Kết quả phân lập vi khuẩn lên men lactic

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1. Phân lập vi khuẩn lên men lactic: Việc phân lập vi khuẩn lactic được tiến hành trên nhiều nguồn khác nhau. Các nguồn phân lập chủ yếu là các loại thực phẩm lên men truyền thống như sữa chua và nem chua. Đây là những nguồn phổ biến đã được sử dụng trong rất nhiều đề tài phân lập hay nghiên cứu về vi khuẩn lactic, và cụ thể hơn là các nguồn được chọn lựa để phân lập trong đề tài này hoàn toàn khác với các nguồn đã được chọn trong đề tài tốt nghiệp “PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN LACTIC CÓ NGUỒN GỐC THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM MANG HOẠT TÍNH PROBIOTIC” của khóa 2005, khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Hutech. Nguồn phân lập được chọn ở đây là các sản phẩm mới, có nguồn gốc, xuất xứ và mang tính địa phương khác nhau với mong muốn thu thập được những chủng vi khuẩn lactic mới, đóng góp thêm vào bộ sưu tập giống. Cùng với việc chọn lựa từ những nguồn mới, việc phân lập cũng tiến hành trên các sản phẩm lên men đã được công nhận và tận dụng những kết quả nghiên cứu có sẵn với ý nghĩa chắc chắn có sự hiện diện của vi khuẩn lactic với sự đảm bảo của nhà sản xuất như các sản phẩm sữa chua uống men sống yakult được công bố là có chứa lợi khuẩn Lactobacillus casei Shirota ở dạng sống do tiến sĩ Nhật Bản Minoru Shirota (1899-1982) nuôi cấy được vào năm 1930. Một nguồn phân lập khác nữa là từ phân của trẻ sơ sinh đã được nghiên cứu là có chứa hệ vi khuẩn đường ruột sống do cơ thể trẻ nhận được trong lúc quá trình bào thai và sau khi bú sữa mẹ (Rocío Martín et al, 2003), (E. Vlková et al, 2003), (J. Agric, 2002). Môi trường sử dụng để phân lập là MRS agar là môi trường chọn lọc chứa nhiều thành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (DeMan et al., 1960). Ở vi khuẩn khi ta nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí ta sẽ loại bỏ được vi khuẩn hiếu khí và ngược lại. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms) và không hô hấp nên để tăng khả năng chọn lọc, nên em đã bổ sung natri azide (NaN3) vào môi trường MRS với nồng độ 0.02% nhằm ức chế vi khuẩn hiếu khí và tăng điều kiện kỵ khí bằng cách dán kín các đĩa pettri bằng màng nhựa PVC. Vi khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch với các khuẩn lạc màu trắng, nhỏ (Sharpe, 1979) sẽ được chọn (hình 4.1). Từ đó em đã chọn lựa và nuôi cấy được 38 chủng có hình thái khuẩn lạc đồng nhất có khả năng là vi khuẩn lactic. Các chủng tuyển chọn được kí hiệu theo bảng 4.1 . Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic Bảng 4.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập. Sản phẩm Tên sản phẩm Kí hiệu các chủng phân lập Nem Nem Đồng Tháp Na1, Na2, Na3, Na4, Na5, Na6, Na7, Na8 Nem Tiền Giang Nb1, Nb2, Nb3, Nb5, Nb8, Nb9, Nb10, Nb11 Sữa chua men sống Yakult Y1 Beta gen B1, B2, B3 Probi (Vinamilk) P1, P2 Sữa chua Long Thành L1, L2, L3 Cứt xu em bé E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10 4.2. Định danh các chủng phân lập Sau khi đã có được các chủng vi khuẩn đồng nhất, em tiến hành định danh các chủng phân lập bằng phương pháp cổ điển: khảo sát hình thái, sinh lý và sinh hóa như đã nêu ở mục 2.3.4 4.2.1. Nhuộm Gram Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương nên bước đầu tiên tiến hành định danh chúng ta tiến hành nhuộm Gram đối với các tế bào còn non (trong khoảng 24 giờ nuôi cấy) vì khi già vi khuẩn lactic đều trở thành Gram âm. Khi tiến hành nhuộm Gram, trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương (hình 4.2) và vi khuẩn E. coli Gram âm (hình 4.3) có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng. Sau đó tiến hành nhuộm Gram 38 chủng đã phân lập và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận. Trong số 38 chủng phân lập, 5 chủng thể hiện Gram âm (Na7, Nb9, L3, E5, E7). 10/30 chủng Gram dương còn lại có hình thái, kích thước tế bào trùng với các chủng khác có cùng nguồn, nên số chủng Gram dương rút xuống còn 23. Ở bước nhuộm Gram này ta đã tăng tính an toàn cho các chủng vi khuẩn được chọn vì đã loại bỏ một số chủng vi khuẩn gây bệnh là Gram âm ví dụ như vi khuẩn E. coli. Hình 4.2: Vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương bắt màu tím. Hình 4.3: Vi khuẩn E. coli Gram âm bắt màu đỏ  Từ việc nhuộm Gram, ngoài việc xác định vi khuẩn là Gram âm hay Gram dương ta còn có thể quan sát hình thái của vi khuẩn và mô tả hình dạng của 23 chủng Gram dương thì có : 20 chủng hình que. 2 chủng hình cầu. 1 chủng hình ovan Kết quả mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn được thể hiện ở bảng 4.2. Sau bước nhuộm Gram, ta thu được 23 chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc và tế bào khác nhau, hoặc một số trong đó giống nhau về hình thái khuẩn lạc nhưng khác nhau về hình dạng tế bào và khác cả về nguồn phân lập. Như vậy, dựa vào kết quả nhuộm Gram và mô tả hình thái vi khuẩn, từ 38 chủng có khả năng là vi khuẩn lactic được lựa chọn ban đầu, ta đã rút ra được 23 chủng có nhiều khả năng là vi khuẩn lactic hơn. Tuy nhiên vẫn có một số chủng là vi khuẩn Gram dương những không phải là vi khuẩn lactic, nên ta phải tiếp tục tiến hành các bước kiểm tra tiếp theo đối với 23 chủng trên để sàng lọc ra những chủng mang đặc điểm của vi khuẩn lactic dựa vào những mô tả trong Berger’s manual. Bảng 4.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x10 và hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi x100 Kí hiệu chủng phân lập Mô tả khuẩn lạc và quan sát khuẩn lạc Quan sát nhuộm Gram và mô tả hình thái vi khuẩn Na2 Vi khuẩn hình que ngắn, không có thắt Khuẩn lạc rất nhỏ, mép gợn sóng, màu trắng sữa, dẹp Na3 Khuẩn lạc tròn, to, màu trắng sữa, bóng, không gọn,bề mặt hơi gợn sóng, lồi ít Vi khuẩn hình que rất ngắn, đều, có thắt ở giữa. Na4 Khuẩn lạc tròn, to, lồi nhiều, trắng đục, nhẵn bóng, mép đều, có rìa xung quanh, khuẩn lạc mọc sâu vào thạch Vi khuẩn hình que rất ngắn, có thắt ở giữa Na5 Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn bóng, màu trắng đục, lồi rất nhiều Vi khuẩn hình cầu (dạng đơn, đôi) Na8 Khuẩn lạc tròn, to, trắng đục, nhẵn bóng, mép trơn đều, lồi ít Vi khuẩn hình que rất ngắn, không có thắt giữa. Nb3 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, nàu trắng sữa, có vành xung quanh, lồi Vi khuẩn hình que thon, ngắn, không có thắt Nb5 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng sữa, lồi ít Vi khuẩn hình cầu dạng đơn và đôi, chuỗi ngắn Nb8 Khuẩn lạc to, màu trắng đục, có mép đều, bóng, lồi nhiều Vi khuẩn hình que nhỏ, rất ngắn, không có thắt Nb11 Khuẩn lạc tròn, to, màu trắng sữa, dẹp Vi khuẩn hình oval Y1 Khuẩn lạc rất nhỏ, có mép không đều, dẹp, sau 24 giờ có màu trắng hơi trong, khi già có màu trắng đục Vi khuẩn hình que rất ngắn B1 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt gợn sóng, hơi nhăn trên bề mặt, có rãnh, màu trắng sữa, dẹp Vi khuẩn hình que dài, kết đôi hay tạo chuỗi ngắn, có thắt giữa B2 Khuẩn lạc to, tròn, bờ đều, màu trắng đục, lồi ít Vi khuẩn hình que rất ngắn. P1 Khuẩn lạc rất nhỏ, mép trơn, màu trắng đục Vi khuẩn hình que ngắn, không có thắt P2 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, láng bóng, hơi lồi Vi khuẩn hình que thon, rất dài L1 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng đục, có bờ đều, láng bóng, lồi Vi khuẩn hình que rất ngắn L2 Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng sữa, lồi ít Vi khuẩn que thon, rất dài E1 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, láng bóng, có vành xung quanh, dẹp, màu trắng sữa Vi khuẩn hình que dài, có thắt giữa, có dạng như chữ V E2 Khuẩn lạc nhỏ vừa, bề mặt hơi gợn sóng, màu trắng đục, lồi Vi khuẩn hình que, thon dài, có thắt gữa E3 Khuẩn lạc rất lớn, bóng, bờ đều, màu trắng đục, lồi Vi khuẩn hình que ngắn. E4 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, nhẵn bóng, lồi nhiều Vi khuẩn hình que ngắn, có thắt giữa E6 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng sữa,bờ gọn, nhẵn bóng, lồi ít Vi khuẩn hình que ngắn E8 Khẩn lạc rất to, (quan sát ở vật kính 4X), màu trắng đục, bóng, dẹp Vi khuẩn hình que, thon dài, có thắt ở giữa. E10 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, bờ đều, bóng, màu trắng đục, lồi ít Vi khuẩn hình que rất ngắn 4.2.2. Kết quả nhuộm bào tử Bên cạnh nấm mốc còn có các vi khuẩn cũng có khả năng sinh bào tử, bào tử được sinh ra khi vi khuẩn sống trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ, áp xuất, dinh dưỡng…không còn phù hợp cho việc sinh trưởng và phát triển bình thường của chúng hoặc khi tế bào trở nên già. Ở vi khuẩn lactic, chúng không có khả năng này nên đây cũng trở thành đặc điểm nhận dạng của chúng. Sau khi nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương pháp Schaeffer-Fulton, dùng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy ở 2 tuần làm đối chứng dương, quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X thấy được các chấm nhỏ li ti màu lục nằm rãi rác do các bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm malachite (hình 4.4), đồng thời sử dụng vi khuẩn E. coli không sinh bào tử để làm đối chứng âm (hình 4.5). Nhuộm bào tử, ngoài việc xác định những chủng có khả năng là vi khuẩn lactic, ta còn loại bỏ được các mầm bệnh có khả năng sinh bào tử ví dụ như Clostridium spp gây bệnh viêm ruột, là vi khuẩn hình que, Gram dương và có khả năng sinh bào tử. Từ 23 chủng Gram dương, tiến hành nhuộm bào tử mẫu vi khuẩn (hình 4.6) sau đó so sánh với đối chứng thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.3 Kết quả: Các tế bào của mỗi chủng sau khi nhuộm đều bắt màu đỏ của thuốc nhuộm bổ sung. Như vậy, tất cả 23 chủng vi khuẩn đều không sinh bào tử. Hình 4.4: Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử Hình 4.5: vi khuẩn E.coli không sinh bào tử Hình 4.6: mẫu vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 4.2.3. Nhuộm kháng acid Vi khuẩn lactic tuy là những vi khuẩn sinh acid nhưng chúng không có khả năng kháng acid mà chúng chỉ sinh trưởng tốt ở pH 4-6.5 vì vậy trong quá trình sinh trưởng phát triển, đến một giai đoạn nào đó, lượng acid sinh ra quá nhiều sẽ ức chế ngược lại sự phát triển của chúng. Dựa vào đặc tính này mà khóa phân loại của Bergey đã sử dụng làm một trong các yếu tố đặc trưng giúp định danh vi khuẩn lactic. Ngoài ra ở giai đoạn này ta loại bỏ một số vi khuẩn có tính kháng acid gây bệnh như Mycobacterium (hình 4.7). Chúng là những vi khuẩn gây bệnh lao. Chúng là những vi khuẩn Gram dương, hình que và không sinh bào tử. Vì vậy nếu chúng có lẫn vào, thì các thao tác trên sẽ không nhận ra được. Từ 25 chủng cho kết quả không sinh bào tử, tiến hành nhuộm kháng acid, thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.3 Kết quả : tất cả đều bắt màu xanh (hình 4.8). Như vậy 23 chủng vi khuẩn đều không có tính kháng acid. Hình 4.7: Vi khuẩn Mycobacterium smegmatis có tính kháng acid Hình 4.8: Mẫu vi khuẩn không có tính kháng acid 4.2.4. Thử nghiệm catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi bọt khí, sử dụng vi khuẩn Bacillus sb. có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng dương (hình 4.10). Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính. Đồng thời nhờ vào phản ứng catalase ta còn loại được một số vi khuẩn gây bệnh có thể có mặt trong sản phẩm thực phẩm làm nguồn phân lập, chúng có catalase dương tính như Staphylococcus là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm; Micrococcus, Corynebacterium spp…là các vi khuẩn gây nhiễm trùng và cả E. coli gây tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa. Kết quả : Khi tiến hành cho H2O2 lên sinh khối của từng chủng vi khuẩn, tất cả 23 chủng đều không tạo bong bóng (O2) chứng tỏ chúng không có hệ enzyme catalase (hình 4.9). Như vậy, 23 chủng đều cho catalase âm tính. Hình 4.9: Mẫu vi khuẩn có catalase âm tính . Hình 4.10: Chủng Bacillus sb. có catalase dương tính. . 4.2.5. Thử nghiệm tính sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann Điều kiện tiên quyết của một vi khuẩn lactic là chúng phải có khả năng sinh acid lactic, vì vậy để đảm bảo ta tiến hành thử nghiệm các chủng vi khuẩn đó có sinh acid lactic hay không bằng thuốc thử Uffelmann. Sử dụng chủng Bacillus sb. không acid và không làm đổi màu tím của thuốc thử, làm đối chứng âm (hình 4.11). Từ 23 chủng đã qua chọn lọc bằng thử nghiệm catalase, cho thuốc thử trực tiếp lên khuẩn lạc, hoặc cho vào dịch lên men trong môi trường MRS của các chủng vi khuẩn. Quan sát thấy tất cả các mẫu vi khuẩn phân lập đều làm đổi màu thuốc thử từ màu tím sang màu vàng (hình 4.12). Kết quả: tất cả 23 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh acid lactic. Điều này còn được thể hiện qua mùi acid đặc trưng được sinh ra trong tất cả các môi trường sau khi đã cấy vi khuẩn được 24 giờ. Hình 4.12: mẫu vi khuẩn sinh acid lactic . Hình 4.11: vi khuẩn Bacillus không sinh acid lactic . 4.2.6. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường hơn khi đem so sánh với môi trường khi chưa cấy vi khuẩn (ống 1 hình 4.13). Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hiếu khí chịu oxy nên chúng vừa có thể phát triển ở phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng không có tiên mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di chuyển, vì vậy ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy (ống 2 hình 4.13). Khi ta ủ vi khuẩn qua 2 ngày, do ống nghiệm được bịt kín nên khí sinh ra sẽ đảy phần thạch trồi lên so với đáy ống. Cho nên ngoài việc xác định vi khuẩn có khả năng di động hay không ta còn có thể xác định được một số chủng vi khuẩn sinh khí mạnh hay yếu. Trong hình 4.13 vi khuẩn từ ống 4 sinh khí mạnh hơn ống 3 Kết quả thử nghiệm tính di động của 23 chủng đã qua định tính acid lactic dương tính. Quan sát vết cấy và so sánh với môi trường đối chứng, tất cả các chủng đều mọc theo vết cấy và ko làm đục môi trường xung quanh. Như vậy 23 chủng đều không có khả năng di động. 4 1 2 3 Hình 4.13: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn (Ống 1: Ống môi trường không cấy vi khuẩn; Ống 2: Vi khuẩn không có khả năng di động; Ống 3,4: Vi khuẩn không di động và có sinh khí) Thông qua các bước kiểm tra từ mục 4.3 đến mục 4.7, các bước này được thực hiện theo sơ đồ 3.2 trong mục 1.1, tất cả 23 chủng vi khuẩn Gram dương phân lập được đều mang những đặc điểm chung của vi khuẩn lactic đã được mô tả trong Bergey’s manual như: không sinh bào tử, không có khả năng kháng acid, catalase âm tính, sinh acid lactic và không di động. Như vậy, trong trường hợp này ngay từ việc chọn nguồn phân lập đảm bảo chắc chắn có chứa vi khuẩn lactic mong muốn, việc chọn những khuẩn lạc đặc trưng và nhuộm Gram để loại bỏ vi khuẩn Gram âm ở các bước đầu tiên đã làm tăng lên rất nhiều khả năng thu nhận được nguồn vi khuẩn lactic. Mặc dù trình tự các bước kiểm tra có sự khác biệt so với trình tự kiểm tra trong đồ án phân lập của khóa 2005 nhưng vẫn chung mục đích là nhằm sàng lọc ra các vi khuẩn lactic. Đến đây ta xem như đã hoàn tất việc phân lập các chủng vi khuẩn lactic, tiếp theo nữa ta tiến hành kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí của từng chủng và so sánh với khóa phân loại của Bergey để có thể định danh chúng đến cấp giống. 4.2.7. Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí. Các chủng vi khuẩn được cấy vào các môi trường chứa các loại đường khác nhau và được ủ 24 giờ sau đó tiến hành đọc kết quả thông qua các đặc điểm sau: Nếu các ống nghiệm chứa môi trường bị đục chứng tỏ có hiện diện của sinh khối và vi khuẩn có khả năng sử dụng loại đường đó. Khi cho thuốc thử xanh bromophenol vào nếu thuốc thử đổi màu đỏ, chứng tỏ vi khuẩn đó có khả năng lên men đường tạo acid. Nếu thuốc thử không đổi màu, điều này chứng tỏ vi khuẩn không lên men đường (hình 4.14). Nếu vi khuẩn đó có khả năng lên men đường và trong ống durham có bọt khí tạo ra, đó chính là khí CO2. Ngoài ra đối với những ống không có bọt khí trong ống durham, ta khẳng định lại bằng việc nung đỏ que cấy và đặt sát phía trên bề mặt môi trường, nhưng không chạm vào dung dịch nếu có những bọt khí li ti nổi lên thì ta vẫn kết luận đó là lên men dị hình. Nếu không có bọt khí tạo ra thì đó là lên men đồng hình. Kết hợp với phản ứng sử dụng thuốc thử Uffelmann đã trình bày ở mục 4.6, ta có thể kết luận đây là những chủng có khả năng lên men loại đường đó tạo acid lactic. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 gồm: - 23 chủng có khả năng lên men đường D-glucose, trong đó có 12 chủng sinh khí. Như vậy, trong 23 chủng phân lập có 12 chủng lên men lactic dị hình và 11 chủng lên men đồng hình - 23 chủng có khả năng lên men đường lactose, trong đó có 8 chủng sinh khí. - 23 chủng có khả năng lên men đường sacharose, trong đó có 10 chủng sinh khí. - 11 chủng có khả năng lên men đường D-mannitol, trong đó không có chủng nào sinh khí - 23 chủng có khả năng lên men đường maltose, trong đó có 9 chủng sinh khí. - 23 chủng có khả năng lên men đường sucrose, trong đó có 11 chủng sinh khí 1 3 2 Hình 4.14: Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường (Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường; Ống 2: Vi khuẩn lên men đồng hình; Ống 3: Vi khuẩn lên men dị hình) Bảng 4.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn. Nhuộm Gram + + + + + + + + + + + Sinh bào tử - - - - - - - - - - - Kháng acid - - - - - - - - - - - Thử nghiệm catalase - - - - - - - - - - - Sinh acid lactic + + + + + + + + + + + Di động - - - - - - - - - - - Lên men glucose + + + + + + + + + + + Lên men lactose + yếu + - + + + + + + + + Lên men saccharose + + + + + + + + yếu + + yếu + Lên men D-manitol - - - + yếu - - - + + + yếu + Lên men maltose + + + + + + + + + + + Sinh khí - + + - + + + - - + - Na2 X Na3 X Na4 X Na5 X Na8 X Nb3 X Nb5 X Nb8 X Nb11 X Y1 X B1 X B2 X P1 X P2 X L1(*) X L2 X E1 X E2 X E3 X E4 X E6 X E8 X E10 X Định danh Lactobacillus Lactobacillus dị hình Streptococcus dị hình Lactobacillus Lactococcus dị hình Leuconostoc dị hình Lactobacillus dị hình Lactobacillus casei Shirota Lactobacillus Lactobacillus dị hình Bifidobacterium (*): chủng sinh khí mạnh Qua tất cả các kiểm tra về hình thái và sinh lý, sinh hóa các chủng đã phân lập được, kết quả thu được 23 chủng thuộc vi khuẩn lactic, kết quả định danh cụ thể như sau: 20 chủng có dạng trực khuẩn (rod) nhưng chỉ có 19/20 chủng thuộc giống Lactobacillus (10 chủng Lactobacillus đồng hình và 9 chủng Lactobacillus dị hình) và 1/20 chủng (E1) thuộc giống Bifidobacterium. Vi khuẩn Bifidobacterium có khả năng sinh acid lactic nhưng theo phân loại của Bergey 1961, chúng không thuộc nhóm vi khuẩn lactic vì chúng thuộc nhóm có tỷ lệ G+C cao, là vi khuẩn đường ruột kỵ khí bắt buộc, có trong phân của trẻ sơ sinh được bú sữa mẹ và có hình dạng tương tự chữ V hoặc Y. Chủng E1 được phân lập từ phân của trẻ sơ sinh, Bifidobacterium là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc nhưng vẫn có một số phát triển được trong điều kiện có lượng oxy thấp, và vì trong thí nghiệm đã tạo môi trường kị khí bằng cách dán kín ống nghiệm và đĩa petri bằng màng nhựa PVC, thêm nữa là môi trường MRS có bổ sung NaN3 ức chế vi khuẩn hiếu khí, chủng E1 có vi khuẩn hình que dài, có thắt giữa, có dạng như chữ V (bảng 4.2), cho nên chủng E1 có rất nhiều khả năng là thuộc Bifidobacterium đồng hình do lên men glucose không sinh khí. 2 chủng có dạng cầu khuẩn (cocci) là Na5 và Nb5 đều được phân lập từ nem trong đó chủng Nb5 lên men được đường lactose nên thuộc giống Lactococcus dị hình còn chủng Na5 không lên men được đường lactose nên thuộc giống Streptococcus dị hình, cho nên cần kiểm tra thêm một số đặc điểm sinh lý sinh hóa khác như khả năng sống ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối...để có thể xác định cụ thể chủng Na5 thuộc giống Enterococcus, Lactococcus hay Streptococcus sensu stricto trong nhóm Streptococcus như đã nói trong mục 2.3.4. 1 chủng có hình oval được phân lập từ nem và lên men được đường lactose và có khả năng lên men sinh khí nên có thể thuộc giống Leuconostoc dị hình Đối với chủng Lactobacillus đồng hình Y1 phân lập từ sữa chua uống men sống Yakult, qua các kiểm tra hình thái, sinh lý và sinh hóa , đây là vi khuẩn hình que ngắn hoặc dài, có thể kết thành chuỗi ngắn, Gram dương, không di động, có khả năng lên men glucose, maltose, lactose, mannitol, có thể hoặc không thể lên men sucrose, sản phẩm sinh ra chủ y