Kết quả thu nhận khuôn ngoại bào

34 3.1. Kết quả thu nhận khuôn ngoại bào 3.1.1. Kết quả thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và đánh giá nguyên bào sợi thu nhận từ mô da Sau 2 giờ ủ mô da trong dung dịch dispase, lớp trung bì và lớp biểu bì đã tách rời. Dispase là protease phân cắt fibronectin và collagen type IV về dạng phân tử thấp nhất, do đó chúng rất phù hợp trong việc tách rời lớp biểu bì và trung bì của mô da. Lớp trung bì được sử dụng để nuôi cấy mô nhằm thu nhận các nguyên bào sợi. Kết quả quan sát cho thấy các tế bào đơn đã xuất hiện tại rìa các mảnh mô sau 1, 2 ngày nuôi. Trong số những tế bào đơn này, có nhiều tế bào không mong muốn như tế bào sừng, hồng cầu, bạch cầu… Tuy nhiên, những tế bào này sẽ chết đi sau sau vài ngày nuôi cấy do điều kiện môi trường nuôi cấy không thích hợp. Sau 3, 4 ngày nuôi mô, số tế bào đơn lan ra ngày càng nhiều tại rìa các mảnh mô và lan ra trên bề mặt nuôi cấy. Tại thời điểm này, đã có một vài tế bào bám dính, tế bào bám có dạng hình sao, hình thoi, hình sợi trải rời. Đây là giai đoạn các tế bào không mong muốn bị loại đi trong quá trình thay môi trường, các nguyên bào sợi đã bắt đầu thích nghi với môi trường nuôi cấy và bắt đầu tăng sinh. Đến ngày 7, 8, hầu hết nguyên bào sợi mọc lan đều trên bề mặt nuôi cấy (hình 3.1). Trong giai đoạn này, tế bào tăng sinh mạnh, hầu hết chúng đều trải dài, hình sợi – đây là hình dạng phổ biến của nguyên bào sợi. Sau 2 tuần nuôi cấy trên bình nuôi tế bào, trải qua 3,4 lần thay môi trường, nguyên bào sợi đã hợp dòng 80% bề mặt nuôi cấy (hình 3.1). Đây là thời điểm thích hợp để thu nhận nguyên bào sợi sơ cấp (P1). Các nguyên bào sợi này sau đó được nuôi cấy thứ cấp (P2). Tiếp tục nuôi cấy, cấy chuyền 2 lần để thu nhận tế bào ở giai đoạn P4. Phương pháp nuôi cấy và thu nhận nguyên bào sợi từ mô da người đã được nhiều tác giả thực hiện với nhiều quy trình khác nhau. Hầu hết mọi quy 35 trình đều thu được kết quả như nhau, từ mô da ban đầu để thu nhận được nguyên bào sợi đơn thì tốn khoảng 2 tuần nuôi cấy. Akira Takashima và Xuân Lý [5], [65] nuôi cấy các mẫu mô da trên các đĩa nuôi đường kính 35mm, các mảnh mô đặt trong đĩa nuôi phải được cố định bằng lamelle để mô bám dính trên bề mặt nuôi cấy, khi mô bám dính thì nguyên bào sợi mới có thể mọc lan ra từ các mảnh mô. Quy trình được tiến hành như thế sẽ làm tăng nguy cơ nhiễm, diện tích nuôi ít, do đó phải liên tục cấy chuyển, làm hao tốn tiền bạc và công sức. Kết hợp quy trình nuôi cấy của các tác giả trên và tác giả Ngọc Lợi [4] thay vì nuôi mô trên đĩa nuôi đường kính 35mm, tiến hành nuôi trên bình nuôi tế bào có diện tích 25 cm2 và không phải cố định mô bàng lamelle nên cũng hạn chế mẫu bị nhiễm khuẩn. Khi áp dụng quy trình nuôi có cải tiến đôi chút, chúng ta vẫn thu nhận được nguyên bào sợi đúng thời điểm (khoảng 14 ngày sau nuôi cấy), và với mỗi bình nuôi mô có diện tích nuôi nhiều, nên có thể thu nhận được nhiều tế bào hơn, không phái tiến hành thay môi trường nhiều lần, tiết kiệm được môi trường nuôi và hạn chế nhiễm tối đa. So sánh hình thái nguyên bào sợi thu nhận ở giai đoạn P4 (hình 3.1) giống với nguyên bào sợi được thu nhận bởi các tác giả Akira Takashima, Nguyễn Phan Xuân Lý [5], [65]. Khi nhuộm Vimentin, tất cả các tế bào đều bắt màu nâu (hình 3.2) của thuốc nhuộm. Nhân tế bào bắt màu nâu đậm, tế bào chất bắt màu nhạt hơn. Tế bào bắt màu của thuốc nhuộm nên dễ dàng khẳng định đây là các tế bào có nguồn gốc từ trung bì phôi. Giemsa là thuốc nhuộm đa sắc, sau khi nhuộm, nhân tế bào màu hồng, chất nhân mịn, màng nhân rõ, hạch nhân to; nhiễm sắc thể màu xanh đậm và tế bào chất màu xám, đồng nhất, không có tế bào 2 nhân (hình 3.2). Các kết quả thu nhận ở trên, cho thấy những tế bào đơn thu nhận được sau quá trình nuôi cấy trung bì da người là nguyên bào sợi, không có lẫn các tế bào 36 máu, tế bào Langerhan… Nguyên bào sợi này sẽ được sử dụng để tổng hợp khuôn ngoại bào. Hình 3.1. Tế bào mọc lan ra từ mảnh mô sau các ngày nuôi cấy (100 X) Hình 3.2. Tế bào sau khi nhuộm Vimentin (A) và Giemsa (B) (200X) 3.1.2. Kết quả kích thích nguyên bào sợi tổng hợp ECM Sau khoảng 7-10 ngày nuôi tế bào bằng môi trường nuôi cấy có bổ sung acid ascorbic, kết quả cho thấy tế bào đã tổng hợp protein ngoại bào và tiết ra ngoài tạo nên một lớp màng bao phủ quanh lớp đơn tế bào và làm cho không phân biệt được ranh giới của từng tế bào. Sản phẩm khuôn ngoại bào (ECM – extracellular matrix) chủ yếu do nguyên bào sợi tổng hợp nên là collagen. 37 Trước khi bổ sung acid ascorbic vào trong môi nuôi cấy, quan sát thấy rõ ranh giới giữa các nguyên bào sợi và có thể quan sát thấy nhân tế bào (hình 3.3). Khi bổ sung acid ascorbic vào môi trường nuôi cấy, nguyên bào sợi tổng hợp collagen và đưa ra ngoài tế bào. Lúc này, bề mặt tế bào không còn trơn, láng và sáng như lúc đầu. Trên bề mặt tế bào xuất hiện các hạt nhỏ li ti, ranh giới giữa các tế bào không còn phân biệt được. Các tế bào lúc này đã hợp dòng hoàn toàn, tạo thành một lớp màng bao phủ toàn bộ bề mặt nuôi cấy (hình 3.3). Hình 3.3. Nguyên bào sợi trước khi tổng hợp protein ngoại bào (A, B) và sau khi tổng hợp protein ngoại bào (C, D). A, B (100X): quan sát rõ hình dạng của tế bào, phân biệt 38 được ranh giới của tế bào. (C, 200X): sau khi nhuộm Giemsa, thấy rõ ECM do tế bào tổng hợp. (D, 200X): ECM là một lớp màng mỏng bao phủ bề mặt nuôi cấy, không phân biệt được ranh giới giữa các tế bào. Từ những năm 60 đã có nhiều nghiên cứu in vitro cho thấy vai trò của acid ascorbic trong sự tổng hợp, trưởng thành và quá trình tiết collagen ngoại bào. Để hoàn thành quá trình tổng hợp các phân tử collagen phải cần phải có acid ascorbic. Thành phần chính của collagen là proline. Acid ascorbic tác động trực tiếp lên quá trình tổng hợp và hydroxyl hóa acid amin này để tổng hợp nên các phân tử procollagen. Còn có rất nhiều quá trình biến đổi khác nữa để các phân tử procollagen được đưa ra ngoài và tổng hợp nên collagen. Cùng khoảng thời gian này, các phân tử collagen tiếp tục quá trình biến đổi như thực hiện các quá trình glycosyl hóa và hình thành nên những liên kết nội bào. [25], [34], [69]. Hầu hết các mô, cơ quan trong cơ thể đều có ECM. ECM này do chính các tế bào của mô và cơ quan tổng hợp nên. Nguyên bào sợi cũng có khả năng tổng hợp ECM cho chính nó. Có nhiều công trình chứng minh vai trò của acid ascorbic lên sự tổng hợp ECM [25], [34], [69]. Kết quả ghi nhận được đã cho thấy vai trò của acid ascorbic trong sự tạo thành ECM của lớp đơn nguyên bào sợi. 3.1.3. Kết quả xử lí thu nhận ECM Sau khi kích thích tế bào tổng hợp ECM, tế bào được phá phá để thu nhận ECM. Khi sử dụng Triton X-100 với các nồng độ khác nhau, ở cả 3 nồng độ 0,3%, 0,4% và 0,5% màng tế bào đều bị phá vỡ và giải phóng các thành phần tế bào giúp thu nhận ECM. Tuy nhiên ở các khoảng thời gian ủ mẫu khác nhau thì sự ảnh hưởng của Triton lên ECM khác nhau. Kết quả xử lí để thu nhận ECM được trình bày qua bảng 3.1 39 Bảng 3.1. Kết quả thu nhận ECM khi xử lí bằng Triton X100 theo nồng độ và qua các mốc thời gian khác nhau Nồng độ Triton X100 Thời gian xử lý 0,3% 0,4% 0,5% 3 phút Chưa phá hết tế bào Còn khoảng 60% tế bào trên ECM DNA còn nhiều trên ECM Chưa phá hết tế bào Còn khoảng 40% tế bào trên ECM DNA còn nhiều trên ECM Chưa phá hết tế bào Còn khoảng 20% tế bào trên ECM DNA còn nhiều trên ECM 4 phút Chưa phá hết tế bào ECM giữ cấu trúc nguyên vẹn DNA vẫn còn trên ECM Chưa phá hết tế bào ECM giữ cấu trúc nguyên vẹn DNA vẫn còn trên ECM Tế bào bị phá hủy ECM giữ cấu trúc nguyên vẹn DNA không còn trên ECM 5 phút Chưa phá hết tế bào ECM giữ cấu trúc nguyên vẹn DNA vẫn còn ít trên ECM Tế bào bị phá hủy ECM bị hòa tan một phần DNA không còn trên ECM Tế bào bị phá hủy ECM bị hòa tan nhiều DNA không còn trên ECM Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 cho thấy: Hầu hết các nồng độ Triton X100 đều có tác động đến sự phá hủy tế bào. Tuy nhiên phụ thuộc vào thời gian ủ cùng mẫu mà ECM thu được có sự khác nhau (hình 3.4). 40 Sau 3 phút ủ mẫu, hầu như Triton X100 chưa phá vỡ hết tế bào. Chính vì tế bào chưa bị phá hết nên DNA còn lại trong tế bào, không được giải phóng ra ngoài nên hạn chế tác dụng của DNase. Cũng có thể do thời gian chưa đủ để Triton thể hiện hoạt động phá tế bào và DNase thể hiện hoạt tính. Khi tăng thời gian ủ mẫu lên 5 phút, hầu hết tế bào đều bị phá vỡ, DNA bị phân hủy hết, ECM bị hòa tan một phần, không còn giữ nguyên hình dạng như ban đầu. Tuy nhiên, ở nồng độ Triton X100 0,3% vẫn chưa phá hủy hoàn toàn tế bào, một phần khuồn ngoài bào bị hòa tan và DNA vẫn còn trên ECM. Với thời gian ủ mẫu là 4 phút, nhận thấy hầu hết ECM đều giữ nguyên cấu trúc, không bị hòa tan. Tuy nhiên nồng độ Triton thấp vẫn chưa phá vỡ hết tế bào. Vẫn với thời gian ử mẫu như trên và nồng độ Triton 0,5% thì đã phá vỡ hoàn toàn tế bào và ECM thu nhận được còn nguyên vẹn, không bị hòa tan. Khi tế bào bị phá vỡ hoàn toàn, DNA trong nhân và trong ti thể sẽ lộ ra ngoài, dễ dàng bị DNase trong môi trường phân hủy. Do đó thời gian ủ mẫu 4 phút kết hợp với nồng độ triton 0,5% là thời điểm thích hợp nhất để thu ECM mà vẫn giữ nguyên được cấu trúc của chúng (hình 3.5) 41 Hình 3.4. ECM khi chụp bằng kính hiển vi dưới ánh sáng trắng (A, B, C, D, 100X) và ánh sáng huỳnh quang (A’, B’, C’, D’, 100X), dưới ánh sáng huỳnh quang DNA có màu đỏ. (A), (A’): nguyên bào sợi trước khi phá tế bào. Khi chụp dưới ánh sáng trắng 42 thấy rõ lớp đơn tế bào. Dưới ánh sáng huỳnh quang, DNA bắt màu của thuốc nhuộm PI và có màu đỏ. (B) (B’): ECM thu được sau 3 phút xử lí với nồng độ Tritron X100 0,3%, tế bào hầu như chưa bị phá vỡ và DNA còn nhiều. (C), (C’): ECM thu được sau 5 phút xử lí mẫu với nồng độ Tritron X100 0,3%, ECM không bị hòa tan và còn rất ít DNA trên ECM. (D), (D’): ECM thu được sau 4 phút xử lí với Tritron X100 0,5%, ECM giữ nguyên cấu trúc, DNA bị phân hủy hoàn toàn. Triton X-100 là chất tẩy không chứa ion, chúng được sử dụng nhiều trong quá trình loại tế bào để thu nhận ECM. Chúng phá vỡ các liên kết giữa lipid – lipid và lipid – protein, đồng thời giữ nguyên liên kết protein – protein để protein trong mô hoặc cơ quan, vì thế sau khi xử lí bằng chất tẩy này, ECM thu nhận được sẽ giữ nguyên được chức năng. Tùy thuộc vào loại mô mà thời gian tiếp xúc với mô khác nhau. Ví dụ, Grauss và cộng sự đã cho mô van tim tiếp xúc với triton X-100 trong 24 giờ, kết quả là đã loại hết tế bào mà vẫn duy trì cấu trúc van tim, tuy vẫn còn một ít tế bào trên thành động mạch chủ [36]. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu của Dahl S. L; Cartmell J. S và Woods T đã chứng minh là Triton X-100 không có hiệu quả hoàn toàn trong việc loại tế bào khỏi mạch máu, gân, dây chằng sau khi tiếp xúc với các mô này lên đến 4 ngày [21], [29], [72]. Do vậy sử dụng triton X-100 là một phương pháp loại tế bào có hiệu quả, nhưng hiệu quả của nó phụ thuộc vào mô được loại tế bào. Dựa trên các quy trình thu nhận ECM từ các mô nguyên kết hợp với phương pháp thực nghiệm, chúng tôi đã phá được tế bào để thu nhận ECM nguyên từ lớp đơn nguyên bào sợi. 3.2. Kết quả đánh giá ECM 3.2.1. Kết quả đánh giá thành phần ECM ECM sau khi loại bỏ tế bào và DNA sẽ được gửi đến khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Chợ Rẫy để xác định thành phần chủ ECM bằng cách nhuộm PAS và Trichrome. Nhuộm PAS và Trichrome thường được sử dụng để xác định collagen. Collagen sẽ có màu hồng khi được nhộm PAS và bắt màu xanh khi nhuộm Trichrome. 43 Kết quả nhuộm mô cho thấy, ECM thu nhận được là một mạng lưới gồm nhiều sợi đan xen vào nhau tạo thành một lớp màng mỏng trên bề mặt đĩa nuôi. Lớp màng mỏng này có màu hồng nhạt và màu xanh sau khi được nhuộm PAS, Trichrome. Điều này cho thấy thành phần chủ yếu của ECM là collagen. Theo lí thuyết, nguyên bào sợi khi nuôi cấy có sử dụng acid ascorbic sẽ tổng hợp collagen, và tiết ra bên ngoài tế bào tạo ECM. Trên thực tế, ECM thu nhận được cũng có thành phần chủ yếu là collagen, vậy kết quả này phù hợp với lí thuyết trên. Hình 3.5. ECM thu được sau 4 phút xử lí với Triton X100 0,5%, khi nhộm PAS, ECM có màu hồng chứng tỏ thành phần chủ yếu của chúng là collagen (200X). Các tài liệu đã chứng minh rằng ECM của nguyên bào sợi có thành phần là collagen, fibronectin, các họ nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi, tế bào sừng. Trong đó, thành phần chủ yếu của lớp ECM này là collagen [9], [10], [28], [34], [55]. Để chứng minh sự hiện diện của từng thành phần protein trong ECM phải sử dụng các phương pháp khá phức tạp và tốn kém. Bởi vì thành phần chủ yếu của ECM là collagen, các thành phần khác hiện diện ít, nên phải hòa tan ECM, sau đó sử dụng dịch hòa tan này để chạy sắc khí, và sử dụng thang chuẩn protein để xác định thành phần protein có trong dung dịch. Do vậy chúng tôi chỉ xác định thành phần chủ yếu của ECM bằng phương pháp nhuộm hóa mô. Phương pháp này thực hiện khá đơn giản mà chính xác. Kết quả nhuộm hóa mô đã khẳng định ECM thu nhận được có thành phần chủ yếu là collagen. 44 3.2.2. Kết quả đánh giá sự bám dính của tế bào trên ECM a. Kết quả đánh giá sự bám dính nhanh của tế bào sừng trên ECM Kết quả phân lập, nuôi cấy tế bào sừng từ mô da Sau khi ủ mẫu da trong dung dịch Trysin – EDTA 18 giờ ở 4oC, lớp biểu bì và trung bì đã tách rời. Thời gian ủ mẩu lâu, nhiệt độ thấp và nồng độ trypsin thấp hơn nhiều so với EDTA đã hạn chế tác dụng của Trysin. Lúc này Trysin không phân hủy mô mà chỉ cắt đứt các liên kết giữa lớp trung bì – biểu bì, đồng thời EDTA làm lỏng lẻo các liên kết giữa tế bào. Sau khi tách rời trung bì và biểu bì bằng Trysin – EDTA, lớp biểu bì được sử dụng để thu các tế bào đơn. Do liên kết giữa các tế bào lỏng lẻo nên việc sử dụng pipet để huyền phù lớp biểu bì sẽ thu được dịch tế bào với các tế bào đơn hoàn toàn. Các tế bào đơn này được nuôi cấy bằng môi trường chuyên biệt dành cho tế bào sừng là môi trường SFM, và thay môi trường sau mỗi 2-3 ngày. Trong môi trường nuôi cấy chuyên biệt, các tế bào sừng này ban đầu là các cụm tế bào nhỏ, sau đó chúng sẽ tăng sinh và hợp dòng với nhau, tạo thành một lớp đơn trên bề mặt đĩa nuôi (Hình 3.6) Hình 3.6. Tế bào sừng sau 7 ngày nuôi cấy, tế bào mọc thành các cụm (A, 40X) sau đó hợp dòng tạo thành lớp đơn, các tế bào mọc sát nhau và thấy rõ ranh giới giữa các tế bào (B, 200X) 45 Do được nuôi trong môi trường chuyên biệt, sau 2, 3 lần thay môi trường các tế bào nhiễm – không phải là tế bào sừng đã được loại bỏ. Tế bào thu nhận được có hình đa giác, phủ kín bề mặt nuôi cấy. Tế bào thu nhận được có hình thái giống với tế bào sừng được nuôi cấy theo các quy trình của các tác giả Claire Linge, Susan S. Yamada và Trần Lê Bảo Hà [3], [73]. Qua đó, khẳng định, các tế bào thu nhận được khi tách từ lớp biểu bì da là tế bào sừng có khả năng tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy chuyên biệt dành cho tế bào sừng. Khi tế bào sừng hợp dòng 80% diện tích bề mặt nuôi cấy, tiến hành thu nhận tế bào để sử dụng cho quá trình khảo sát sự tăng cường bám dính của ECM đối với tế bào. Kết quả bám dính nhanh của tế bào sừng trên ECM Kết quả khảo sát khả năng bám dính của tế bào sừng trên ECM được trình bày qua bảng 3.2. Bảng 3.2. Số tế bào sừng bám dính trên ECM Nhóm Số tế bào bám (1giờ) Số tế bào bám (2giờ) Số tế bào bám (3giờ) Không ECM 31,0 ± 4,8 46,6 ± 5,2 57,0 ± 3,7 Có ECM 49,9 ± 11,6 62,8 ± 8,5 79,0 ± 10.2 Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy: Sau các khoảng thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào sừng bám trên đĩa nuôi cấy có phủ và không phủ ECM đều tăng theo thời gian. Số lượng tế bào bám giữa các nhóm có sự khác biệt có ý nghĩa khi xử lí thống kê. Sau 1giờ nuôi cấy, số tế bào bám trên đĩa nuôi có phủ ECM là 49,4 tế bào và trên đĩa nuôi thường là 31,0 tế bào. So với đĩa nuôi thường, đĩa nuôi phủ ECM có số tế bào bám cao hơn 60%. 46 Sau 2 giờ nuôi cấy, số tế bào bám trên đĩa nuôi đã tăng lên, số tế bào trên đĩa nuôi thường và đĩa nuôi có phủ ECM lần lượt là 46,6 và 62,8 tế bào. Tỉ lệ tế bào bám trên đĩa nuôi phủ ECM cao hơn so với đĩa nuôi thường khoảng 35%. Sau 3 giờ nuôi cấy, số tế bào bám trên đĩa nuôi thường là 57 và trên đĩa phủ ECM là 79 tế bào. Tỉ lệ tế bào bám trên đĩa nuôi phủ ECM cao hơn so với đĩa nuôi thường là 37%. Sau các mốc thời gian nuôi, sự khác biệt về số lượng tế bào bám trên đĩa nuôi thường và đĩa phủ ECM thể hiện rõ nhất sau một giờ nuôi. Số tế bào bám trên bề mặt đĩa nuôi phủ ECM cao hơn so với trên bề mặt thường gần 60%. Điều ày được lí giải là hoàn toàn phù hợp với lí thuyết cho rằng ECM thúc đẩy sự bám dính và tăng sinh của tế bào của Hynda K. Kleinman, Israel Vlodavsky và Edna Cukirman [28], [46], [69] . Tế bào tiếp xúc với môi trường thể hiện qua 3 liên kết: liên kết với các thụ thể hòa tan, liên kết với các tế bào khác và liên kết với ECM thông qua các phân tử bám dính trung gian. Do vậy, nuôi cấy tế bào trên ECM sẽ kích thích tế bào bám dính nhanh hơn khi nuôi cấy trên đĩa nuôi thường. ECM thu nhận từ nguyên bào sợi, ngoài thành phần chính được chứng minh là collagen, còn có các thành phần protein bám dính khác, cũng như các nhân tố tăng trưởng được sản xuất ra khi chúng tăng sinh. Khi đưa tế bào lên đĩa nuôi phủ ECM, các tế bào nhanh chóng liên kết với chất nền thông qua các liên kết chủ yếu với protein chất nền, do vậy tế bào bám dính nhanh sau 1 giờ nuôi cấy. Trên đĩa nuôi thường, tế bào bám dính trên đĩa nuôi chủ yếu nhờ vào liên kết tĩnh điện giữa điện tích trên bề mặt nuôi cấy và điện tích tế bào. Lực liên kết này không giúp tế bào bám dính nhanh. Để bám dính tế bào cần nhiều thời gian tổng hợp các phân tử protein bám dính, giúp hình thành liên kết giữa tế bào – tế bào, tế bào – chất nền. Qua những giờ tiếp sau đó, số tế bào bám có tăng lên so với giờ đầu tiên sau nuôi cấy. Nuôi cấy tế bào trên đĩa phủ ECM cho hiệu quả bám dính cao hơn nuôi cấy trên đĩa thường, và hiệu quả cao nhất ngay sau giờ đầu tiên nuôi cấy. 47 Điều này có thể được giải thích, sau khi nuôi cấy 1 giờ, đã có một số lượng nhất định tế bào bám. Khi nuôi cấy những giờ tiếp theo, các tế bào mới ngoài việc tạo các liên kết với môi trường chúng còn có sự liên kết với các tế bào đã bám dính trước. Trên đĩa nuôi phủ ECM, sau 1 giờ nuôi cấy, những tế bào chưa tạo được liên kết với ECM thì đến những giờ sau sẽ tạo được liên kết, nhưng số lượng này không nhiều. Đối với đĩa nuôi thường, tế bào ngoài việc liên kết với bề mặt nuôi cấy nhờ liên kết tĩnh điện, chúng còn tạo lập các liên kết tế bào – tế bào, làm tăng số tế bào bám sau thời gian nuôi cấy và rút ngắn khoảng cách tỉ lệ tế bào bám dính so với đĩa nuôi có phủ ECM. Nhờ khả năng tăng cường sự bám dính này mà ECM được sử dụng để thu nhận các tế bào bám dính nhanh hoặc các tế bào mục tiêu. Nếu cần thu nhận quần thể tế bào bám dính hoặc không bám dính trong hỗn hợp tế bào, ta đưa hỗn hợp tế bào này vào nuôi cấy trên đĩa phủ ECM bằng môi trường nuôi thích hợp, sau khoảng vài giờ nuôi cấy, có thể thu được 2 quần thể tế bào, quần thể tế bào bám dính sẽ bám nhanh trên ECM, quần thể tế bào còn lại sẽ nằm trong dịch nuôi cấy được hút ra sau đó. Tế bào sừng thuộc lớp biểu bì, là tế bào bám dính chậm, chúng chỉ sống và tăng sinh khi đã bám dính và được nuôi cấy bằng môi trường thích hợp. ECM từ nguyên bào sợi đã giúp các tế bào này bám dính nhanh. b. Kết quả đánh giá sự bám dính nhanh của nguyên bào sợi trên ECM Nguyên bào sợi người được sử dụng để khảo sát khả năng tăng cường bám dính tế bào của ECM, kết quả thu nhận được thể hiện ở bảng 3.3. Qua bảng số liệu 3.3 nhận thấy một số kết quả: Số tế bào bám trên đĩa nuôi thường và trên đĩa nuôi phủ ECM tăng lên sau 1, 2 và 3 giờ nuôi cấy. Tại cùng thời điểm khảo sát, số tế bào bám trên đĩa phủ ECM cao hơn nhiều so