Kết quả tối ưu thành phần dinh dưỡng cho quá trình sinh tổng hợp beta – carotene của nấm men

-66- Kết quả và biện luận 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TỐI ƯU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CHO QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP BETA – CAROTENE CỦA NẤM MEN RHODOTORULA SP.3 THEO QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM BOX- HUNTER 3.1.1. Kết quả thí nghiệm khảo sát thành phần dinh dưỡng gồm KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Sac. để chọn thí nghiệm tại tâm Quy trình, điều kiện thí nghiệm như hình 2.5 và bố trí thí nghiệm theo bảng 2.5 ở mục 2.2.3. Phân tích thống kê ANOVA xem phụ lục 3.1. Sử dụng thành phần môi trường cơ bản như đã trình bày, thay đổi lần lượt các nguồn KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Sac.. Chúng tôi tiến hành khảo sát thí nghiệm ở tâm và thu được kết quả sau: 3.1.1.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 Bảng 3.1. Khả năng tổng hợp beta – carotene tại các nồng độ KH2PO4 khác nhau STT Hàm lượng KH2PO4 (mg/Kg môi trường) Hàm lượng beta – carotene (ppm theo CK) 1 35 95,58 ± 3,23 c 2 45 126,94 ± 5,74 a 3 55 118,386 ± 7,08 b 4 65 99,95 ± 3,71 c (Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức α=0,05) - Nhận xét Khi tăng hàm lượng KH2PO4, hàm lượng beta – carotene cũng tăng dần. Hàm lượng beta – carotene đạt cực đại khi hàm lượng KH2PO4 chiếm 45 mg. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng KH2PO4 lên 55 và 65 mg thì hàm lượng beta – carotene sinh ra giảm. Do đó, giá trị KH2PO4 = 45 mg được lựa chọn để thực hiện thí nghiệm tiếp theo. HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -67- Kết quả và biện luận 3.1.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 Bảng 3.2. Khả năng tổng hợp beta – carotene tại các nồng độ MgSO4 khác nhau STT TN Hàm lượng MgSO4 (mg/Kg môi trường) Hàm lượng beta – carotene (ppm theo CK) 1 35 82,05 ± 4,94 d 2 50 111,28 ± 4,70 b 3 65 124,44 ± 5,36 a 4 80 95,19 ± 9,07 c (Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức α=0,05) - Nhận xét Khi tăng hàm lượng MgSO4 trên môi trường nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp.3, hàm lượng beta – carotene tăng lên rõ rệt. Tuy nhiên hàm lượng beta – carotene đạt cao nhất khi hàm lượng MgSO4 là 65 mg, khi tăng thêm tỷ lệ MgSO4 hàm lượng beta - carotene lại giảm. Do đó, chọn giá trị hàm lượng MgSO4 bổ sung là 65 mg để thực hiện thí nghiệm tiếp theo. 3.1.1.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng NaNO3 HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -68- Kết quả và biện luận Bảng 3.3. Khả năng tổng hợp beta – carotene tại các nồng độ NaNO3 khác nhau STT Hàm lượng NaNO3 (mg/Kg môi trường) Hàm lượng beta – carotene (ppm theo CK) 1 100 103,94 ± 3,03 c 2 150 122,52 ± 3,74 b 3 200 148,41 ± 4,21a 4 250 81,76 ± 7,65 d (Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức α=0,05) - Nhận xét Khi tăng hàm lượng NaNO3 trên môi trường nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp.3, hàm lượng beta – carotene tăng lên rõ rệt. Tuy nhiên, hàm lượng beta – carotene đạt cao nhất khi hàm lượng NaNO3 là 200 mg. Khi tăng thêm tỷ lệ NaNO3, hàm lượng beta – carotene sinh ra lại giảm. Do đó, chọn giá trị hàm lượng NaNO3 bổ sung là 200 mg để thực hiện thí nghiệm tiếp theo. 3.1.1.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng Sac. Bảng 3.4. Khả năng tổng hợp beta – carotene tại các nồng độ Sac. bổ sung khác nhau STT Hàm lượng saccharose bổ sung (mg/Kg môi trường) Hàm lượng beta – carotene (ppm theo CK) 1 200 84,54 ± 5,38 d 2 300 148,72 ± 3,61a 3 400 127,75 ± 1,31b 4 500 114,97 ± 3,95 c (Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức α=0,05) HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -69- Kết quả và biện luận - Nhận xét Khi tăng hàm lượng Sac. trên môi trường nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp.3, hàm lượng beta – carotene tăng lên rõ rệt. Tuy nhiên hàm lượng beta – carotene đạt cao nhất khi hàm lượng Sac. là 300 mg, khi tăng thêm tỷ lệ Sac., hàm lượng beta – carotene lại giảm. Do đó, chọn giá trị Sac. bổ sung là 300 mg để thực hiện thí nghiệm tiếp theo. Với kết quả thực nghiệm nhận được, chúng tôi đã tìm ra được nồng độ KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và saccharose ở tâm cho các thực nghiệm kế tiếp là: KH2PO4 = 45 mg/Kg môi trường • MgSO4 = 65 mg/Kg môi trường • NaNO3 = 200 mg/Kg môi trường • Saccharose = 300 mg/Kg môi trường • 3.1.2. Kết quả tối ưu 4 yếu tố thành phần dinh dưỡng gồm KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và saccharose Thực nghiệm được khảo sát theo sự biến thiên của các yếu tố như sau: x1: nồng độ KH2PO4 có mức biến thiên 5 mg/Kg môi trường x2: nồng độ MgSO4 có mức biến thiên 5 mg/Kg môi trường x3: nồng độ NaNO3 có mức biến thiên 20 mg/Kg môi trường x4: nồng độ Sac. có mức biến thiên 50 mg/Kg môi trường Với các điều kiện nuôi cấy ban đầu được cố định như sau: Nhiệt độ phòng thí nghiệm 28 – 32 0C pH 5,5 Độ ẩm môi trường ban đầu 60 % Tỷ lệ giống cấy ban đầu 3x107 CFU/g môi trường Các công thức tính toán tối ưu xem phụ lục 2, ma trận thí nghiệm như bảng 2.6. Chúng tôi thu được kết quả sau: HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -70- Kết quả và biện luận Bảng 3.5. Hàm lượng beta – carotene theo số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng TN KH2PO4 (mg/Kg môi trường) MgSO4 (mg/Kg môi trường) NaNO3 (mg/Kg môi trường) Sac. (mg/Kg môi trường) Hàm lượng beta – carotene (ppm theo CK) 1 40 60 180 250 112,97 ± 27,62 2 50 60 180 250 92 ± 21,77 3 40 70 180 250 85,8 ± 17,83 4 50 70 180 250 44,59 ± 6,84 5 40 60 220 250 99,58 ± 14,95 6 50 60 220 250 67,6 ± 12,40 7 40 70 220 250 97,39 ± 23,39 8 50 70 220 250 62,27 ± 26,21 9 40 60 180 350 95,94 ± 14,97 10 50 60 180 350 67,08 ± 12,74 11 40 70 180 350 96,2 ± 9,74 12 50 70 180 350 138,22 ± 26,53 13 40 60 220 350 43,37 ± 12,54 14 50 60 220 350 64,87 ± 18,96 15 40 70 220 350 89,57 ± 20,19 16 50 70 220 350 164,86 ± 4,65 17 35 65 200 300 79,27 ± 23,53 18 55 65 200 300 97,49 ± 14,75 19 45 55 200 300 54,21 ± 11,19 20 45 75 200 300 103,97 ± 9,65 21 45 65 160 300 55,12 ± 11,54 22 45 65 240 300 100,88 ± 12,75 23 45 65 200 200 55,66 ± 12,49 24 45 65 200 400 109,06 ± 28,07 25 45 65 200 200 123,14 ± 3,79 26 45 65 200 300 155,66 ± 17,52 27 45 65 200 300 133,55 ± 7,18 28 45 65 200 300 164,43 ± 7,72 29 45 65 200 300 194,67 ± 7,07 30 45 65 200 300 186,83 ± 22,29 31 45 65 200 300 168,58 ± 14,01 Theo các số liệu ở bảng 3.5 và công thức (1) ở phụ lục 2, chúng tôi thu được các giá trị bj như trong bảng: HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -71- Kết quả và biện luận Bảng 3.6. Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng b0 b1 b2 b3 b4 b12 b13 b14 b23 b24 b34 b11 b22 b33 b44 160,92 7,59 9,80 2,01 8,54 6,33 4,92 14,95 8,87 18,73 -1,64 -17,22 -19,54 -19,81 -18,73 Theo các số liệu tính ở phụ lục 3 và công thức (3) ở phụ lục 2, tính các giá trị tj: Bảng 3.7. Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng t0 t1 t2 t3 t4 t12 t13 t14 t23 t24 t34 t11 t22 t33 t44 16,32 1,42 1,84 0,38 1,60 0,97 0,75 2,29 1,36 2,87 0,25 2,55 2,90 2,94 2,77 Tra bảng tp(f) theo tiêu chuẩn Student với p = 0,05; f = n0 – 1 = 7- 1 = 6 Suy ra, t0,05(6) = 2,45 So sánh các giá trị tj với t0,05(f), ta thấy t1, t2, t3, t4, t12, t13, t14, t23, t34 nhỏ hơn t0,05(6). Do đó, các hệ số b1, b2, b3, b4, b12, b13, b14, b23, b34 bị loại ra khỏi phương trình hồi qui. Phương trình hồi qui có dạng: y =160,916 + 18,7304 x2x4 – 17,2226 x12 - 19,5412x22 – 19,8134 x32 -18,7256 x42 - Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi qui Theo các công thức (4), (5), (6), (7) và (8) ở phụ lục 2, tính được các phương sai và F như ở bảng 3.8: Bảng 3.8. Các phương sai và F theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng Sdư Sth stt2 sth2 F 53688,51 480,474 2610,686 680,912 3,83 Tra bảng F1-p(f1, f2) theo tiêu chuẩn Fisher: Với: p = 0,05, f1 = N – l – (n0 – 1) = 31- 6 –(7-1), f2 = n0 – 1 = 6. Trong đó: l là hệ số có ý nghĩa trong phương trình hồi qui. Suy ra F0,95(19,6) = 3,88. Theo bảng 3.8, giá trị F = 3,83 < F0,95(19,6) = 3,88 do đó phương trình hồi qui nhận được tương thích với thực nghiệm. - Các điểm tối ưu của phương trình hồi qui HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -72- Kết quả và biện luận Để tìm điểm tối ưu của phương trình hồi qui ta lấy đạo hàm theo từng biến. y'(x1) = - 34,45 x1 = 0 ↔ x1 = 0 y'(x2) = 18,73 x4 – 39,08x2 = 0 (*) ↔ x2 = 0 (kết hợp với **) y'(x3) = -39,63 x3 = 0 ↔ x3 = 0 y'(x4) = 18,73 x2 - 37,45x4 = 0 (**) ↔ x4 =0 (kết hợp với *) Thế x1, x2, x3, x4 vào phương trình hồi qui ta được ymax ymax = 160,916 ppm beta – carotene (theo CK) Các điểm tối ưu: x1 = 0 ↔ KH2PO4 = 45 mg/Kg môi trường x2 = 0 ↔ MgSO4 = 65 mg/Kg môi trường x3 = 0 ↔ NaNO3 = 200 mg/Kg môi trường x4 = 0 ↔ Sac. = 300 mg/Kg môi trường 3.1.3. Kết luận và nhận xét - Kết luận Với các điều kiện ban đầu: nhiệt độ phòng 28 – 320C, pH = 5,5, độ ẩm = 60 %, mật độ cấy 3x107 CFU/g môi trường. Bằng quy hoạch thực nghiệm bậc hai theo Box- Hunter, chúng tôi đã tối ưu được thành phần dinh dưỡng bổ sung gồm KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và saccharose như sau: • Phương trình hồi qui tối ưu thành phần KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Sac. là: y =160,916 + 18,7304 x2x4 – 17,2226 x12 - 19,5412x22 – 19,8134 x32 -18,7256 x42 Các điểm tối ưu: KH2PO4 = 45 mg/Kg môi trường MgSO4 = 65 mg/Kg môi trường NaNO3 = 200 mg/Kg môi trường Sac. = 300 mg/Kg môi trường Với các điều kiện ban đầu như trên, hàm mục tiêu ứng hàm lượng beta-carotene cực đại sau 5 ngày nuôi cấy là: ymax = 160,916 ppm beta – carotene (theo CK) HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -73- Kết quả và biện luận - Nhận xét Sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm của Box-Hunter đã tìm ra được thành phần dinh dưỡng bổ sung gồm KH2PO4, MgSO4, NaNO3và Sac. tối ưu khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy như ở mục 3.1.3. Số liệu thu được từ thực nghiệm ngẫu nhiên đã trùng với thí nghiệm tại tâm. Phương trình hồi quy cho thấy các nguồn KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và saccharose có ảnh hưởng đến quá trình quá trình tổng hợp beta – carotene của tế bào nấm men Rhodotorula sp.3 theo hàm bậc hai của từng biến riêng lẻ. Ngoài ra, có tương tác kép giữa hàm lượng MgSO4 và đường saccharose. Giải thích điều này, theo chúng tôi có lẽ là do đường saccharose trong quá trình công nghệ nước mía được làm sạch bằng phương pháp sulfit hóa, nên còn sót một lượng nhỏ sunfat trong thành phần đường thành phẩm, do đó hai yếu tố này có tương tác qua lại với nhau. Sau khi tối ưu hóa, hàm lượng beta – carotene tăng lên rõ rệt chứng tỏ nguồn dưỡng chất bổ sung trên là phù hợp với quá trình tổng hợp beta – carotene của tế bào nấm men Rhodotorula sp.3. Các nồng độ KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Sac. đã tối ưu dùng để khảo sát cho thực nghiệm kế tiếp nhằm tìm ra điều kiện tối ưu cho toàn bộ quá trình nuôi cấy. 3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP BETA – CAROTENE CỦA NẤM MEN RHODOTORULA SP.3 THEO QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM BOX- HUNTER 3.2.1. Tìm thí nghiệm tại tâm 3.2.1.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm thích hợp HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -74- Kết quả và biện luận Bảng 3.9. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tổng hợp beta – carotene Độ ẩm ban đầu Beta – carotene (ppm theo CK) 50 95,50 ± 1,78C 60 162,42 ± 5,20a 70 105,39 ± 7,91b (Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức α=0,05) - Nhận xét Khi tăng độ ẩm trên môi trường nuôi cấy chủng nấm men Rhodotorula sp.3 hàm lượng beta – carotene tăng lên rõ rệt. Tuy nhiên hàm lượng beta – carotene đạt cao nhất khi độ ẩm khoảng 60 %, khi tăng ẩm cao đến 70 %, hàm lượng beta – carotene lại giảm. Chúng tôi chọn độ ẩm là 60 % để thực hiện thí nghiệm tiếp theo. 3.2.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ dày lớp môi trường thích hợp Bảng 3.10. Ảnh hưởng của độ dày lớp môi trường đến khả năng tổng hợp beta – carotene Độ dày lớp môi trường (cm) Beta – carotene (ppm theo CK) 1 138,54 ± 6,68c 2 168,77 ± 6,46a 3 97,38 ± 2,57b (Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức α=0,05) - Nhận xét Khi tăng độ của lớp môi trường hàm lượng beta – carotene cũng tăng dần . Hàm lượng beta – carotene đạt cực đại khi độ dày lớp môi trường là 2 cm. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng lên 3 cm thì hàm lượng beta – carotene giảm mạnh. Do đó độ dày lớp môi trường là 2 cm là phù hợp để thực hiện thí nghiệm tiếp theo. HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -75- Kết quả và biện luận 3.2.1.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống thích hợp Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến khả năng tổng hợp beta – carotene Tỷ lệ giống (CFU/g MT) Beta – carotene (ppm theo CK) 3x107 177,07 ± 3,68c 6x107 248,09 ± 6,34a 9x107 186,74 ± 5,75b (Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức α=0,05) - Nhận xét Khi tăng tỷ lệ giống cấy, hàm lượng beta – carotene cũng tăng dần. Hàm lượng beta – carotene đạt cực đại khi tỷ lệ giống cấy trong khoảng 6 x 107 CFU/g canh trường. Tỷ lệ giống cao 9 x 107 CFU/g canh trường nhưng hàm lượng beta – carotene lại giảm nên chúng tôi chọn tỷ lệ 6 x 107 CFU/g canh trường làm tâm phương án. 3.2.2. Kết quả tối ưu 3 yếu tố điều kiện nuôi cấy gồm giống cấy giống, độ ẩm và độ dày lớp môi trường Sau khi xác định thí nghiệm tại tâm, chúng tôi tiến hành tối ưu các yếu tố tỷ lệ giống cấy, độ ẩm và độ dày lớp môi trường trên cơ sở cố định các nồng độ KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Sac. tại điểm tối ưu tìm được ở mục 3.2.2. Cách bố trí và điều kiện thí nghiệm đã trình bày ở mục 2.2.4. Các công thức xem phụ lục 2, ma trận thí nghiệm như bảng 2.10. HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -76- Kết quả và biện luận Bảng 3.12. Hàm lượng beta – carotene theo số liệu thực nghiệm tối ưu các yếu tố điều kiện nuôi cấy Độ dày của lớp môi trường Tỷ lệ giống Hàm lượng beta-carotene TN Độ ẩm (CFU/g) (%) (cm) (ppm theo CK) 1 55 1 3,5x107 72,76 ± 9,57 2 65 1 3,5x107 94,49 ± 0,90 3 55 3 3,5x107 70,47± 14,75 4 65 3 3,5x107 82,38 ± 11,38 5 55 1 8,5x107 190,42 ± 9,97 6 65 1 8,5x107 175,95 ± 13,05 7 55 3 8,5x107 166,12 ± 17,43 8 65 3 8,5x107 221,80 ± 12,31 9 52 2 6,0x107 60,41 ± 1,28 10 68 2 6,0x107 150,51 ± 6,39 11 60 0,318 6,0x107 85,91 ± 3,06 12 60 3,682 6,0x107 109,33 ± 3,97 13 60 2 1,795x107 56,06 ± 11,57 14 60 2 10,205x107 160,50 ± 19,88 15 60 2 6,0x107 230,86 ± 18,01 16 60 2 6,0x107 235,22 ± 19,25 17 60 2 6,0x107 308,99 ± 16,57 18 60 2 6,0x107 275,41 ± 4,29 19 60 2 6,0x107 149,03 ± 9,61 20 60 2 6,0x107 319,80 ± 28,34 HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -77- Kết quả và biện luận Theo các số liệu ở bảng 3.12 và công thức (1) ở phụ lục 2, chúng tôi thu được các giá trị bj như trong bảng: Bảng 3.13. Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện b0 b1 b2 b3 b12 b13 b23 b11 b22 b33 251,75 16,57 3,41 44,64 7,54 0,95 4,49 -43,85 -46,63 -42,86 Theo các số liệu tính ở phụ lục 3.2 và công thức (3) ở phụ lục 2, tính các giá trị tj: Bảng 3.14. Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện t0 t1 t2 t3 t12 t13 t23 t11 t22 t33 9,83 0,98 0,20 2,63 0,34 0,04 0,20 2,65 2,82 2,59 Tra bảng tp(f) theo tiêu chuẩn Student với p = 0,05; f = n0 – 1 = 6 - 1 = 5 Suy ra, t0,05(5) = 2,57 So sánh các giá trị tj với t0,05(f), ta thấy t1, t2, t12, t13, t23 nhỏ hơn t0,05(5). Do đó, các hệ số b1, b2, b12, b13, b23 bị loại ra khỏi phương trình hồi qui. Phương trình hồi qui có dạng: y = 251,75 + 44,64 x3 - 43,85 x12- 46,63x22 - 42,86 x32 – Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi qui Theo các công thức (4), (5), (6), (7) và (8) ở phụ lục 2 , chúng tôi tính được các phương sai và F như ở bảng dưới: Bảng 3.15. Các phương sai và F theo số liệu thực nghiệm tối ưu các yếu tố điều kiện nuôi cấy Sdư Sth stt2 sth2 F 131689,32 19715,79 11197,35 3943,16 2,84 Tra bảng F1-p(f1, f2) theo tiêu chuẩn Fisher: Với: p = 0,05, f1 = N – l – (n0 – 1) = 10, f2 = n0 – 1 = 5. HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -78- Kết quả và biện luận Trong đó: l là hệ số có ý nghĩa trong phương trình hồi qui. Suy ra, F0,95(10;5) = 4,80 Vậy giá trị F = 2,84 < F0,95(10;5) = 4,80 nên phương trình hồi qui trên tương thích với thực nghiệm – Các điểm tối ưu của phương trình hồi qui Để tìm điểm tối ưu của phương trình hồi qui ta lấy đạo hàm theo từng biến. y'(x1) = - 87,70 x1= 0 ↔ x1= 0 y’(x2) = -93,25 x2= 0 ↔ x2= 0 y’(x3) = 44,64 – 85,71 x3= 0 ↔ x3= 0,521 Thế x1, x2, và x3 vào phương trình hồi qui ta được ymax ymax = 263,37 ppm beta-carotene (theo CK) Các điểm tối ưu: x1 = 0 ↔ Độ ẩm = 60% x2 = 0 ↔ Độ dày môi trường = 2 cm x3 = 0,521 ↔ Tỷ lệ giống = (6+ 2,5x0,521)x107 = 7,30.107 CFU/g môi trường 3.2.3. Kết luận và nhận xét - Kết luận Với các điều kiện ban đầu như sau: nhiệt độ phòng 28÷320C, hàm lượng dưỡng chất bổ sung (mg/Kg môi trường) KH2PO4 =45, MgSO4.7H2O=65, NaNO3 =200 và saccharose=300, sau 5 ngày nuôi cấy đã tối ưu được các điều kiện nuôi cấy ban đầu gồm độ ẩm, độ dày của lớp môi trường và tỷ lệ giống. Phương trình hồi qui tối ưu các yếu tố điều kiện nuôi cấy: y = 251,75 + 44,64 x3 - 43,85 x12- 46,63x22 - 42,86 x32 • Các yếu tố tối ưu: Độ ẩm môi trường = 60% HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -79- Kết quả và biện luận Độ dày lớp môi trường = 2 cm Tỷ lệ giống = 7,30x107 CFU/g môi trường Với các điều kiện ban đầu như trên, hàm mục tiêu ứng hàm lượng beta-carotene cực đại sau 5 ngày nuôi cấy là: ymax = 263,37 ppm beta-carotene (theo CK) - Nhận xét Cũng với phương pháp qui hoạch thực nghiệm của Box và Hunter (sau khi cố định hàm lượng KH2PO4 , MgSO4.7H2O, NaNO3 và saccharose tại điểm tối ưu ở mục 3.1.2); chúng tôi đã tiếp tục tối ưu các điều kiện nuôi cấy ban đầu gồm độ ẩm, độ dày của lớp môi trường và tỷ lệ giống. Theo phương trình hồi quy nhận được ở mục 3.2.2 cho thấy độ ẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống có ảnh hưởng nhất định đến quá trình sinh tổng hợp beta-carotene. Phương trình hồi qui cho thấy quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula sp.3 phụ thuộc bậc một vào tỷ lệ giống và bậc hai vào từng yếu tố đơn lẻ, giữa các yếu tố điều kiện không có sự tương tác qua lại với nhau. Với kết quả 2 giai đoạn tối ưu ở hai mục 3.1.2 và mục 3.2.2 chúng tôi đã tìm được điều kiện tối ưu cho toàn bộ quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula sp.3 trong điều kiện nuôi cấy bán rắn. 3.3. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA - CAROTENE THEO THỜI GIAN CỦA NẤM MEN RHODOTORULA SP.3 Sau khi thu kết quả tối ưu hóa môi trường nuôi cấy mục 3.1 và 3.2. Tiến hành khảo sát sự tạo thành beta – carotene của nấm men Rhodotorula sp.3 trên các điều kiện đã tối ưu theo thời gian (ngày), nhằm chọn được khoảng thời gian thu nhận beta – carotene hợp lí và cao nhất. Sau 9 ngày khảo sát, chúng tôi thu được kết quả sau: HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -80- Kết quả và biện luận Bảng 3.16. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp beta – carotene từ Rhodotorula sp.3 trên môi trường nuôi bán rắn Thời gian (ngày) Beta – carotene (ppm theo CK) 2 87,23 ± 2,86 g 3 130,55 ± 4,69 f 4 170,73 ± 7,57 e 5 219,13 ± 8,64 c 6 261,93 ± 16,84 b 7 275,46 ± 5,11 a 8 280,19 ± 8,40 a 9 206,57 ± 9,89 d (Các giá trị trong cùng một cột có số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức α=0,05) Từ bảng 3.16, chúng tôi vẽ được đồ thị hàm lượng beta – carotene theo thời gian như sau: 0 50 100 150 200 250 300 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8 Ngày 9 H àm lư ợn g be ta - ca ro te ne (p pm th eo C K ) Thời gian (ngày) Hình 3.1. Đồ thị quá trình sinh tổng beta – carotene theo thời gian HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -81- Kết quả và biện luận - Nhận xét Kết hợp bảng 3.16 và hình 3.1, cho thấy rằng hàm lượng beta – carotene được bắt đầu tổng hợp nhanh từ sau ngày thứ 3 cho đến ngày thứ 8, đặc biệt tăng cực nhanh trong giai đoạn từ 6 đến 8 ngày, biểu hiện qua hàm lượng beta – carotene tăng nhanh và liên tục. Dễ nhận thấy hàm lượng beta – carotene đạt cực đại vào 2 ngày 7 và 8 và giảm vào ngày thứ 9. Tuy nhiên, từ bảng 3.16 với kết quả phân tích ANOVA (phụ lục 3.3)