Giới thiệu về vi khuẩn Lactic

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 1 ‐  CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 2 ‐  1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Lactic [18, 21] Theo hệ thống phân loại của Bergey năm 1979 thì vi khuẩn lactic được phân loại như sau: Họ: Lactobacteriaceae. Họ phụ: Streptoccaceae. Giống: Streptococcus. Leuconostoc. Họ phụ: Lactobacteriaceae. Giống: Lactobacterium. 1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.1.1.1. Lịch sử Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân loại cũng như chức năng của vi khuẩn này. Năm 1906 Metchnikoff xuất bản cuốn “The problongation of life optimistic studies”. Ông chứng minh rằng vi khuẩn lactic trong yaourt bulgarian như là nhân tố chống lại sự thối rữa ruột và sự lão hoá. Tuy nhiên sau đó người ta khám phá ra rằng chủng vi khuẩn này không thể sống sót khi qua dạ dày và ruột. Do đó người ta nhanh chóng thay thế chủng vi khuẩn này bằng chủng Lactobacillus acidophilus như là một probiotic trong ruột. Họ thấy rằng có rất nhiều vi khuẩn Lactobacillus lên men đồng hình và dị hình sống trong ruột, miệng và âm đạo nhưng chiếm ưu thế nhất trong số đó là 6 loài Lactobacillus lên men đồng hình tạo thành nhóm gọi là phức hợp Lactobacillus acidophilus. 1.1.1.2. Đặc điểm Lactobacillus acidophilus thuộc họ vi khuẩn lactic. Chúng có dạng trực khuẩn dài và chịu nhiệt. Tế bào hình que, đầu tròn, kích thước 0,6 – 0,9 1,5 - 6 , đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hay thành chuỗi ngắn, không di động, không sinh bào tử, tế bào non bắt màu gram dương khi nhuộm, tế bào già trở thành gram âm. Vi hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC, không phát triển ở 20 – 22oC và 43 – 48oC. Trên môi trường nước chiết cà chua hay nước chiết nấm men khuẩn lạc có dạng tròn, nhỏ ở giữa dày và đục hơn ở mép ngoài. Trong môi trường thạch sâu khuẩn lạc nhỏ có hình dạng không ổn định. Trên môi trường thạch nghiêng thì khuẩn lạc khô, phát triển kém và giới hạn theo vết cấy. Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 3 ‐  Lên men lactic đồng hình, tích tụ 2,2% acid lactic trong môi trường, không phát triển trong môi trường hydratcarbon, môi trường khoai tây, phát triển tốt trên môi trường dịch thể cao nấm men. Lactobacillus acidophilus là một dạng probiotic được sử dụng thường xuyên nhất. Là vi khuẩn có lợi cư trú trong ruột, âm đạo, trong phân người và động vật. Chúng có khả năng sinh Bacteriocin là chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Lactobacillus acidophilus có khả năng lên men các loại đường: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose và không lên men xylose, arabinose, ramnose, glycerol, mannitol, sorbitol, inositol. Cho các phản ứng: methyl red (+), indol (–), VP (–), citrate (–), catalase (–), khả năng đông vón sữa (+). 1.1.1.3. Các quá trình trao đổi chất Hiện nay các thành viên của phức hợp Lactobacillus acidophilus được phân vào nhóm lên men đồng hình bắt buộc. Hexose được lên men để tạo thành acid lactic theo con đường EMP. Chúng có enzyme aldolase nhưng thiếu phosphoketolase, không lên men gluconat và peptone. Tất cả các loài đều tạo đồng phân dạng D và L của acid lactic. 1.1.1.4. Sự thay đổi thành phần của sữa trong quá trình lên men Trong quá trình lên men sữa tạo thành sản phẩm sữa chua có sự thay đổi màu sắc của các loại đường, casein và các thành phần khác. - Sự thay đổi đường sữa: vi khuẩn lactic sử dụng đường lactose nhờ hệ thống enzyme lactase để chuyển hoá lactose thành glucose và galactose. Lactase là một endoenzyme nên khi lactose muốn được chuyển hoá thì phải qua màng vi khuẩn. Lactose sẽ được chuyển hoá theo hai con đường: ƒ Vi khuẩn sử dụng enzyme lactase để bẻ gãy Hydro chuyển lactose thành glucose và galactose. ƒ Lactose được oxi hoá thông qua enzyme lactosehydrogenase thành lactosebionate sau đó phân giải tiếp thành gluconate và galactose qua một giai đoạn diễn biến phức tạp, mỗi giai đoạn do một enzyme chuyên biệt phụ trách. - Sự thay đổi protein sữa: trong quá trình lên men, lượng acid hữu cơ các loại càng tích luỹ càng làm tăng quá trình phân tách calci ra khỏi casein, khi đó calci sẽ tác dụng với acid lactic tạo lactat calci, giúp cơ thể dễ dàng hấp thu calci hơn và tạo pH đẳng điện. Do đó, casein bị Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 4 ‐  vón lại làm tăng quá trình lên men tạo peptone và các sản phẩm khác. 1.1.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. 1.1.2.1. Trong công nghiệp Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic. Có vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt. Chúng được dùng để acid hoá rượu vang và hoa quả nghèo acid, ngoài ra còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chết dẻo. 1.1.2.2. Trong nông nghiệp và môi trường Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium, loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu đi và đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng. Chế phẩm EM (Effective Microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu nó bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường. 1.1.2.3. Trong y dược Vi khuẩn lactic được sử dụng trong y học để chữa bệnh đường ruột, dùng trong phẫu thuật chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa… 1.1.2.4. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm Trong bảo quản và chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng để làm dưa chua, làm chua quả mà không làm mất màu tự nhiên của quả. Dùng trong sản xuất tương, đậu phụ hay lên men sữa. 1.2. Giới thiệu về probiotic [19] 1.2.1. Lịch sử và định nghĩa về probiotic 1.2.1.1. Lịch sử về probiotic Probiotic có nghĩa là “for life”, ngày nay được dùng để chỉ những vi sinh vật có lợi cho người và động vật do Dr.Eli Metchinikoff, một nhà khoa học người Nga đạt giải Nobel năm 1908, đưa ra khi ông nghiên cứu về vai trò của những vi khuẩn có lợi trong đường ruột. Ông là người đầu tiên đưa ra giả thiết về cuộc sống khỏe mạnh và tuổi thọ cao của những người nông dân Bulgari, khi họ sử dụng những sản Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 5 ‐  phẩm sữa lên men hằng ngày, đặc biệt là yaourt giúp bảo vệ hệ thống đường ruột khỏi những viêm nhiễm. Những thập niên sau đó, ông tiếp tục nghiên cứu để chứng minh chủng thuộc Lactobacillus có khả năng chống lại các vi sinh vật gây bệnh và giảm độc tố do chúng sinh ra. Cũng vào thời điểm đó, Henry Tissier, là một bác sĩ khoa nhi người Pháp, đã quan sát trong phân những đứa trẻ bị tiêu chảy có một số lượng ít vi khuẩn lạ, hình Y, là những vi khuẩn “bifid” ngược lại chiếm số lượng lớn trong những đứa trẻ khỏe mạnh. Và ông cho rằng những con vi khuẩn này có khả năng chống lại bệnh tiêu chảy giúp khôi phục hệ thống vi sinh vật đường ruột khỏe mạnh. 1.2.1.2. Định nghĩa về probiotic Metchnikoff và Tissier là những người đầu tiên đưa ra giả thiết về probiotic. Nhưng đến năm 1960, probiotic mới được sử dụng để chỉ những vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển của các vi sinh vật khác Năm 1989, Fuller định nghĩa lại, ”Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng chúng mang lại những lợi ích cho vật chủ bằng cách củng cố cân bằng hệ thống vi sinh vật đường ruột”. Một định nghĩa tương tự do Havenaar và Huis in’t Veld (1992) đưa ra “Probiotic là một hay hỗn hợp nhiều vi khuẩn mà khi cung cấp cho người hay động vật thì mang lại những hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng cách tăng cường những đặc tính của các vi sinh vật trong hệ tiêu hóa”. Một định nghĩa mới đây nhưng chưa phải là cuối cùng “Probiotic là vi sinh vật sống mang lại hiệu quả về sức khỏe cho vật chủ” (Guarner và Schaafsma, 1998). Tuy nhiên tất cả những định nghĩa này đều có chung những điểm cơ bản sau: - Probiotic là những vi sinh vật sống. - Khi các Probiotic được cung cấp với liều lượng thích hợp thì mang lại những hiệu quả mong muốn. 1.2.2. Vai trò của probiotic - Tăng “ thành bảo vệ” miễn dịch, một số có khả năng kích thích cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, cùng với việc sinh ra sIgA ở màng nhầy. - Kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus, nấm có hại. - Có khả năng xâm chiếm đường ruột, bám vào màng nhầy ruột. - Có khả năng chịu được acid dạ dày, chịu được muối mật. Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 6 ‐  - Sinh ra các chất chống vi sinh vật gây bệnh như Samonella, E. coli, Clostridium… - Phòng và chữa một số bệnh đường tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ dày …. - Giảm triệu chứng dị ứng, triệu chứng không dung nạp được lactose. - Ngăn chặn ung thư đường ruột, ung thư ruột kết. Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterum, ngoài ra Enterococcus và Streptococus cũng được sử dụng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột. Một số chủng tiêu biểu bao gồm Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem là probiotic. Bảng 1.1: Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic [17]. Chủng Lactobacillus Chủng Bifidobacterium Các chủng khác L. acidophilus L. casei L. rhamnosus L. reuteri L. bulgaricus L. plantarum L. johnsonii L.lactis L.gasseri B. bifidum B. longum B. breve B. infantis B.lactis B. adolescentis Bacillus subtilis E. coli Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces boulardii Streptococus thermophilus Streptococus faecalis 1.2.3. Tác dụng của probiotic đến sức khoẻ con người 1.2.3.1. Thuỷ phân lactose, tăng sự hấp thu lactose Sự có mặt của lactose disacharide cùng với việc thiếu hụt enzyme ß- galactosidase(lactase) trong đường ruột có thể gây nên các triệu chứng khó chịu như đầy hơi, đau bụng, hay giới hạn việc hấp thu canxi… ở một số người. Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 7 ‐  Các probiotic đóng vai trò quan trọng trong việc chữa trị việc kém hấp thu lactose và sự thiếu hụt enzyme lactase. Suốt quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh enzyme lactase thuỷ phân lactose thành glucose và galactose. Việc bổ sung Lactobacillus có thể làm tăng khả năng lên men lactose và do vậy cải thiện được triệu chứng không dung nạp lactose. Các vi khuẩn đường ruột giúp chuyển hoá hầu hết lượng lactose không được hấp thu ở ruột non. Ngoài ra các vi khuẩn Lactobacillus làm tăng thời gian vận chuyển lactose từ miệng đến lúc bài tiết theo phân, do đó cơ hội cho việc tiêu hoá lactose nhiều hơn 1.2.3.2. Giảm một số bệnh về đường tiêu hoá ¾ Ung loét Bệnh loét trong hệ thống tiêu hoá có liên quan đến chế độ ăn uống hàng ngày, ít sử dụng các sản phẩm sữa lên men và rau quả, sử dụng quá nhiều sữa, thịt, tinh bột. Việc sử dụng nhiều sản phẩm sữa lên men làm giảm nguy cơ bị ung loét trong hệ tiêu hoá. Các nghiên cứu cho thấy rằng L.acidophilus và B.bifidum hoạt động như một liệu pháp sinh học cho viêm dạ dày và tá tràng. S. boulardii đã được chứng minh có hiệu quả trong việc điều trị bệnh viêm loét dạ dày. Ngăn chặn Helicobacter Pylori: Ngày nay người ta sử dụng probiotic trong việc chống lại Helicobacter Pylori, một vi sinh vật Gram âm gây bệnh viêm dạ dày loại B, loét trong hệ tiêu hoá và ung thư dạ dày. In vitro và ở động vật, người ta còn chỉ ra rằng vi khuẩn Lactic có thể ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh và làm giảm hoạt tính của enzyme urease, mà enzyme này cần thiết cho các vi sinh vật gây bệnh lưu trú trong môi trường acid của dạ dày. Cùng với việc nhiễm H.pylori, lượng L.actobacillus trong dạ dày cũng thiếu hụt, cũng như việc giảm số lượng Bifidobacteria đồng thời với việc tăng lượng Enterobacteria, và sự thay đổi trong hệ thống miễn dịch ở đường ruột. Do vậy việc củng cố lại hệ vi sinh vật đường ruột và sự rối loạn miễn dịch bằng Bifidobacteria và Lactobacilli sẽ mang lại kết quả khá tốt. Ngoài ra H.pylori cũng cần một khoảng thời gian để tiến đến biểu mô dạ dày, và do đó thành phần vi sinh vật đường ruột là rất quan trọng đối với việc nhiễm H.pylori. Ngoài ra các nghiên cứu in vitro cũng đã chứng minh rằng L.salivarius có khả năng sinh ra một lượng lớn acid lactic và vì vậy có khả năng ngăn chặn hoàn Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 8 ‐  toàn sự phát triển của H.pylori. Một số nghiên cứu cũng cho thấy sự phát triển của H.pylori cũng bị ngăn chặn bằng hệ thống miễn dịch và bằng Lactobacilli trước khi chúng xâm chiếm dạ dày. Ở một số nghiên cứu khác, Midilo et al. cho thấy 6 chủng thuộc L.acidophilus và một chủng thuộc L.casei, L.rhamnosus ngăn chặn được sự phát triển của H.pylori. Ngoài ra các chất kháng sinh tự nhiên lactoferrin có khả năng kiềm hãm được H.pylori với hàm lượng 0,5 mg/ml. ¾ Tác dụng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh – bệnh tiêu chảy Tác dụng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh Các probiotic có tác dụng ngăn chặn các vi sinh vật có hại bằng các cơ chế: 9 Sinh các acid acetic, acid lactic, và các acid hữu cơ khác, làm giảm pH môi trường ảnh hưởng bất lợi đối với một số vi sinh vật nhạy cảm với tính acid. Lactobacilus acidophilus và Bifidobacteria giúp cân bằng đường ruột mạnh khoẻ. Chúng có khả năng sinh các acid hữu cơ làm giảm pH đường ruột và do đó ngăn chặn được những vi sinh vật nhạy cảm với acid trong đó bao gồm nhiều vi sinh vật gây bệnh. Lactobacilli là loài có khả năng chịu được acid tốt hơn so với các loài khác, chúng sinh acid lactic hydrogen peroxide và có thể có acid acetic và acid benzoic. Bifidobacteria có khả năng sinh những chuỗi acid béo ngắn (short-chain fatty acids – SCFAs) như acid acetic, propionic, butyric, formic và acid lactic. Tại giá trị pH tối ưu chúng có khả năng hạn chế việc phát triển của tế bào vi khuẩn. SCFAs dồi dào nhất do Bifidobacteria sinh ra là acid acetic, acid này có phổ hoạt động chống vi khuẩn và chống nấm rộng nhất. 9 Sinh các chất kháng sinh tự nhiên (Bacteriocin) Bacteriocin là những chất ức chế đặc biệt được các vi sinh vật tiết ra và ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật khác, chủ yếu là vi khuẩn. Bacteriocin là các peptide, polypeptide, protein hoặc là những chất ít mang cấu trúc gen của protein và được cấu tạo từ các amino acid, cũng có thể bao gồm các amino acid hiếm như lanthionine hay beta-methyllanthionine. Các vi sinh vật sinh bacteriocin thường xuất hiện tự nhiên như trong sữa và các sản phẩm từ sữa. Việc sử dụng các vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin đã Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 9 ‐  có từ nhiều thế kỷ trước trong việc bảo quản thực phẩm. Mỗi bacteriocin cũng chỉ có tác dụng với một số nhóm vi sinh vật xác định. Bacteriocin của các vi khuẩn lactic được chia làm 4 nhóm sau: - Nhóm 1 chứa lanthibiotic: đây là những peptic nhỏ và có khả năng chịu nhiệt, chứa amino acid như lanthionine. - Nhóm 2 chia thành 3 nhóm nhỏ trong đó nhóm 2a thường gặp nhất bao gồm các bacteriocin như pediocin có khả năng chống Listeria. - Nhóm 3 là những nhóm protein không bền nhiệt. - Nhóm 4 là phức hợp của protein, lipid, và glucid. Bảng 1.2: Một số bacteriocin của các probiotic [19] Vi sinh vật Bacteriocin Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus 11088 Lactobacillus acidophillus NCFM Lactobacillus casei B80 ,LHS Lactobacillus brevis Lactobacillus bulgaricus Bacillus subtilis 168, JH642 Enterococcus faecalis 226, INIA4 Enterococcus faecalis S-48 Enterococcus spp. Lactobacillus plantarum A2, BN,C- 11,LPCO-10, MI406, NCDO 1193, SIK-83, CTC 305 Lactoccocus lactis subsp.lactis Lactocicin Lactacin F, lacidin, acidophilin Lactacin B Caseicin 80, caseicin LHS Lactobacillin, brevicin Bulgarican Subtilin, thermophilin, subtilosin Enterocin 226NWC, AS-48 Bacteriocin Bc-48 Enteroccins BN, plantaricin A and D, lactolin, plantaricin BN,A,S Nisin Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 10 ‐  Bảng 1.3: Một số bacteriocin từ loài Lactobacilli [19] Bactericin Vi sinh vật Acidolin L.acidophilus Acidophilin L.acidophilus Bulgarin L.bulgaricus Lactacin B L.acidophilus Lactacin F L.acidophilus Lactibrevin L.brevis Lactobacillin L.brevis Lactolin L.plantarum Lactolin 27 L.helveticus Plantaricin A L.plantarum Plantaricin B L.plantarum Plantaricin SIK-83 L.plantarum Reuteri L.reuteri Bacteriocin do các chủng thuộc Lactobacillus tiết ra thường có khả năng ngăn chặn cả những vi khuẩn có mối liên hệ thân cận. Bacteriocin của chủng Lactobacillus acidophillus NCFM gọi là Lactacin B có khả năng ngăn chặn một số chủng thuộc Lactobacillus (L.bulgaricus và L.helveticus), như vậy sẽ thuận lợi cho việc sinh trưởng của NCFM trong hệ thống ruột. Do đó việc trộn chung các loài khác nhau sẽ tác động qua lại giữa các loài, làm cho một số loài bị hạn chế khả năng của chúng, ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Một số Enterococci có trong các sản phẩm sữa có khả năng sinh các bacteriocin ngăn chặn sự hư hỏng thức ăn và một số vi sinh vật gây bệnh như Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp ‐ 11 ‐  Listeria monocytogenes, Staphylococcus eureus, Vibrio cholerae, Clostridium spp , Bacillus spp. 9 Tranh giành nơi cư trú, tranh giành chất dinh dưỡng, ngăn chặn sự bám chặt và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. 9 Tạo ra nh