Đồ án Tổng quan về Peptide có hoạt tính sinh học

LỜI MỞ ĐẦU P eptit có hoạt tính sinh học (Bioactive peptide) là một lĩnh vật đang được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Với những tính năng đặc biệt, peptit có hoạt tính sinh học được ứng dụng tất nhiều trong y học và thực phẩm. Được sự hướng dẫn nhiệt tình của cô Trần Bích Lam, em đã nghiên cứu đề tài Đồ án môn học “Tổng quan về Biopeptide”. Với những cố gắng của bản thân và sự chỉ dẫn ân cần của cô, em đã hoàn thành nhiệm vụ được giao. Tuy nhiên, đây là một đề tài còn mới mẻ, tài liệu tham khảo chưa nhiều nên còn nhiều thiếu sót. Rất mong được sự đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài này thêm phần hoàn thiện. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Bích Lam, quý thầy cô trong Bộ môn và các bạn rất nhiều. Chương 1: GIỚI THIỆU P eptit là các phân tử sinh học được cấu trúc từ một vài cho đến hàng chục amino axit. Nó là một dạng protein mạch ngắn có chứa ít hơn 50 amino axit. Tuy nhiên, người ta vẫn gọi những phân tử sinh học chứa một lượng không lớn các amino axit là peptit. Liên kết peptit là liên kết giữa đầu – COOH của amino axit này với đầu – NH2 của amino axit kế tiếp bằng việc loại đi một phân tử nước để tạo thành liên kết: – CO – NH – Khi một số amino axit liên kết với nhau thông qua liên kết peptit thì tạo ra oligopeptit. Khi có nhều amino axit nối với nhau thì tạo ra chuỗi polypeptit. Một phân tử protein có thể có một, hai hay nhiều chuỗi polypeptit. Trong phân tử protein ngoài liên kết peptit, các amino axit còn liên kết với nhau bằng liên kết disulfid. Liên kết disulfid có vai trò quan trọng trong việc tạo cấu hình không gian cho một số loại protein, đặc biệt các protein có những chức năng sinh học quan trọng như các hoocmon, các kháng thể và một số protein khác. Peptit có tính chất lý hóa không khác nhiều so với amino axit vì đều chứa nhóm – NH2 và nhóm – COOH tự do. Sự sai khác chủ yếu là do mạch bên R của gốc amino axit tham gia trong chuỗi peptit. Chính sự khác nhau giữa các mạch bên R, khác về số lượng và loại amino axit trong peptit làm cho điểm đẳng điện, khối lượng khác nhau. Về mặt hóa học, peptit tham gia các phản ứng đặc trưng của 2 nhóm – NH2 và – COOH. Liên kết peptit có thể bị bẻ gãy hoàn toàn trong môi trường HCl 6N, ở nhiệt độ 1100C, trong 24 giờ hoặc ở trong dung dịch kiềm. Trong điều kiện này, các amino axit được tách ra ở dạng tự do. Đây là công đoạn không thể thiếu được trong phương pháp phân tích định lượng amino axit. Để xác định trình tự các amino axit, người ta cần gắn hóa chất đánh dấu vào các đầu N và C của amino axit. Thông thường người ta gắn chất dabsylchlorid vào đầu N của peptit. Sau đó tiến hành thủy phân bằng HCl 6N ở 1100C trong 24 giờ và tiến hành tách được riêng từng loại amino axit lần lượt theo thứ tự. Kết quả thu được amino axit tự do tách ra và có chứa chất đánh dấu đã được gắn vào đầu N của nó. Các liên kết peptit còn bị cắt bởi các enzym protease. Enzym protease có mặt ở các tế bào và mô làm nhiệm vụ phân giải các phân tử protein. Nhiều peptit có hoạt tính sinh học đặc biệt đang được sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học. Peptide có hoạt tính sinh học (bioactive peptide/ biologically active peptide) là những peptide mà ngoài giá trị dinh dưỡng chúng còn có một số ảnh hưởng đặc biệt đến chức năng sinh lý của cơ thể. Tính chất này được quy định bởi thành phần và thứ tự của các amino acid trong peptide. Mellander (1950) là người đầu tiên đưa ra thuật ngữ peptide có hoạt tính sinh học khi ông nhận thấy các peptide bị phosphoryl hóa có nguồn gốc từ casein hoạt động như chất mang các chất khoáng. Những nghiên cứu về peptide đã có những bước tiến đáng kể trong vài thập niên gần đây. Những hiểu biết về tác dụng và cơ chế tác dụng của peptide đã làm cho nó ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm đặc biệt trong lĩnh vực y dược. Ngoài ra, peptide có hoạt tính sinh học còn được sử dụng trong các loại thực phẩm chức năng, nhất là các thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ sữa. Hình1.1: Aûnh hưởng của các peptide có hoạt tính sinh học lên cơ thể Khả năng chữa bệnh của peptit là rất cao. Đến bây giời trên thị trường đã có 9 sản phẩm sử dụng peptit và trên 100 công ty đang sản xuất ra nhiều sản phẩm peptit mới và đưa vào thử nghiệm. Peptit – hoocmon tham gia vào các quá trình trao đổi chất, vận chuyển thông tin hóa học giữa các tế bào mô và các cơ quan. Insulin là peptit – hoocmon điển hình, là phân tử khá lớn, có 51 amino axit tạo thành 2 chuỗi polypeptit nối với nhau bằng cầu disulfid (-S-S). Glucagon là một peptit – hoocmon bao gồm 29 amino axit được tổng hợp từ tuyến tụy, có tác động ngược với insulin Corticotropin là peptit – hoocmon bao gồm 39 amino axit, được tạo ra từ phần trước của tuyến yên, có vai trò kích thích hoạt động của vỏ tuyến thượng thận. Ngoài ra, còn có nhiều loại peptit mạch ngắn có phổ hoạt động rộng. Ví dụ: loại peptit tổng hợp hóa học L. Aspatyl phenylalanin methylester là chất ngọt hơn đường tói hàng trăm lần hiện đang được dùng rộng rãi trong công nghiệp và chế biến thực phẩm để thay thế đường. Peptit mạch ngắn tự nhiên bao gồm 9 amino axit do vùng não dưới đồi tiết ra và dự trữ ở thùy sau tuyến yên, có khả năng kích thích dạ con co bóp hoặc peptit ngắn bradykinin gồm 9 amino axit có tác dụng ức chế hiện tượng sưng tấy các mô. Một peptit ngắn khác là enkephalin được tạo ra ở não bộ là chất có tác dụng giảm đau. Bên cạnh đó còn nhiều loại peptit – hoocmon khác có tác dụng khác nhau đối với hoạt động sống của cơ thể. Hóa học tổ hợp đã đóng góp rất nhiều cho vấn đề nghiên cứu các peptit có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên có một hạn chế rất lớn đối với những peptit có giá trị sinh học vì nhu cầu cuộc sống đòi hỏi một số lượng lớn. Và Primm đã giải quyết được vấn đề này: từ các peptit sinh học có nguồn gốc tự nhiên, bằng phương pháp sinh học và nhiều phương pháp khác, ông đã phát triển chúng với qui mô công nghiệp áp dụng trong các lĩnh vực như y dược, hóa học chuẩn đoán và thực phẩm nông nghiệp. Bằng cách đó, các peptit tiếp tục được cải tiến để đạt được những tính chất tốt nhất dùng để chữa bệnh. Lợi thế lớn khi dùng peptit cải tiến là do nó có giá trị sinh học rất cao và hạn chế được tính độc. Bên cạnh đó chi phí tổng hợp cũng thấp hơn. Primm đã đưa ra các bước lựa chọn như sau: Phát hiện ra chuỗi nhỏ nhất gây ra ảnh hưởng sinh học bằng cách kiểm tra và tổng hợp từ đoạn bắt đầu của chuỗi peptit. Phát hiện ra cấu hình hoạt động sinh học bằng cách xác định cấu tạo và cấu trúc hoạt động liên quan. Sự sắp xếp của peptit chứa trong cấu hình đó bằng sự hỗ trợ của máy tính. Tổng hợp hóa học Định giá giá trị sinh học và dược lý, sau đó lập lại bước 3 – 5. Primm đã khai thác từ những hiểu biết về peptit hóa học hiện tại để phát triển, sản xuất và bán độc quyền những peptit được áp dụng trong nhiều lĩnh vực chữa bệnh như tìm được phân tử peptit mới dùng chữa bệnh HIV hay sự phát triển các chất đối kháng neurokinin… Hiện nay, người ta có thể thu nhận các peptide có hoạt tính sinh học bằng nhiều phương pháp: thủy phân protein (dùng enzyme trực tiếp hoặc thông qua quá trình lên men của vi sinh vật), tổng hợp hóa học, kỹ thuật gen. Gần đây, những cơ sở dữ liệu về trình tự của các amino acid trong peptide có hoạt tính sinh học ngày càng được phát triển, từ đó ta có thể xác định những peptide có hoạt tính sinh học tiềm ẩn trong protein. Ngoài ra, do chúng ta đã biết được vị trí thủy phân của các enzyme thủy phân protein như pepsin, trypsin, chymotrypsin, do đó sự giải phóng các peptide có hoạt tính sinh học trong quá trình thủy phân nói chung và tiêu hóa nói riêng là có thể dự đoán được. Chương 2: CÁC PEPTIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG THỰC PHẨM T a có thể phân loại peptide có hoạt tính sinh học theo chức năng của chúng; tuy nhiên hầu hết các chức năng chưa được hiểu rõ về cơ chế tác động của chúng và một peptide lại có thể có nhiều chức năng khác nhau; do đó trong bài này chúng ta sẽ phân loại dựa trên nguồn gốc thực phẩm. Đối với các peptide có hoạt tính sinh học tìm thấy trong mỗi loại thực phẩm chúng ta sẽ nói về những tính chất của chúng. Người ta thường thấy các peptide có hoạt tính sinh học có trong 2 nguồn thực phẩm là sữa và đậu nành. Sữa Mặc dù protein của các động vật và thực vật khác có chứa các peptide có hoạt tính sinh học tiềm ẩn (nằm trong protein), nhưng hiện nay protein từ sữa vẫn là nguồn cung cấp peptide có hoạt tính sinh học chính. Sữa có nhiều chất có hoạt tính sinh học và có tác động có lợi nhiều mặt lên cơ thể. Hầu hết protein của sữa có rất ít hoặc không có hoạt tính sinh học khi ở trạng thái ban đầu, tuy nhiên qua quá trình tiêu hóa hoặc thủy phân thì nó giải phóng ra rất nhiều peptide có hoạt tính sinh học. Protein trong sữa bò chiếm khoảng 2.9-5% khối lượng [11]. Protein này bao gồm: Casein (75-85%), bao gồm: -casein (47-57%) -casein (25-35%) -casein (8-15%) -casein (3-7%) Protein hòa tan (15-25%), thành phần bao gồm: Tên protein Hàm lượng (% tổng khối lượngprotein trong sữa) Kiểu gen Phân tử lượng (Da) Ghi chú -lactoglobulin 7 – 12% A, B, C, D, Dr 18.000 Phân tử gồm 162 gốc axit amin -lactalbumin 2 – 5 A, B 14.200 Phân tử gồm 123 gốc axit amin Proteose-peptone 2 – 4 400 – 40.000 Là sản phẩm thủy phân từ -casein Immunoglobulin 1,9 – 3,3 IgG1, IgG2 IgA IgM 162.000,152.000 400.000 950.000 Serum-albumin 0,7 – 1,3 66.300 Phân tử gồm 542 gốc axit amin Một số hình tiếp theo sẽ cho chúng ta biết thành phần và thứ tự của các amino acid có trong một vài loại protein có trong sữa. Trong bài này, khi ta nói đến 1 đoạn peptide nào đó, ví dụ đoạn 60-62 của -cn thì ta có thể nhìn vào hình 2.1 để biết đoạn peptide này có cấu tạo là Met-Glu-Ala, do đó để đơn giản, trong những phần sau ta chỉ cần viết số thứ tự của peptide mà không cần viết công thức của peptide. Bảng 2.1: Thành phần amino acid của một số loại casein trong sữa (Swaisgood, 1982) Bảng 2.2: Thành phần amino acid của một số protein hòa tan trong sữa (Whitney và cộng sự, 1976) Amino acid Số gốc amino acid trong Amino acid Số gốc amino acid trong -LG (kiểu gen A) -LB (kiểu gen B) -LG (kiểu gen A) -LB (kiểu gen B) Asp 11 9 Val 10 6 Asn 5 12 Met 4 1 Thr 8 7 Ile 10 8 Ser 7 7 Leu 22 13 Glu 16 8 Tyr 4 4 Gln 9 5 Phe 4 4 Pro 8 2 Trp 2 4 Gly 3 6 Lys 15 12 Ala 14 3 His 2 3 ½ cys 5 8 Arg 3 1 Trong thành phần của tất cả các casein có hàm lượng các amino acid không phân cực khá cao (35-45%) như Val, Leu, Ile, Pro, Phe. Trong số đó hàm lượng proline là khá cao: 17, 10, 35, 20 gốc proline trong một mol , , , -casein (mỗi loại casein này có 199, 207, 209, 169 gốc amino acid trong phân tử). Sự có mặt một lượng lớn proline trong phân tử casein làm cho phân tử casein có rất ít cấu trúc xoắn và cấu trúc lá xếp . Điều này làm cho casein dễ bị thủy phân mà không cần phải làm cho nó bị biến tính trước (ví dụ bằng nhiệt hay acid) [11]. Tuy nhiên casein lại chứa rất ít các amino acid chứa lưu huỳnh, điều này làm giảm đi giá trị sinh học của nó. và -casein không chứa cysteine hay cystine, trong khi đó và -casein chứa 2 gốc cysteine trong phân tử mà thông thường tồn tại dưới dạng cầu disulphide. Casein, mà đặc biệt là -casein có rất nhiều Lys, đây là amino acid rất cần thiết mà trong nhiều protein thực vật có rất ít [11]. Hình 2.1: Thứ tự amino acid trong -casein sữa bò (Swaisgood, 1992) Hình 2.2: Thứ tự amino acid trong -casein sữa bò (Swaisgood, 1992) Hình 2.3: Thứ tự amino acid trong -casein sữa bò (Swaisgood, 1992) Hình 2.4: Thứ tự amino acid trong -casein sữa bò (Swaisgood, 1992) Về chức năng, người ta có thể chia peptide có hoạt tính sinh học từ sữa thành nhiều loại [10,16]: Peptide ảnh hưởng lên hệ thần kinh Peptide liên kết với khoáng Peptide điều hòa hệ miễn dịch Peptide ảnh hưởng đến hệ tuần hoàn Ngoài ra còn có các peptide có các chức năng khác (ví dụ như làm co cơ, chống đông máu… ) nhưng các peptide này chỉ chiếm hàm lượng rất nhỏ hoặc có ảnh hưởng không đáng kể nên không được đề cập đến trong bài. Có những peptide có nhiều chức năng (ví dụ vừa ảnh hưởng lên hệ tuần hoàn, vừa ảnh hưởng lên hệ thần kinh), nên sự phân loại trên cũng chỉ mang tính chất tương đối. Các peptide ảnh hưởng lên hệ thần kinh Khái niệm Cho đến nay vẫn chưa có một định nghĩa chính xác về các peptide ảnh hưởng lên hệ thần kinh (neuropeptide – NP). Người ta gọi tên các peptide này chủ yếu là dựa vào kết quả những quan sát về ảnh hưởng của nó lên các hoạt động sinh lý của cơ thể (tên gọi có tính chất lịch sử) hơn là do những hiểu biết chi tiết về cơ chế tác động của chúng. Ví dụ, trong một thời gian khá dài, người ta biết CCK (cholecytokinin) như là hormon ở hệ tiêu hóa, nhưng đến năm 1975 người ta lại phát hiện nó có trong não của chuột, tác động đến hệ thần kinh chuột [24]. Những NP có tính chất tương tự như morphin (như làm giảm đau, dễ ngủ) được gọi là “opioid peptide / opiate peptide – OP” . Các OP có nguồn gốc từ protein thực phẩm được gọi là “exorphin”. Các OP có nguồn gốc từ casein được gọi là “casomorphin”; tương tự, OP có nguồn gốc từ -casein gọi là -casomorphin, đây là một trong những OP từ sữa đầu tiên được phát hiện(Smacchi 1998), từ -LA gọi là -lactorphin, từ serum albumin gọi là serorphin [10,18]. Tuy nhiên, người ta cũng tìm thấy trong protein sữa một số peptide có tính chất ngược lại (đối với hệ thần kinh) với các OP trên; những peptide này có từ sự thủy phân -casein và-casein và được gọi là “casoxin”, nó ảnh hưởng lên chất thụ cảm loại và , nhưng khả năng ức chế của chúng thì kém hơn naloxone [10,18]. Tính chất Trong các exorphin thường có gốc tyrosine ở đầu N và có các gốc amino acid chứa vòng thơm (như tyrosine và phenylalanine) ở vị trí thứ 3 hoặc thứ 4 (đối với -casein và 1 vài -cn thì có 1 gốc arginine đứng trước tyrosine ở đầu N), cấu trúc này giúp cho peptide kết hợp tốt với các cơ quan thụ cảm (receptor). Ví dụ [10,4]: -casomorphin: peptide đoạn 60-69 trong -cn (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn-Ser-OH) kích thích cơ quan thụ cảm kiểu (-type receptor) (có tác dụng đối với các biểu hiện cảm xúc, mất cảm giác đau, hạn chế vận động của ruột và hệ hô hấp). -casomorphin: peptide đoạn 90-96 trong -cn (Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-OH) có tính chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu (có tác dụng đối với các biểu hiện cảm xúc và sự mất cảm giác đau). Ngoài ra còn có các đoạn khác như 90-95, 91-96. -lactorphin: đoạn 50-53 của -LA (Tyr-Gly-Leu-Phe-OH) có tính chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu . Các OP này có tác dụng điều hòa các hành vi cư xử, làm gia tăng hiện tượng mất cảm giác đau, kéo dài thời gian vận chuyển của thức ăn trong ruột, gia tăng sự hấp thụ các amino acid, chất điện ly và nước; kích thích tiết insulin và somastotatin (Meisel 1997b; Xu 1998). -lactorphin: đoạn 102-105 của -LG (Tyr-Leu-Leu-Phe-OH) có tính chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu . Tính chất tương tự -lactorphin. Casoxin: các đoạn peptide từ 25-34, 35-41, 57-60 và 58-61 của -cn . Khi được đưa vào máu, những peptide này có thể đi tới não hay các cơ quan khác và thể hiện những tính chất tương tự như thuốc phiện hoặc morphine. Đó có thể là lý do khiến cho những đứa trẻ sơ sinh trở nên dễ ngủ sau khi uống sữa. Người ta đã làm thí nghiệm với các con bê sơ sinh cho thấy -casomorphin được vận chuyển nguyên vẹn qua thành ruột vào máu, sau đó nó gây ảnh hưởng lên hệ thần kinh gây nên hiện tượng buồn ngủ và trầm tĩnh (Clare 2000). Các peptide liên kết với khoáng Phospho trong sữa có khoảng 900mg/lít, có thể phân thành các loại [11]: Vô cơ: phosphate hòa tan và ở dạng dung dịch keo Hữu cơ: trong phospholipid, casein và đường phosphate, nucleotide Casein chứa khoảng 0.85% phospho; trong đó , và -cn chứa tương ứng là 1.1, 0.6, 0.16% phospho. Nếu tính theo mol thì , , và -cn chứa tương ứng 8(9), 10-13, 5(4), và 1(2,3) mol phospho trong 1 mol phân tử protein. Phospho có vai trò rất quan trọng trong sữa[11]: Về mặt dinh dưỡng, nó có thể kết hợp với các chất khoáng như Ca2+, Zn2+… Làm tăng tính hòa tan của casein Làm tăng tính bền nhiệt cho casein Có ảnh hưởng tới quá trình đông tụ để sản xuất phô mai. Ơû đây chúng ta quan tâm đến khả năng liên kết với khoáng của phospho trong sữa. Phospho liên kết hóa trị với protein khá bền vững. Liên kết này chỉ bị phá vỡ khi có chế độ xử lý nhiệt cao, pH cao và sử dụng phosphatase. Phosphate chủ yếu tạo liên kết ester với serine (và một ít với threonine) tạo monoester: Sự phosphoryl hóa xuất hiện trong màng membrane của thể Golgi của tế bào động vật hữu nhũ, được xúc tác bởi serine-specific casein kinase. Sau khi được giải phóng, những peptide được phosphoryl hóa này (casein phosphopeptide) liên kết với các ion, chủ yếu là Ca2+, một ít Zn 2+, Fe2+, Cu2+, Mn 2+. Từ thứ tự các amino acid trong phân tử protein (casein) và từ các thí nghiệm thực tế, người ta nhận thấy hầu hết CPP (calcium-binding phosphopeptides) có chứa 3 nhóm serine phosphate và theo sau bởi 2 gốc glutamic (Ser-Ser-Ser-Glu-Glu) [10, 11, 25, 30]. CPP là 1 trong những chất bền vững nhất đối với sự thủy phân của enzyme trong ruột, và hầu hết nó được tìm thấy dưới dạng phức với canxi phosphate [10]. Sự kết hợp với Ca2+ tạo nên khả năng hòa tan cao hơn và do đó Ca2+ dễ dàng được hấp thu hơn. Từ đó, CPP có thể có tác dụng có ích cho việc giúp xương cứng chắc. Ngoài ra, CPP cũng giúp làm giảm hiện tượng sâu răng thông qua việc tái tạo canxi cho men răng và ức chế sự bám dính của các vi khuẩn hình thành bựa răng. Do có tính chất này, chúng được ứng dụng để điều trị các bệnh về răng và được cho vào trong kem đánh răng (Darragh 2002). 2.1.3 Các peptide ảnh hưởng lên hệ miễn dịch của cơ thể Cho đến nay thì người ta vẫn chưa hiểu rõ ràng cơ chế làm cho các peptide có ảnh hưởng lên hệ miễn dịch của cơ thể (immunopeptide-IP). Một số peptide từ sữa có thể ảnh hưởng đe