Kết quả và bàn luận về Lactobacillus acidophilus

Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 42 ‐  CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 43 ‐  3.1. Đặc điểm hình thái của Lactobacillus acidophilus 3.1.1. Hình dạng khuẩn lạc Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc của L.acidophilus Sau khi phân lập và chọn giống thuần trên môi trường MRS – agar, L.acidophilus có khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, nhô cao, đường kính khuẩn lạc 0,9 – 1,2 mm, rìa khuẩn lạc trơn và bề mặt khuẩn lạc khô. 3.1.2. Hình dạng tế bào Hình 3.2: Hình dạng tế bào L.acidophilus dưới kính hiển vi điện tử Tiến hành nhuộm gram rồi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100X. Kết quả nhuộm gram cho thấy chủng phân lập giữ được phức chất giữa violet crystal và lugol nên có màu tím. Vì vậy, L.acidophilus là vi khuẩn gram dương, hình que, đứng riêng lẻ hay tập trung thành sợi ngắn. Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 44 ‐  3.2. Các đặc tính sinh lý và sinh hoá của L.acidophilus 3.2.1. Khả năng sinh acid Hình 3.3: Khả năng sinh acid làm phân giải CaCO3 Sau 48 giờ nuôi trên môi trường CaCO3 – agar, kết quả cho thấy L.acidophilus có khả năng làm phân giải CaCO3 và tạo thành vòng tan trong suốt xung quanh khẩn lạc trên nền trắng đục của CaCO3. Như vậy, trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn L.acidophilus đã sử dụng glucose trong môi trường carbonate – agar và sinh ra acid lactic. Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 45 ‐  3.2.2. Khả năng sinh acid lactic Hình 3.4: Phản ứng với thuốc thử Uphenmen Ống nghiệm số 4 chứa dung dịch nuôi vi khuẩn sau 15 giờ làm đổi màu thuốc thử Uphenmen từ màu xanh tím sang vàng rơm là do trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi khuẩn L.acidophilus sinh acid lactic, phù hợp với ống nghiệm số 3 chứa acid lactic cũng làm đổi màu thuốc thử Uphenmen. Hai ống nghiệm số 1 và số 2 chứa nước cất và môi trường huyết thanh sữa, không chứa acid lactic nên không làm đổi màu thuốc thử Uphenmen. Như vậy, kết quả thí nghiệm trên cho thấy vi khuẩn L.acidophilus có khả năng sinh acid lactic. Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 46 ‐  3.2.3. Khả năng lên men các nguồn carbonhydrate Hình 3.5: Khả năng lên men các nguồn carbonhydrate của L.acidophilus ĐC: mẫu đối chứng. Glu: glucose; Fruc: fructose; Lac: lactose; Sac: saccharose; Mal: maltose; Man: mannose; Sor: sorbitol; Dex: dextrose; Gly: glycerol. Kết quả thí nghiệm cho thấy các ống nghiệm chứa glucose, fructose, lactose, saccharose và maltose làm chất chỉ thị phenol red chuyển từ màu đỏ sang màu vàng. Điều đó chứng tỏ chủng L.acidophilus đã sử dụng các nguồn đường trong môi trường nuôi cấy để sinh acid lactic làm môi trường giảm pH dẫn đến sự đổi màu của chất chỉ thị phenol red. Các ống nghiệm còn lại chứa các loại đường mannose, sorbitol, dextrose và glycerol không bị đổi màu là do chủng L.acidophilus không sử dụng được các nguồn đường này nên pH không thay đổi để làm đổi màu chất chỉ thị pH môi trường là phenol red. Kết quả thí nghiệm đạt được giống với kết quả nghiên cứu của Adrian Vamanu và cộng sự (2005) về khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate của Lactobacillus sp. Như vậy, L.acidophilus có thể sử dụng được các nguồn đường sau: glucose, fructose, lactose, saccharose và maltose. Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 47 ‐  3.2.4. Quan hệ với oxy Hình 3.6: Quan hệ với oxy của L.acidophilus Sau 48 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc của L.acidophilus xuất hiện dọc theo vết cấy từ đáy ống nghiệm lên trên bề mặt thạch. Như vậy L.acidophilus là vi khuẩn kỵ khí tuỳ tiện. Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 48 ‐  3.2.5. Khả năng tăng trưởng của L.acidophilus trên các pH khác nhau Hầu hết vi khuẩn có pH tối ưu cho quá trình sinh trưởng và phát triển là ở pH trung tính. Sự tăng hoặc giảm pH (chính là sự tăng hoặc giảm ion H+) của môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự sống sót của vi sinh vật nói chung. Khảo sát sự tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus trong môi trường huyết thanh sữa ở các pH khác nhau từ pH 3,5 đến pH 8,0. Kết quả như sau: 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 3.5 4 5 6 7 8 pH lo g( cf u/ m l) Hình 3.7 : Khả năng tăng trưởng của L.acidophilus ở các giá trị pH khác nhau của môi trường nuôi cấy Dựa vào hình 3.7 ta thấy vi khuẩn L.acidophilus có khả năng tăng trưởng tốt trong khoảng pH môi trường nuôi cấy là từ pH 5,0 đến pH 7,0. Và pH tối thích cho giống vi khuẩn này trong môi trường huyết thanh sữa là 6,6. Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 49 ‐  3.2.6. Khả năng tăng trưởng của L.acidophilus ở các nhiệt độ khác nhau Tốc độ các phản ứng sinh hoá xảy ra trong tế bào phụ thuộc vào hoạt tính của các enzyme trong tế bào vi sinh vật. Trong một số trường hợp, nhiệt độ tăng trưởng tối ưu cho một số vi sinh vật cũng chính là nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính của các enzyme tham gia vào các phản ứng sinh hoá xảy ra trong tế bào vi sinh vật. Ở nhiệt độ thấp có thể ức chế hoạt tính của các enzyme này. Ngược lại, ở nhiệt độ cao các enzyme này có thể bị biến tính không thuận nghịch. Vì vậy nhiệt độ cao hay thấp cũng ảnh hưởng tới sự phát triển của vi sinh vật. Khảo sát sự tăng trưởng của L.acidophilus trong môi trường huyết thanh sữa ở các giá trị nhiệt độ khác nhau, ta được kết quả như sau: 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 20 30 37 40 50 toC lo g( cf u/ m l) Hình 3.8: Khả năng tăng trưởng của L.acidophilus trên môi trường nuôi cấy ở các giá trị nhiệt độ khác nhau Dựa vào hình 4.8 ta thấy khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của L.acidophilus là từ 30oC đến 40oC. Và nhiệt độ tối thích cho vi khuẩn này phát triển trong môi trường huyết thanh sữa là 37oC. Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 50 ‐  3.3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus trong môi trường huyết thanh sữa Hình 3.9: Đường cong sinh trưởng của L.acidophilus trong môi trường huyết thanh sữa Dựa vào kết quả đường cong tăng trưởng của L.acidophilus ở hình 4.1 ta thấy: trong môi trường huyết thanh sữa, vi khuẩn L.acidophilus có pha lag kéo dài khoảng 4 – 6 giờ với µ = 0,219, pha log kéo dài khoảng 8 – 10 giờ với µ = 1,03, pha ổn định bắt đầu từ giờ thứ 14 – 16. Như vậy dựa vào đường cong tăng trưởng ta có thể thu sinh khối bắt đầu từ giờ thứ 15. Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 51 ‐  y = 3.76x + 2.43 R2 = 0.986 6.75 7.25 7.75 8.25 1.2 1.25 1.3 1.35 1.4 1.45 1.5 1.55 1.6 1.65 OD570nm lo g( cf u/ m l) Hình 3.10: Mối tương quan tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 52 ‐  3.4. Tối ưu hoá môi trường nuôi cấy L.acidophilus 3.4.1. Xác định ảnh hưởng của các nhân tố sinh trưởng đến sự phát triển của Lactobacillus acidophilus Huyết thanh sữa là một môi trường lý tưởng để nhân giống vi khuẩn lactic. Tuy nhiên tỷ lệ về hàm lượng các chất dinh dưỡng kém cân đối hơn so với sữa tươi. Đặc biệt là hàm lượng phosphate trong huyết thanh sữa khá thấp, từ đó tính đệm của môi trường sẽ bị giảm. Hơn nữa, hàm lượng môt số nguyên tố đa lượng và vi lượng khác trong huyết thanh sữa thấp hơn so với sữa tươi. Để khắc phục nhược điểm này, ta bổ sung thêm peptone, yeast extract và K2HPO4 vào huyết thanh sữa. Khảo sát sự ảnh hưởng của các nhân tố sinh trưởng đến sự phát triển của Lactobacillus acidophilus với hàm lượng các nhân tố sinh trưởng khác nhau, ta thu được kết quả như sau: 6.5 7 7.5 8 8.5 0 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Hàm lượng peptone (%) lo g( cf u/ m l) Hình 3.11: Ảnh hưởng của hàm lượng peptone đến sự tăng trưởng của L.acidophilus Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 53 ‐  4 5 6 7 8 9 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 Hàm lượng yeast extract (%) lo g( cf u/ m l) Hình 3.12: Ảnh hưởng của hàm lượng yeast extract đến sự tăng trưởng của L.acidophilus 6 6.5 7 7.5 8 8.5 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Hàm lượng K2HPO4 (%) lo g( cf u/ m l) Hình 3.13: Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4 đến sự tăng trưởng của L.acidophilus Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 54 ‐  Dựa vào hình 4.11, 4.12, 4.13 ta thấy hàm lượng peptone, yeast extract, K2HPO4 bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa khoảng 0,62%, 0,9%, 0,32% so với thể tích mơi trường là thích hợp để thu sinh khối vi khuẩn. 3.4.2. Tối ưu hoá thành phần môi trường huyết thanh sữa nuôi cấy L.acidophilus bằng phương pháp thực nghiệm Xác định điều kiện tối ưu để thu được sinh khối vi khuẩn L.acidophilus cực đại, ta tiến hành tối ưu hoá môi trường theo phương pháp thực nghiệm, cách tiến hành như sau: - Xét k = 3 nhân tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L.acidophilus (hàm lượng peptone, hàm lượng yeast extract, hàm lượng K2HPO4). - Ta tiến hành thí nghiệm ở n = 2 mức giá trị của các nhân tố. - Vậy số thí nghiệm cần thực hiện là: (thí nghiệm) - Hàm mục tiêu Y là sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (cfu/ml). Bảng 3.1: Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng Các mức Các nhân tố sinh trưởng Mức cơ sở 0,62 0,90 0,32 Khoảng biến thiên 0,18 0,20 0,04 Mức trên 0,80 1,10 0,36 Mức dưới 0,44 0,70 0,28 Trong đó: : hàm lượng peptone bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa (% so với môi trường). : hàm lượng yeast extraxt bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa (% so với môi trường). : hàm lượng K2HPO4 bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa (% so với môi trường). Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 55 ‐  Bảng 3.2: Bố trí và kết quả thí nghiệm STT Z1 Z2 Z3 Y1 10 6 Y2 106 Y3 106 106 1 0,8 1,10 0,36 12,972 11,246 12,218 12,145 2 0,8 1,10 0,28 78,524 62,806 46,105 62,478 3 0,8 0,70 0,36 5,358 5,012 5,572 5,314 4 0,8 0,70 0,28 6,109 9,183 8,035 7,776 5 0,44 1,10 0,36 34,674 38,019 40,926 37,873 6 0,44 1,10 0,28 324,34 97,724 114,815 178,96 7 0,44 0,70 0,36 19,011 22,803 14,355 18,723 8 0,44 0,70 0,28 31,477 38,905 36,308 35,563 Bảng 3.3: Chuyển sang hệ trục toạ độ không thứ nguyên STT x0 x1 x2 x3 10 6 1 + + + + 12,145 2 + + + - 62,478 3 + + - + 5,314 4 + + - - 7,776 5 + - + + 37,873 6 + - + - 178,96 7 + - - + 18,723 8 + - - - 35,563 Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 56 ‐  Bảng 3.4: Hệ số của phương trình hồi quy b0 b1 b2 b3 44,854 -22,926 28,01 -26,34 - Ta có phương trình hồi quy tổng quát như sau: Bảng 3.5: Thí nghiệm tại tâm phương án STT Yo 106 Ytb 106 (Yo – Ytb)2 1012 1012 Sth 106 1 124,165 120,015 17,223 118,863 10,902 2 128,233 67,536 3 107,647 152,967 - Kiểm tra sự có nghĩa của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Student: STT 0 44,854 3,855 11,635 1 -22,926 5,947 2 28,01 7,266 3 -26,34 6,833 Tra bảng tp(f) với p = 0,05; bậc tự do df = N(k – 1) = 8(3-1) = 16. Ta có t(0,05;16) = 2,12. Các hệ số trong phương trình hồi quy có nghĩa khí tj > tp(f). Như vậy, tất cả các hệ số của phương trình hồi quy đều có nghĩa. Ta có phương trình hồi quy như sau: Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 57 ‐  Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 58 ‐  - Kiểm tra sự tương thích của phương trình so với thực tế: STT Y 106 Y* 106 (Y – Y*)2 1012 106 F 1 12,145 23,598 131,125 1756,623 14,779 2 62,478 76,278 109,642 3 5,314 -32,422 1423,93 4 7,776 20,258 155,95 5 37,873 69,45 997,107 6 178,96 122,13 3229,649 7 18,723 13,43 27,984 8 35,563 66,11 951,106 Tra bảng F0,95(4,2) = 19,3. Ta thấy F = 14,779 < F0,95(4,2) = 19,3 nên phương trình hồi quy trên tương thích với thực tế. 3.4.3. Tối ưu hoá thành phần môi trường huyết thanh sữa nuôi cấy L.acidophilus theo phương pháp đường dốc nhất Bảng 3.6: Các giá trị hệ số của phương trình hồi quy và mức biến thiên STT bj j 1 -22,926 0,18 4,127 2 28,01 0,20 5,602 3 -26.34 0,04 1,054 Chọn bước nhảy Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 59 ‐  Xác định các bước nhảy còn lại: Quá trìn tối ưu hoá được bắt đầu bằng thí nghiệm mà tại đó giá trị các biến số được ấn định là mức cơ sở, còn các toạ độ tiếp theo được xác định theo công thức: (với j = 1, 2, 3). Bảng 3.7: Kết quả thí nghiệm tối ưu hoá môi trường theo phương pháp leo dốc STT Z1 Z2 Z3 Y1 106 Y2 106 Y3 106 106 1 0,62 0,90 0,32 206,538 304,789 317,687 276,338 2 0,745 0,107 0,352 334,195 374,973 762,079 490,416 3 0,87 1,24 0,384 587,789 639,735 554,626 593,95 4 0,995 1,41 0,416 309,742 399,025 353,997 354,255 5 1,12 1,58 0,448 283,792 215,278 254,097 251,056 6 1,245 1,75 0,48 103,753 129,42 111,173 114,782 7 1,37 1,92 0,512 51,523 25,942 29,512 35,659 8 1,495 2,09 0,544 15,631 20,323 26,062 20,672 Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 60 ‐  0 100 200 300 400 500 600 TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 y Hình 3.14: Kết quả thí nghiệm tối ưu hoá môi trường theo phương pháp leo dốc Như vậy, để thu được sinh khối vi khuẩn cực đại ta chọn thành phần môi trường huyết thanh sữa theo tỷ lệ như sau: ƒ Peptone: 0,87% so với môi trường. ƒ Yeast extract: 1,24% so với môi trường. ƒ K2HPO4: 0,384% so với môi trường. Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 61 ‐  4.5. Đánh giá hiệu quả của phương pháp sấy phun 8 8.4 8.8 9.2 9.6 10 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 lo g( cf u/ m l) Trước sấy phun Sau sấy phun Hình 3.15: Mật độ tế bào vi khuẩn trước và sau khi sấy phun Sau khi tiến hành sấy phun chúng tôi thu được kết quả như sau: Tỷ lệ tế bào sống sót sau khi sấy phun của các mẫu thí nghiệm với công thức các chất vi bao khác nhau lần lượt là 10,05%; 13,41%, 34,33%; 40,72%, 63,45%, 54,14%. Như vậy với công thức sấy phun ở mẫu số 5 cho tỷ lệ tế bào L.acidophilus sống sót là cao nhất. Điều đó chứng tỏ phương pháp tạo probiotic bằng sấy phun với công thức ở mẫu số 5 là tối ưu. Qua đó chúng tôi nhận thấy rằng, hàm lượng sữa gầy là 20% thì vi bao tốt hơn so với hàm lượng sữa gầy 15%. Ngoài ra, muối cũng có tác dụng giúp tế bào chống chịu được với nhiệt độ nên làm tăng tỷ lệ sống sót. Tuy nhiên nếu lượng muối quá cao sẽ ức chế vi sinh vật làm giảm tỷ lệ sống sót của tế bào. Ngoài ra, độ ẩm của mẫu sấy phun cũng có ý nghĩa rất quan trọng. Nếu độ ẩm quá thấp thì tỷ lệ sống sót của vi sinh vật sẽ giảm nhanh. Theo Ananta.E (2004) thì độ ẩm trong mẫu sấy phun tối thiểu là 7% để đảm bảo ít ảnh hưởng tới tỷ lệ sống sót của vi khuẩn trong chế phẩm. Như vậy mẫu sấy phun có độ ẩm > 6% là đạt yêu cầu. Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 62 ‐