịch PEG 6000 30% (w/w) chứa 2% CaCl2 . 51 Hình III.16 Sự thay đổi nồng độ PEG và xanthan gum trong suốt thời gian hoá rắn. 52 Hình III.17 Lượng bao hình cầu theo chiều cao lổ hổng trong reactor 53 Hình III.18 Biocapsule và hình ảnh liên kết của nấm sợi và nấm men. 55 Hình III.19 Biểu đồ hoạt động của hệ thống thiết bị phản ứng sinh học membrane một bình 57 Hình III.20 Biểu đồ hoạt dộng của hệ thống thiết bị phản ứng sinh học membrane 2 bình 58 Lời mở đầu: Như chúng ta đã biết, nấm men là một loài vi sinh vật có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và sản xuất. Một trong những ứng dụng phổ biến của chúng là trong ngành sản xuất rượu vang, một ngành sản xuất sản phẩm lên men có truyền thống lâu đời. Theo các tài liệu cổ, rượu vang có xuất xứ từ các nước Ả Rập vào khoảng thế kỷ 18 hay 19 trước Công nguyên và cho đến nay, rượu vang đã trở nên phổ biến khắp nơi trên thế giới. Rượu vang được ưa thích trước hết là do hương vị hết sức đặc trưng mà không loại sản phẩm nào có thể thay thế, sau đó là do nó đem lại cảm giác sảng khoái và sức khỏe cho người uống. Trong thời kì đầu, rượu vang được tạo ra bằng quá trình lên men tự phát với những loài nấm men có sẵn trong dịch quả. Dần dần, người ta đã biết tiến hành nuôi cấy các chủng nấm men thuần thiết để thúc đẩy quá trình lên men và tăng chất lượng của rượu vang. Loài nấm men đóng vai trò chính trong quá trình lên men cồn sản xuất rượu vang là loài Saccharomyces cerevisiae. Tuy nhiên, việc sử dụng nấm men tự do để lên men gặp phải một số vấn đề như thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng để tách nấm men ra khỏi rượu vang sau quá trình lên men, … Để giải quyết các vấn đề này, nhiều nghiên cứu về việc sử dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang đã được thực hiện. Các nghiên cứu này đều cho thấy nấm men cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do như là tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men, ổn định hoạt tính của nấm men, góp phần tăng năng suất lên men, … Chính vì những lợi ích về kỹ thuật và kinh tế do việc sử dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang mang lại mà những nghiên cứu về chúng ngày càng được mở rộng và thu hút sự chú ý nhiều hơn. Các nhà nghiên cứu đã thực hiện việc cố định tế bào bằng nhiều phương pháp khác nhau, sử dụng chất mang như những vật liệu vô cơ, những polisaccarit hữu cơ với mong muốn tìm kiếm phương thức cố định phù hợp cho quá trình lên men cồn trong sản xuất rượu vang. Cơ sở để đánh giá liệu kỹ thuật này có thể ứng dụng thành công trong sản xuất công nghiệp hay không thì phụ thuộc vào khả năng cải thiện năng suất lên men cồn, cải thiện chất lượng, mùi vị cho sản phẩm. Đồng thời kỹ thuật đó phải đảm bảo sử dụng chất mang phù hợp với thực phẩm, phong phú trong tự nhiên và hiệu quả về kinh tế. TỔNG QUAN Nấm men. Đặc điểm hình thái và cấu tạo. Đặc điểm hình thái: [2] Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như là hình cầu, hình ovan hoặc elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi kéo dài ra thành hình sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dáng kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh. Hình thái của chúng không thay đổi chỉ ở các giống nuôi cấy khi còn trẻ trong các môi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn. So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 1 µ, chiều dài 8 µm. Với kích thước này ta có thể ước tính bề mặt tế bào nấm men trong một lít dịch lên men vào khoảng 10 m2 và do vậy cường độ trao đổi chất của tế bào nấm men với môi trường xung quanh là vô cùng to lớn. Cấu tạo tế bào nấm men : [1, 2] Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống với động thực vật. So sánh tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hoá nhảy vọt từ nhân sơ đế nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hoá về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ … ) ở cơ thể nhân chuẩn xuất hiện nhiều thể không thấy ở thể nhân sơ như ti thể, lục lạp v.v… Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các cấu tử – tiểu thể và có thể chia thành: các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào. Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm ( chiếm 25% khối lượng khô của tế bào). Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo từ glucan và mannan. Một số nấm men có thành tế bào chứa mannan và kitin. Trong thành tế bào còn chứa khoảng 10% protein ( tính theo khối lượng khô), trong số protein này có một phần là các enzim. Trên thành tế bào còn thấy có một lượng nhỏ lipit. Dưới lớp thành tế bào là lớp màng tế bào chất có 3 tầng kết cấu khác nhau. Cấu tạo chủ yếu là protein (chiếm 50% khối lượng chất khô), phần còn lại là lipit (40%) và một ít polisaccarit. Nhân của tế bào nấm men được bao bọc bởi một màng nhân như ở các sinh vật có nhân thật khác. Màng nhân của nấm men có cấu trúc 2 lớp và có rất nhiều lổ thủng. Nhân của tế bào men rượu Saccharomyces cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể. ADN trong tế bào nấm men đơn bội có khối lượng phân tử là 1x1010Da, so với khối lượng phân tử của ADN vi khuẩn Escherichia coli thì lớn hơn 10 lần nhưng so với ADN của người thì nhỏ hơn 100 lần. Ứng dụng trong công nghiệp.[1, 2] Rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: công nghiệp sản xuất bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, và cao nấm men, lipit nấm men, các enzim như là amylaza, invertyaza, lactaza, uricaza, poligalacturonaza, sản xuất esgosterol, axit ribonucleic, riboflavin (vitamin B2), các axit amin như lizin, xixtein, metionin. Phần lớn nấm men được sử dụng trong công nghiệp thuộc giống Saccharomyces trong lớp nấm túi và vài giống thuộc lớp nấm bất toàn. Giống Endomyces vernalis là một loài nấm men dùng trong thế chiến thứ nhất để tổng hợp chất béo. Giống Saccharomyces, quan trọng nhất là loài Saccharomyces cerevisiae, được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Một số chủng của nấm men này dùng làm men nở bánh mì, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rượu vang, sản xuất glycerin hoặc enzim invertaza. Saccharomyces fragilis lên men đường lactoza đóng vai trò quan trọng trong sản xuất sữa và các sản phẩm của sữa. Có lẽ trong tương lai loài người trông cậy vào giống nấm men này để thu nhận cồn tuyệt đối từ những nguyên liệu tái tạo được để thay thế xăng khi dầu mỏ ở trái đất bị cạn kiệt. Giống Zygosaccharomyces, một vài tác giả coi giống này là giống phụ của giống Saccharomyces. Zygosaccharomyces nusbarumeri được tìm thấy trong mật. Các loài này tham gia vào lên men rượu vang và đặc biệt lên men đậu tương làm thành một thứ đồ uống đặc biệt. Các giống Pichia, Hasenula, Debaryomyces … cũng như các giống Mycoderma, Candida … là những nấm men không hình thành màng trên dịch nuôi cấy, phát triển trên bề mặt các dịch ướp chua dưa chuột và các loại rau quả. Chúng oxy hóa các chất hữu cơ làm giảm độ chua và làm tăng pH của dịch ướp. Hasenula và Pechia có thể chịu đựng độ cồn cao và oxy hóa rượu etylic. Debaryomyces có thể chịu được muối cao, đặc biệt ở phomat có muối tới 24% vẫn thấy men này phát triển. Nấm men tạo màng không hoặc sản sinh ra ít rượu etylic từ đường. Tác hại của nấm men.[1, 2] Bên cạnh các nấm men có ích như đã trình bày ở trên cũng có không ít các nấm men có hại, chúng gây ra hiện tượng làm hư hỏng thực phẩm tươi sống hoặc các thực phẩm chế biến. Có khoảng 13-15 loài nấm men có khả năng gây bệnh cho người và cho động vật chăn nuôi . Đáng chú ý nhất là các loài Candida albicans, Cryptococus neoformans, Trichosporon cutaneum, Trichosporon Capitatum … Một số loài thuộc giống Zygosaccharomyces có thể phát triển ở dịch đường nồng độ cao và làm hỏng mật siro. Giống Saccharomycodes và Hasenula spora có hình quả chanh cũng như các nấm men giả Kloekera không sinh bào tử có tế bào hình chùy. Những giống men này làm hỏng rượu, đặc biệt là mất mùi rượu vang. Nấm men rượu vang. Sự chuyển hóa trong sản xuất rượu vang là một quá trình hóa sinh phức tạp. Nó liên quan đến tương tác giữa nấm men vi khuẩn và những loài vi sinh vật khác. Trong những loài vi sinh vật này thì nấm men đóng vai trò quan trọng, kiểm soát quá trình lên men cồn trong sản xuất rượu vang. [7] Trong thời kì đầu sản suất rượu vang, quá trình lên men tự phát là chính với nấm men từ 2 nguồn gốc khác nhau: bề mặt trái nho (từ vườn nho) , bề mặt thiết bị (từ môi trường bên trong nhà máy). Và về sau có thêm một hướng phát triển trong sản xuất rượu vang là dùng nấm men từ quá trình nuôi cấy. Thành phần và chất lượng của rượu vang có liên quan chặt chẽ đến quần thể nấm men. Trong quá trình lên men, bên cạnh các sản phẩm chính là ethanol và CO2, nấm men tạo thành nhiều sản phẩm phụ, ví dụ như glycerin, axit acetic, axit succinic và đặc biệt là các hợp chất hương, góp phần đáng kể vào chất lượng của rượu vang. [16,18] Phân loại. Nấm men có thể được phân thành 2 nhóm: Thứ nhất gọi là non-Saccharomyces (NS – là những loài nấm men không thuộc giống Saccharomyces), thường xuất hiện trên bề mặt của trái nho cùng với nhiều loại vi sinh vật khác. Hầu hết các loài NS không có khả năng tồn tại khi nồng độ cồn cao hơn 6% v/v (chính vì vậy mà các loài NS thường phát triển ở giai đoạn đầu của quá trình lên men cồn). Ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis có thể phát triển trong môi trường có nồng độ cồn lên đến 12%, loài này thích nghi tốt hơn những loài NS khác, và nó vượt trội hơn những loài khác nhất là vào cuối quá trình lên men, chúng góp phần chính vào mùi vị của rượu, nhưng sản phẩm phụ của nó, phenol dễ bay hơi, thì là nguyên nhân gây ra hư hỏng rượu. Trước đây, nấm men NS được xem là các vi sinh vật gây hư hỏng. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, một số loài nấm men NS có lợi cho chất lượng rượu vang và góp phần rõ ràng vào đặc điểm của sản phẩm cuối, giúp tăng cường hương vị của rượu vang bởi vì khả năng của chúng trong việc sản xuất ra những sản phẩm phụ như là glycerin, ester, aceton…. [31] Nhóm khác góp phần vào hương vị rượu vang, cũng là nhân tố chính của quá trình lên men cồn là các loài thuộc giống Saccharomyces. Saccharomyces có khả năng chịu đựng sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng độ ethanol và axit hữu cơ tăng và sự cạn kiệt chất dinh dưỡng (Pretorius, 2000). Như vậy, mặc dù có nhiều giống và loài nấm men trong dịch nho, nhưng giống Saccharomyces, mà chủ yếu là loài Saccharomyces cerevisiae mới là loài đảm nhiệm việc thực hiện các quá trình chuyển hóa sinh học quan trọng trong lên men vang. Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae còn được gọi là “nấm men vang”. [31] Đặc điểm của các loài nấm men rượu vang:[2] Saccharomyces: có bào tử trong nan thường là 1-4 bào tử, có khi tới 8. Tế bào của chúng có hình dạng khác nhau: hình tròn, ovan, hoặc elip. Sinh sản bằng lối nảy chồi, sử dụng đường trong quá trình hô hấp và lên men, có trường hợp lên men ở dịch đường 30% và tạo được 18ocồn. Không đồng hóa được muối nitrat. Giống Sacharomyces có tới 18 loài nhưng chỉ có 7 loài thường gặp trong nước quả. Các loài nấm men không sinh bào tử thường gặp trong nước quả và khả năng lên men hoặc tiêu hao đường trong đó, phổ biến là Kloeckera, Torulopsis. Người ta thường gọi chúng là men dại. Sau đây là một số loài nấm men thường gặp trong quả và có vai trò quan trọng trong nghề làm rượu vang. Saccharomyces vini. Đây là tên hiện nay dùng phổ biến, trước đây người ta gọi là Saccharomyces vini Meyer hay là Saccharomyces ellipsoideus theo Lodder là Saccharomyces cerevisea Hansen. Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm đến 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men. Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bông. Nguồn dinh dưỡng cacbon của loài này là đường, sồn, và axit hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là axit pantotenic, biotin, mezoinit, tiamin, và piridoxin. Đa số tế bào của loài này hình ovan có kích thước (3 - 8) x (5 -12) µm, sinh sản theo lối nảy chồi và tạo thành bào tử Saccharomyces vini sinh ra enzim invertaza có khả năng khử đường saccaroza thành fructoza và glucoza, vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu tạo thành bình thường đối với nhiều nòi của men và chỉ đạt được 8-10 % so với thể tích. Ở giai đoạn cuối quá trình lên men Saccharomyces vini kết lắng nhanh và làm trong dịch rượu. Các nòi của giống này có đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp tạo ra cho vang mùi vị đặc trưng riêng biệt. Giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men các tế bào Saccharomyces vini thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết rất nhanh. Saccharomyces uvarum. Men này được tách từ nước nho, rượu và nước quả phúc bồn tử lên men tự nhiên. Về hình thái nó không khác với các loài khác. Khả năng sinh bào tử khá mạnh trên môi trường thạch – malt. Các nòi của loài này có thể lên men 12-13 o cồn trong dung dịch nước nho. Một vài nòi được dùng trong sản xuất rượu vang. Saccharomyces chevalieri. Theo Lodder là Saccharomyces chevalieri Guiliermond. Nấm men này được tách từ nước nho lên men tự nhiên, từ vang non được gây men nước dừa hoặc nước cọ. Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể tạo 16ocồn. Nó thường lẫn với Saccharomyces vini. Saccharomyces ovifomis. Theo Lodder là Saccharomyces Beuanes saccado. Được tách ra từ nước nho tự lên men, nhưng loại nấm men này ít hơn Saccharomyces vini. Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và các nước quả khác , có khả năng chịu được đường cao, lên men kiệt đường và tạo thành 18o cồn. Các yếu tố sinh trưởng của loại này giống như Saccharomyces vini và có khả năng chịu được lượng cồn cao. Dùng các nòi thuần chủng của giống này để lên men dịch quả có hàm lượng đường cao để chế vang khô cho kết quả tốt. Có hình dàng giống như Saccharomyces vini và có thể tạo thành 18% rượu trong quà trình lên men, giống này tạo thành màng trên dịch quả. Saccharomyces ovifomis lên men được glucoza, fructoza, manoza, sacaroza, maltoza, và 1/3 rafinoza, không lên men được lactoza, pentoza. Điều káhc nhau cơ bản của Saccharomyces ovifomis với Saccharomyces vini là Saccharomyces ovifomis không lên men được galactoza và men nổi lên mặt dịch lên men tạo thành màng. Hai giống men rượu vang này (Saccharomyces vini và Saccharomyces ovifomis) có nhiều nòi được dùng trong sản xuất. Nói chung, nhiều nòi men rượu quả có khoảng nhiệt độ thích hợp là 18-25oC , ở 35oC sinh sản của chúng bị ức chế, ở 40oC sinh sản bị nhừng hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 16oC sinh sản và lên men bị kéo dài. Các điều kiện hóa – lý , thành phần và chất lượng dịch quả, cũng như pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sống của nấm men. Hanseniaspora apiculate- Kloeskera apiculata. Kích thước tương đối nhỏ có hình ovan, elip, hoặc hình quả chanh, tế bào có một đầu nhỏ ngưới ta thường gọi là men hình chùy. Sinh sản bằng nảy chồi, rất phổ biến ở vỏ quả và nhiễm vào nước quả chiếm tới 90% tổng số men khi bắt đầu lên men. Nó có thể lên men tạo thành 6-7o cồn, nhưng tạo thành một loạt các axit bay hơi cũng giống như các ester của chúng làm cho dịch có mùi tạp và nó còn kiềm hãm các loài nấm men chính trong lên men, Kloeskera apiculata nhạy