Giải trình tự gen hp1125 mã hoá cho protein màng ngoài của helicobacter pylor

GIẢI TRÌNH TỰ GEN HP1125 MÃ HOÁ CHO PROTEIN MÀNG NGOÀI CỦA Helicobacter pylori Nguyễn Thị Nguyệt & Nguyễn Thị Hồng Hạnh Viện Công nghệ Sinh Học MỞ ĐẦU Vi khuẩn Gram âm Helicobacter pylori là căn nguyên của các bệnh về tiêu hoá như viêm và loét dạ dày... Vi khuẩn cũng gắn liền với nguy cơ ung thư dạ dày ở những người bệnh nhiễm khuẩn [1, 2]. Ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam, có khoảng hơn nửa dân số bị nhiễm Helicobacter pylori. Hiện nay, trong quá trình điều trị, bên cạnh một số biệt dược, các bác sĩ thường chỉ định sử dùng kháng sinh cho các bệnh nhân. Việc chữa chạy thường gặp thất bại, do rất nhanh chóng, Helicobacter pylori trở nên kháng thuốc [3]. Hai trong những giải pháp tốt nhất để chống vi khuẩn dạ dày mà các nhà khoa học hướng tới là i) tìm ra vacin để phòng ngừa bệnh ii) sử dụng các thuốc ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong dạ dày của bệnh nhân. Để có thể là vaccine chống nhiểm khuẩn Helicobacter pylori, một protein được sử dụng làm kháng nguyên cần phải có thành phần hoá học và cấu trúc ổn định. Các protein màng ngoài của vi khuẩn dường như đáp ứng được yêu cầu như trên. Helicobacter pylori có thể có đến 32 protein màng ngoài [4]. Các protein có thể đóng các vai trò khác nhau, trong đó có vận chuyển các chất vào bên trong tế bào vi khuẩn cũng như tương tác với môi trường xung quanh. Một trong 32 protein màng ngoài nói trên đang được nghiên cứu là protein HP1125. Gen mã hoá cho protein đã được tạo dòng và phân tích lần đầu tiên bởi các nhà khoa học Nam Triều Tiên [5]. Muộn hơn, đầu 5’ của gen của 20 chủng cũng được tạo dòng và phân tích ở Viện Công nghệ Sinh học, Việt Nam [in press]. Các phân tích trên một số trình tự của gen HP1125 đã được công bố cho thấy, cả gen HP1125 và protein HP1125 đều bảo thủ. Tuy nhiên, với một đối tượng siêu đột biến như vi khuẩn dạ dày, các trường hợp bất ngờ dường như có thể xẩy ra. Trong bài báo này, chúng tôii công bố toàn bộ trình tự gen HP1125 của Helicobacter pylori trong sinh thiết một bệnh nhân Việt Nam bị loét dạ dày. Loại trừ một vài đột biến nhỏ, gen HP1125 của vi khuẩn Việt Nam đã bị mất 2 nucleotide ở đầu 3’, dẫn đến sự xuất hiên của một protein với thành phần khác biệt ở đầu C. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Bệnh nhân và sinh thiết: Mẫu sinh thiết dạ dày được lấy bằng phương pháp nội soi từ một bệnh nhân bị loét dạ dày Việt nam chưa được điều trị kháng sinh ở bệnh Viện Hữu Nghị ( Hà Nội). Tách chiết ADN từ sinh thiết dạ dày: ADN của sinh thiết loét dạ dày được tách chiết theo phương pháp như đã miêu tả [6]. Khuếch đại gen HP1125 bằng phương pháp PCR: 10 ng ADN tách chiết từ sinh thiết được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR trong một thể tích 25 l. Các mồi thiết kế có trình tự như sau: F1: ACTTGAATTCCTTGATCGGATTCTTTGATTTC. F2: TTTAGGATCCCCATGGATAATAAGACTGTGGCC. Chương trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC : 1 phút., 55oC : 50 s., 72oC: 50 s Chu kỳ 35 vòng. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1. 2%. Đệm 1 x TAE được sử dụng trong điện di. Giải trình tự gel: Sản phảm PCR của gen HP1125 được phân giải trên gel agarose 0.8% và được làm sạch khỏi các mồi còn thừa sau phản ứng bằng Gene clean Kit. ADN với nồng độ 10 ng/l được sử dụng để giải trình tự tại ADN Core, trường đại học tổng hợp Michigan (Mỹ) theo phương pháp giải trình của Hultman (6a) Phân tích trình tự đoạn ADN: Chương trình Blast trên trang Web được sử dụng để phân tích trình tự cũng như protein cuar gen. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khuếch đại gen HP1125 bằng phương pháp PCR Toàn bộ gen HP1125 được khuyếch đại bằng phương pháp PCR. Sản phẩm PCR là một băng ADN duy nhất có phân tử lượng  540 cặp bazơ ( hình 1). Hình 1. Khuyếch đại gen HP1125 bằng phương pháp PCR M. Thang chuẩn ADN 100 cặp bazơ 1. Sản phẩm PCR có kích thướckhoảng 540 cặp bazo được kiểm tra bằng phương pháp điện di Kết quả giải trình tự Sản phẩm PCR, sau khi làm sạch được giải trình tự trực tiếp không qua giai đoạn tạo dòng phân tử. Kết quả được trình bầy ở hình 2 A và B. Gen HP1125 của Việt Nam đã được đệ trình vào quĩ gen và có số mã là AY513613. Hình 2. Trình tự nucleotide gen HP1125(A) và thành phần của protein tương ứng (B) 18 acid amine có gạch chân dưới làm thành peptide tín hiệu. Phân tích gen ở mức độ ADN và protein A) Ở mức độ ADN Trình tự của toàn bộ gen HP1125 vừa được giải mã được so sánh với gen tương ứng của các chủng nước ngoài bằng chương trình Blast. Nhìn chung, gen của Việt nam có sự tương đồng khá cao với gen tương ứng của một số chủng của nước ngoài (bảng 1) Tuy nhiên, nếu nghiên cứu kỹ hơn trình tự, có thể thấy sự khác nhau chủ yếu do các đột biến điểm. Đặc biệt, gen HP1125 của Việt Nam bị mất hai cặp bazo tg ở đầu 3'. Vì vậy, nó đã làm stop codon ở cách đó không xa biến mất. Một trong các kết quả so sánh bằng Blast với Omp22 của chủng Hàn Quốc được trích dẫn ở dưới. B) ở mức độ protein Protein của gen vừa được giải mã được so sánh với protein Omp22 của chủng Helicobacter pylori của Hàn Quốc. Có thể dễ dàng nhận thấy, có hai acid amin ở vị trí 46 (I46T) và 167 (K167R) của protein đã bị thay đổi. Đặc biệt, do quá trình đột biến đứt đoạn của hai cặp bazo ở cuối gen, nên đã xảy ra qua trình xê khung dịch mã ở gen của chủng Viêt Nam. Stop codon của gen đã bị đảy lùi về phía sau, làm phần cấu trúc của gen trở nên dài hơn. Những sự thay đổi nói trên đã dẫn tới những sự thay đổi thành thần của protein ở đầu 5’. Protein giả định HP1125 sẽ có ít nhất 5 acid amine mới là QISEV Hình 3: So sánh thành phần của protein HP1125 và Omp22. Trình tự của protein HP1125 và protein màng ngoài của các vi khuẩn nứơc ngoài được so sánh và trình bầy ở dưới. Có thể thấy: đầu N’ của protein có thể khác nhau về một vài acid amine, trong khi đó đầu C của chúng dường như bảo thủ hơn. Nếu như không xét đến chủng Việt nam, thì phần C’ của protein của vi khuẩn Helicobacter pylori thường có một môtip giống nhau là vklvk hoặc vklmk. Protein HP1125 chủng của Việt Nam, do một đôt biến đứt đoạn của hai cặp bazo, có thành phần acid amine đặc biệt với ít nhất là 5 acid amine mới qisev ở đầu C’. Đó có thể là một epitope thẳng với những khả năng gây đáp ứng miễn dịch mới đối với con người . HP1125 là một protein màng ngoài của vi khuẩn Helicobacter pylori. Các biến thể riêng rẽ của protein HP1125 có thể gắn liền với một kiểu tương tác với tế bào dạ dày. Những nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc xác định mối tương quan của các biến thể gen HP1125 của Helicobacter pylori với các đáp ứng miễn dịch ở người bệnh sẽ được tiến hành cùng với các nghiên cứu ảnh hưởng của các biến thể HP1125 lên tế bào ung thư dạ dày. Hình 4 - So sánh các protein của các chủng Helicobacter pylori 1) Omp22 2) HP1125 3) Omp 18 và 4) J99. KẾT LUẬN Gen HP1125 mã hoá cho protein màng ngoài của Helicobacter pylori đã được giải toàn bộ trình tự. Đó là một biến thể không giống các gen cùng một họ đã biết từ trước đến nay - kết quả của một đột biến đứt đoạn của hai nucleotide ở đầu 3’ của gen. Protein có phân tử lượng lớn hơn các biến thể Hp1125 đã biết, với ít nhất 5 acide amine mới ở đầu C. Sự xuất hiện của biến thể protein màng ngoài HP1125 với những đặc điểm mới sẽ là một thách thức với hệ thống miễn dịch của con người. Những phản ứng miễn dịch mà biến thể gây ra đối với con người hoàn toàn chưa được biết. Lời cảm ơn: Các tác giả cảm ơn GS Henley, S. Henley., TS Dave. L (Đại học tổng hợp Michigan Mỹ) đã tận tình giúp đỡ chúng tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Forman, D., Webb, P and Parsonnet, J (1994). Helicobacter pylori and gastric cancer. Lancet 34: 243-244. 2. Sipponen ,P., Seppala, K., Aarynen, M., Hekske, T and Kettunen, P (1989). Chronic gastritis and duodenal ulcer: a case control study on risk of coexisting duodenal or gastric ulcer in patients with gastritis. Gut 30: 922-929. 3.Malfertheiner, P (1993). Conpliance, adverse site-events and antibiotic resistance in Helicobacter pylori treatment. Scand. J. Gastroenterol. 196: 34-37. 4. Alm , R.A et al (1999). Genomic sequnce comparision of two unrelated isolates of human gastric pathgen Helicobacter pylori. Nature 397: 176-180. 5. Kim, J.S., Chang, J.H., Seo, w.Y., Yu,G.J., Chung, S.I and Yum, J.S (2001). Cloning and characterization of a 22 kDa Outer – membrane protein (Omp22) from Helicobacter pylori. Mol. Cells. Vol 10, N06., pp 633-641. 6. Trần Quỳnh Hoa., Lê Băng Sơn., Nguyễn Thị Thanh Lợi, Hoàng Tuấn Anh, Nguyễn Thị Nguyệt, Bùi Phương Thuận, Đặng Đức Trạch, Nguyễn Thi Hồng Hạnh (2001). Sự đứt đoạn của hai nucleotide ở đầu 5’ của gen cagA của vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng Việt nam. Hội thảo quốc tế về Sinh vật học. Hà nội, Việt nam. Trang 198 - 205. 6a. Hultman, T., Beregh, S., Molk, T. and Uhlen, M (1991). Biirectional solid-phasesequencing of in vitro amplified plasmid DNA. Biotechnique 10: 84-93. SEQUENCING AND ANALYZING HELICOBACTER PYLORI HP1125 GENE CODING FOR AN OUTER MEMBRANE Nguyen Thi Nguyet and Nguyen Thi Hong Hanh Institute of Biotechnology Gene HP1125 codes for an outer membrane protein of gastric Helicobacter pylori. The gene was amplified by PCR using the genomic DNA isolated from the biopsy taken from a Vietnamese patients suffering gastric ulceration. The PCR product was sequenced directly by solid-based sequencing method. Analyzing the complete sequence of the gene revealed a number of mutations mostly point, occurring in comparison with the same gene of Helicobacter pylori strains isolated in different countries. A deletion of two nucleotide in the 3’ ends, leading to the frame shift of the gene. As the consequence, the stop codon of the HP1125 gene disappears. Due to that event, the ORF of the gene has extended, making the putative HP1125 protein longer and the C terminus of the protein possede at least 5 new amino acids . Người thẩm định nội dung khoa học : TS. Đinh Duy Kháng.