Giá trị của đột biến gen BRAF T1799A trong chẩn đoán ung thư tuyến giáp thể nhú

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  62 GIÁ TRỊ CỦA ĐỘT BIẾN GEN BRAF T1799A   TRONG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TUYẾN GIÁP THỂ NHÚ   Hoàng Quốc Trường*, Ngô Minh Hạnh**, Lê Hữu Song*  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Chọc hút tế bào bằng kim nhỏ (FNAC) là xét nghiệm thường quy trong chẩn đoán trước phẫu  thuật đối với các u tuyến giáp. Tuy nhiên, có khoảng 15% các trường hợp không kết luận được. Đột biến gen  braf T1799A là một trong các dấu ấn phân tử gần đây được cho là có giá trị trong hỗ trợ chẩn đoán ung thư  tuyến giáp thể nhú (UTTGTN).  Mục  tiêu: So sánh độ nhạy  (Se), độ đặc hiệu  (Sp) của kỹ  thuật ASB RealTime PCR phát hiện  đột biến  T1799A với FNAC trong chẩn đoán UTTGTN.  Đối tượng và phương pháp: 45 mẫu nhân giáp được đưa vào nghiên cứu. Chẩn đoán cuối cùng dựa vào  kết quả mô bệnh học sau phẫu thuật. Đột biến T1799A được xác định bằng kỹ thuật ASB RealTime PCR. Độ  nhạy, đặc hiệu, chính xác của ASB RealTime PCR được xác định trên các mẫu FNAC có kết quả chẩn đoán mô  bệnh học.  Kết quả: Độ nhạy, đặc hiệu, chính xác của kỹ thuật ASB RealTime PCR so với FNAC được xác định tương  ứng là 92,3%; 83,3%; 91,1% so với 90,5%; 33,3% và 88,8%.  Kết  luận: Xét nghiệm phát hiện đột biến gen braf T1799A kết hợp với FNAC sẽ làm tăng tính chính xác  của kỹ thuật này trong chẩn đoán ung thư tuyến giáp thể nhú.  Từ khóa: ung thư tuyến giáp thể nhú, FNAC, BRAF  ABSTRACT  THE VALUE OF BRAF T1799A MUTATION ANALYSIS   IN THE DIAGNOSIS OF PAPILLARY THYROID CARCINOMA  Hoang Quoc Truong, Ngo Minh Hanh, Le Huu Song  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 63 ‐ 67  Background: Fine‐needle aspiration cytology is routinely used before surgery of thyroid nodules. However,  15% of FNAC are diagnosed as suspicious for malignancy and undetermined, so that the proportion of patients  with inconclusive results in diagnosis. Recently, BRAF T1799A mutation is one of a valuable molecular markers  in Papillary thyroid carcinoma.  Aims: To compare sensitivity, specificity and accuracy of ASB RealTime PCR detecting T1799A mutation  assay with that of FNAC in the diagnosis of papillary thyroid carcinoma.  Patients  and Methods: A  total  of  45  thyroid  nodules  from  patients were  prospectively  analyzed  for  cytology. A final diagnosis was confirmed by histology after surgery. BRAF T1799A mutation was analysed by  ASB RealTime PCR. A sensitivity, specificity and accuracy of ASB RealTime PCR assay were determined based  on the results of histopathology.  Results: Sensitivity, specificity and accuracy of ASB RealTime PCR assay was 92.3%; 83.3% and 91.1%  compared with 90.5%; 33.3% and 88.8% which was determined by FNAC.  Conclusions: BRAF T1799A mutation  analysis when  combined with FNAC  can  significantly  improve  *Bệnh viện Trung Ương Quân đội 108  **Viện nghiên cứu Y Dược Lâm sàng 108  Tác giả liên lạc: TS. Hoàng Quốc Trường  ĐT: 0988709667  Email: hqtruong2002@yahoo.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  63 FNAC diagnostic accuracy in the diagnosis of thyroid papillary carcinoma.  Key words: papillary Thyroid carcinoma, FNAC, BRAF  ĐẶT VẤN ĐỀ  Kỹ  thuật  chọc  hút  tế  bào  bằng  kim  nhỏ  (FNAC)  là  xét  nghiệm  tế  bào  học  thường  quy  trong chẩn đoán trước phẫu thuật ung thư tuyến  giáp  thể  nhú  (UTTGTN)  với  độ  nhạy,  độ  đặc  hiệu  kỹ  thuật  tương  ứng  đạt  70−98%  và  55−100%(5). Đây  là kỹ  thuật  đầu  tay  trong  thực  hành  lâm  sàng,  tuy  nhiên,  có  tới  15−20%  số  trường hợp không xác định được chẩn đoán và  có  khoảng  10–40%  số  mẫu  bệnh  phẩm  được  chẩn đoán nghi ngờ hoặc không đủ  tiêu chuẩn  xét nghiệm(2,15). Gần  đây kết quả FNAC không  xác  định  được  đề  xuất  chia  thành  3 nhóm:  (1)  Tổn  thương  tế bào nang  tuyến giáp không xác  định  (follicular  lesion  of  undetermined  significance,  FLUS);  (2)  Tế  bào Hurthle;  và  (3)  Nghi  ngờ  ác  tính  (suspicious  for malignancy),  với tỉ lệ dự đoán ung thư tương ứng 5–10%, 20– 30%, và 50–75%(17). Việc phân  loại  trên với mục  đích trả lời kết quả xét nghiệm tế bào học chính  xác  nhất.  Tuy  nhiên,  trong  số  các  trường  hợp  phẫu  thuật  loại bỏ nhân giáp  thì  chỉ  có 8–56%  phát hiện có tế bào ác tính(1), do đó có rất nhiều  bệnh nhân phải chịu cuộc phẫu thuật không cần  thiết dẫn đến nguy cơ mắc thêm bệnh và  thêm  kinh phí điều trị(11). Những bệnh nhân có kết quả  chẩn  đoán  FNAC  không  xác  định  thường  trải  qua một cuộc phẫu thuật hạn chế, cắt một phần  tuyến giáp. Sau khi xác định là ung thư bằng kết  quả giải phẫu bệnh, các bệnh nhân này sẽ phải  chịu cuộc mổ thứ hai để cắt toàn bộ tuyến giáp  nên chi phí điều trị là rất tốn kém. Hơn nữa, có  1–3% số trường hợp chẩn đoán FNAC là âm tính  giả nên bệnh nhân mất cơ hội được điều trị(14). Vì  những  lí  do  trên,  việc  phát  triển  các  phương  pháp chẩn đoán có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hỗ  trợ cho kỹ thuật FNAC chính xác hơn là vô cùng  cấp thiết.  Qua nghiên cứu người ta thấy đột biến gen  braf T1799A là dấu ấn phân tử rất có giá trị trong  chẩn đoán UTTGTN. Đột biến T1799A xuất hiện  trong UTTGTN  với  tần  suất  giao  động  từ  29– 69%(3,10) nhưng chưa có một công  trình công bố  nào cho thấy có sự xuất hiện của đột biến này ở  các  tế  bào  tuyến  giáp  lành  tính(4). Các  kết  quả  công bố  trên  thế giới đã khẳng định giá  trị của  đột biến này khi kết hợp với FNAC sẽ làm tăng  độ nhạy, độ đặc hiệu và  tính chính xác của kỹ  thuật chẩn đoán này(8,16). Từ kết quả nghiên cứu  của đề  tài  tiềm năng mã số KC.10.TN.14/11‐15,  chúng  tôi  đã  xây  dựng  thành  công  kỹ  thuật  khuếch  đại  gen  đặc  hiệu  alen  kết  hợp Blocker  (ASB RealTime PCR) phát hiện đột biến gen braf  T1799A  trong  UTTGTN(9).  Trong  nghiên  cứu  này, chúng tôi đánh giá độ nhạy, đặc hiệu, tính  chính xác của kỹ  thuật ASB RealTime PCR xác  định  đột biến T1799A và  so  sánh với kỹ  thuật  FNAC trong chẩn đoán UTTGTN.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Mẫu chứng dương và chứng âm của nghiên cứu  Dòng  tế bào HT‐29 mang đột biến gen braf  T1799A (ATCC, Mỹ).  Dòng tế bào HCT‐116 mang gen BRAF kiểu  dại (ATCC, Mỹ).  45 bệnh nhân được khám và chẩn đoán bệnh  tại phòng xét nghiệm tế bào ‐ Bệnh viện Nội tiết  Trung Ương và Khoa Giải phẫu bệnh  lý, Bệnh  viện TƯQĐ 108. Tất cả các bệnh nhân này vừa  có kết quả  tế bào học, vừa có kết quả mô bệnh  học sau phẫu thuật.  Cách lấy bệnh phẩm làm xét nghiệm xác định  đột biến gen braf T1799A  Mỗi mẫu  bệnh  phẩm  chọc  hút  được  chia  thành  2  phần:  1/2  được  trải  ra  lam  để  chẩn  đoán tế bào, 1/2 được chia sang ống eppendorf  vô  trùng  để  làm  xét  nghiệm  phát  hiện  đột  biến. Trong các trường hợp chọc hút tế bào mà  lượng  mẫu  bệnh  phẩm  lấy  ít  sẽ  loại  khỏi  nghiên cứu này.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  64 Phương pháp nghiên cứu  Phương pháp  tách chiết ADN  tổng số  từ các  mẫu FNA  Các mẫu  chọc  hút  tế  bào  được  rửa  trong  nước muối sinh lý 0,9% và được tiến hành tách  chiết ADN  tổng  số  theo  quy  trình  của Hoàng  Quốc Trường và cộng sự(6,7).  Phương  pháp  phát  hiện  đột  biến  gen  BRAF  T1799A  bằng  kỹ  thuật  khuếch  đại  gen  đặc  hiệu alen kết hợp Blocker  Trình  tự  primer  và  Blocker  đặc  hiệu  phát  hiện đột biến gen braf T1799A được thiết kế dựa  trên các công  trình đã công bố(16). Đột biến gen  braf  T1799A  được  xác  định  bằng  kỹ  thuật  RealTime PCR kết hợp Blocker. Phản ứng được  tiến hành với thể tích 20 μL, tỉ lệ các thành phần  như sau: 2X PCR master mix SYBR Green (ABI),  mồi  No.1:  5ʹ‐CTGTTTTCCTTTACTTACT  ACACCTCAGAT‐  3’  (0,375 pM), mồi  đặc hiệu  alen No.2: 5’‐CCCACTCCATCGAGATTTCT‐ 3’  (0,375  pM)  và  300  pM  Blocker:  5’‐ CATCGAGATTTCAC  TGTAGCTAGA‐PO4‐3’.  2,5  μL ADN  tổng  số và 0,5  μL nước  cho phản  ứng RealTime PCR. Phản  ứng khuếch  đại gen  đặc  hiệu  alen  kết  hợp Blocker  được  thực  hiện  trên máy RealTime  PCR  7500, Mỹ  với  chu  kỳ  nhiệt như sau: 50°C/5 phút; 95°C/10 phút, 45 chu  kỳ (95°C/15 giây, 60°C/1 phút). Do việc thiết kế  trình  tự  mồi  đặc  hiệu  alen  kết  hợp  sử  dụng  Blocker, phản ứng khuếch đại gen sẽ chỉ xẩy ra  trên mạch khuôn ADN mang điểm đột biến và  được  hiển  thị  ngay  sau mỗi  chu  kỳ  nhiệt  của  phản  ứng  qua  việc  ghi  nhận  tín  hiệu  huỳnh  quang  của  SYBR  Green.  Trong  khi,  các  mẫu  không có tín hiệu huỳnh quang là các mẫu kiểu  dại không chứa đột biến gen braf T1799A(18).  Phương pháp xác định trình tự axit nucleic  Để kiểm định độc lập sự có mặt đột biến gen  braf T1799A  trong mẫu  chuẩn dương HT‐29  và  các mẫu bệnh phẩm FNAC chúng  tôi  tiến hành  giải trình tự trực tiếp đoạn gen bằng cặp mồi (mồi  No.1:  5ʹ‐ CTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGAT‐  3’, mồi No.3: 5’‐CAACTGTTCAA ACTGATGGG‐  3’),  trên  hệ  thống  máy  CEQ  8800  sequencer  (Beckman  Coulter,  Mỹ).  Kết  quả  giải  trình  tự  được phân tích bằng phần mềm BioEdit và công  cụ  so  sánh  trình  tự  trực  tuyến  Blast  search  (  Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu,  chính xác của kỹ thuật ASB RealTime PCR  phát hiện đột biến T1799A  Độ nhạy  của kỹ  thuật  được  tính  theo  công  thức sau:   Độ nhạy =(TP/(TP + FN)) x 100.  Độ  đặc  hiệu  của  kỹ  thuật  được  tính  theo  công thức sau:   Độ đặc hiệu =(TN/(TN + FP)) x 100.  Độ  chính  xác  của  kỹ  thuật  được  tính  theo  công thức sau:   Độ  chính xác =((TP + TN)/(TP + TN + FP +  FN)) x 100.  Trong đó: TP: Là các mẫu FNAC phát hiện dương tính  với đột biến T1799A và kết quả chẩn đoán mô bệnh học  là ung thư tuyến giáp thể nhú; FP: Là các mẫu FNAC  phát hiện dương tính với đột biến T1799A nhưng kết  quả mô bệnh học là lành tính; TN: Là các mẫu FNAC  âm tính với đột biến T1799A và kết quả chẩn đoán mô  bệnh học là lành tính; FN: Là các mẫu FNAC âm tính  với đột biến T1799A và kết quả chẩn đoán mô bệnh học  là ung thư tuyến giáp thể nhú.  Phân tích và xử lý số liệu  Số  liệu nghiên cứu được  tổng hợp và xử  lý  theo phương pháp thống kê y học sử dụng phần  mềm STAT 7.0 và STAVIEW 4.57.  KẾT QUẢ  Kết  quả  chẩn  đoán  tế  bào  bằng  kỹ  thuật  FNAC  Bảng 1. Kết quả chẩn đoán tế bào bằng kỹ thuật  FNAC và mô bệnh học.  FNAC Mô bệnh học Bướu giáp lành tính 3 6 Nghi ngờ carcinôm 5 0 Carcinôm TG 37 39 Tổng số 45 45 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  65 Nhận xét: Sự phù hợp giữa mô bệnh học và  FNAC  là  40/45  (88,9%),  có  5  bệnh  nhân  được  chẩn đoán là nghi ngờ bằng FNAC, trong 5 BN  này có 3 BN là UTTGTN, còn lại 2 BN là u tuyến  giáp lành tính.  Kết  quả  phát  hiện  đột  biến  gen  braf  T1799A bằng kỹ thuật ASB RealTime PCR  trên các mẫu FNAC  Bảng 2. Kết quả phát hiện đột biến T1799A trên 45  mẫu bệnh phẩm FNAC.  Kết quả chẩn đoán FNAC BRAF T1799A (+) (n, %) BRAF T1799A (-) (n, %) Bướu nang tuyến giáp 2 (66,6) 1 (33,3) Nghi ngờ carcinôm 3 (60) 2 (40) Carcinôm TG 32 (86,5) 5 (13,5) Tổng số (n, %) 37 (82,2) 8 (17,8) Nhận  xét:  Như  vậy,  trên  45  mẫu  FNAC  chúng tôi phát hiện được 37 mẫu có đột biến gen  braf T1799A. Tỷ  lệ  đột  biến  gen  braf T1799A  ở  nhóm UTTG cao hơn so với 2 nhóm còn lại.  Giá trị của đột biến gen braf T1799A trong  chẩn đoán ung thư tuyến giáp thể nhú  Bảng 3. So sánh độ nhạy, đặc hiệu, chính xác của kỹ  thuật ASB RealTime PCR phát hiện đột biến T1799A  với kỹ thuật FNAC trong chẩn đoán UTTGTN.  Phương pháp chẩn đoán Độ nhạy Độ đặc hiệu Độ chính xác ASB RealTime PCR 92,3 83,3 91,1 FNAC 90,5 33,3 88,8 Nhận xét: Độ chính xác, độ nhạy và độ đặc  hiệu của kỹ  thuật ASB RealTime  là cao hơn  so  với  FNAC  trong  chẩn  đoán  UTTGTN  (91,1%,  92,3% và 83,3% so với 88,8%, 90,5% và 33,3%).  BÀN LUẬN  Đột biến gen braf là một trong những dấu ấn  phân tử giúp chẩn đoán phát hiện UTTGTN với  độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng 80% và 99,7%  khi kết hợp với kỹ thuật chẩn đoán tế bào(13). Xác  định được đột biến gen braf T1799A sẽ giúp hạn  chế  các  trường hợp  chẩn  đoán UTTGTN bị bỏ  sót  bởi  kỹ  thuật  FNAC,  nâng  cao  chất  lượng  chẩn đoán, theo dõi và quản  lý bệnh nhân. Giá  trị chẩn đoán xác định của các dấu ấn SHPT khi  kết hợp với chẩn đoán tế bào sẽ đem  lại  lợi  ích  cho bệnh nhân  trong  các  trường hợp bắt buộc  phải  phẫu  thuật,  phẫu  thuật  triệt  để  phòng  chống ung thư tái phát.  Trong  chẩn  đoán ban  đầu,  giá  trị  lớn nhất  của dấu ấn phân tử này được thể hiện trong việc  hỗ trợ kỹ thuật FNAC chẩn đoán chính xác hơn,  đặc biệt  trong  các  trường hợp  chẩn  đoán nghi  ngờ hoặc không xác định. Trong công trình công  bố bởi Suk Kyeong Kim và  cộng  sự năm  2011  cho  thấy,  trong  số  865  trường  hợp  FNAC  u  tuyến giáp, 504, 141, 54, 140, 10 và 16 được chẩn  đoán là bướu nhân, nghi ngờ, nghi ngờ ung thư,  ung thư, nghi ngờ ung thư tuyến giáp thể nang  và không đủ tiêu chuẩn. Thì tỉ  lệ phát hiện đột  biến  T1799A  trên  các  nhóm  được  chẩn  đoán  FNAC  tương  ứng:  0%  với  nhóm  bướu  nhân,  45/141 (31,9%) với nhóm nghi ngờ, 46/54 (85,2%)  với nhóm nghi ngờ ung thư, 129/140 (92,1%) với  nhóm ung thư và 1/10 (10%) với nhóm nghi ngờ  ung thư tuyến giáp thể nang. Đặc biệt trong số  45  trường hợp nghi ngờ phát hiện  có  đột biến  T1799A, 30 trường hợp được làm xét nghiệm mô  bệnh học sau mổ xác định 29 ca là UTTGTN và 1  ca  là  hạch  viêm  quá  sản(12).  Trong  nghiên  cứu  của chúng  tôi với 45 mẫu FNAC  thì có 37, 5, 3  mẫu  được  chẩn  đoán  là  carcinôm  tuyến  giáp,  nghi  ngờ  carcinôm  và  bướu  nang.  Tỷ  lệ  phát  hiện  đột biến T1799A  trên  các mẫu này  tương  ứng  là  32/37  (86,5%)  carcinôm  tuyến  giáp,  3/5  (60%)  nghi  ngờ  carcinôm  và  2/3  (66,7%)  bướu  nang. Trong khi kết quả hồi cứu mô bệnh học có  39/45  (86,7%) carcinôm  thể nhú và 6/45  (13,3%)  bướu  tuyến giáp  lành  tính,  tương ứng với  tỉ  lệ  phát hiện  đột biến T1799A  là  36/39  (92,3%) và  1/6 (16,7%) (Bảng 1, 2 và Phụ lục 1). Trong số 05  mẫu FNAC chẩn đoán nghi ngờ carcinôm có 03  mẫu  phát  hiện  đột  biến  T1799A,  phù  hợp  kết  quả mô  bệnh  học  carcinôm  thể  nhú.  2/3 mẫu  FNAC  bướu  nang  dương  tính  với  đột  biến  T1799A, xét nghiệm mô bệnh học xác nhận 01  mẫu  bướu  tuyến  giáp  lành  tính  và  01 mẫu  vi  carcinôm thể nhú. Như vậy, kết quả nghiên cứu  của chúng tôi cũng tương tự như những nghiên  cứu trước đây. Từ những kết quả đó cho thấy độ  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  66 nhạy  của ASB RealTime PCR  thấp  hơn  so  với  FNAC (92,1% so với 97,6%), nhưng độ đặc hiệu  thì cao hơn (83,3% so với 33,3%) và độ chính xác  cũng cao hơn (90,9% so với 89,4%).  KẾT LUẬN  Xét  nghiệm  phát  hiện  đột  biến  gen  braf  T1799A nên được kết hợp với FNAC trong thực  hành  lâm  sàng  chẩn  đoán ung  thư  tuyến giáp  thể nhú.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Baloch ZW, LiVolsi VA, Asa SL, Rosai J et al (2008). Diagnostic  terminology and morphologic criteria  for cytologic diagnosis  of  thyroid  lesions:  a  synopsis  of  the  National  Carcinôm  Institute Thyroid Fine‐Needle Aspiration State of  the Science  Conference. Diagn Cytopathol, 36:425–437.  2. Cooper  DS,  Doherty  GM,  Haugen  BR  et  al  (2006).  Management guidelines for patients with thyroid nodules and  differentiated thyroid carcinôm. Thyroid, 16:109–142.  3. Cooper DS, Doherty GM, Haugen BR, Kloos RT et al  (2006).  Management guidelines for patients with thyroid nodules and  differentiated thyroid carcinôm, Thyroid, 16:109–142.  4. Fukushima  T,  Suzuki  S, Mashiko M, Ohtake  T  et  al  (2003).  BRAF  mutations  in  papillary  carcinôms  of  the  thyroid.  Oncogen, 22: 6455‐6457.  5. Gharib H & Goellner JR (1993). Fine‐needle aspiration biopsy  of the thyroid: an appraisal. Annals of Internal Medicine, pp.  282–289.  6. Hoàng Quốc Trường và cs (2011). Chẩn đoán nhanh vi khuẩn  lao kháng rifampicin bằng kỹ  thuật khuếch đại gene đa mồi  đặc hiệu alen. Tạp chí Y dược lâm sàng 108, 6(5):74–79.  7. Hoàng Quốc Trường và cs (2012). Nghiên cứu xây dựng quy  trình phát hiện đột biến gen braf T1799A trong ung thư tuyến  giáp  thể nhú bằng kỹ  thuật ASB RealTime PCR. Tạp  chí Y‐ Dược học Quân sự, 37: 20 – 25.  8. Kim SK, Hwang TS, Yoo YB, Han HS, Kim DL, et al  (2011).  Surgical  Results  of  Thyroid  Nodules  according  to  a  Management  Guideline  Based  on  the  BRAFV600E  Mutation  Status. J Clin Endocrinol Metab, 96(3): 658 – 64.  9. Lang AH et at (2011). Optimized Allele‐Specific RealTime PCR  assays  for  the detection of  common mutations  in KRAS and  BRAF. The Journal of Molecular Diagnostics, 13(1): 23 – 28.  10. M  Xing  (2005).  BRAF  mutation  in  thyroid  carcinôm.  Endocrine‐Related Carcinôm, 12: 245‐262.  11. Mazzaferri  EL  (1993).  Management  of  a  solitary  thyroid  nodule. N Engl J Med, 328:553–559.  12. Nikiforov  YE,  Steward  DL,  Robinson‐Smith  T,  et  al  (2009).  Molecular  testing  for mutations  in  improving  the  fine needle  aspiration  diagnosis  of  thyroid  nodules.  Journal  of  Clinical  Endocrinology and Metabolism, 94: 2092–2098.  13. Pacini  F  et  al  (2010).  Impact  of  Proto‐Oncogene  Mutation  Detection  in  Cytological  Specimens  from  Thyroid  Nodules  Improves  the  Diagnostic  Accuracy  of  Cytology.  J  Clin  Endocrinol Metab, 95(3):1365– 369.  14. Robertson ML,  Steward  DL,  Gluckman  JL, Welge  J  (2004).  Continuous  laryngeal  nerve  integrity  monitoring  during  thyroidectomy:  does  it  reduce  risk  of  injury?  Otolaryngol.  Head Neck Surg, 131:596–600.  15. Sclabas GM, Staerkel GA, Shapiro SE, Fornage BD, et al (2003).  Fine‐needle  aspiration  of  the  thyroid  and  correlation  with  histopathology in a contemporary series of 240 patients. Am J  Surg, 186: 702–709.  16. Xing M et al (2005). BRAF mutation predicts a poorer clinical  prognosis  for  papillary  thyroid  carcinôm.  J Clin  Endocrinol  Metab, 90: 6373‐6379.  17. Yassa  L,  Cibas  ES,  Benson  CB,  Frates  MC,  Doubilet  PM,Gawande AA, Moore Jr FD, Kim BW, Nose´ V, Marqusee  E, Larsen PR, Alexander EK (2007). Long term assessment of a  multidisciplinary  approach  to  thyroid  nodule  diagnostic  evaluation. Carcinôm, 111:508–516.  Ngày nhận bài báo      18‐06‐2013  Ngày phản biện nhận xét bài báo:  20‐06‐2013  Ngày bài báo được đăng:    15–07‐2013