Kết quả và bàn luận về nấm mốc

Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp enzym cellulase có hoạt tính cao nhất. Ta có 9 giống nấm mốc lấy từ PTNVS: A.Niger, A.awamori, A.aculactum, A.oryzae, T.konigii, T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus.sp. Thí nghiệm 1: Thử nhanh xác định loài nấm mốc có hoạt tính enzym cellulase. Kết quả thí nghiệm P.citrinum A.awamori A.aculactum A. Niger Hình 4.1-Kết quả thử nhanh hoạt tính cellulase của 4 loài nấm mốc Nhận xét và bàn luận Phương pháp chọn lọc sơ bộ VSV có khả năng sinh hoạt tính cellulase dựa trên sự bắt màu của thuốc thử Congo đỏ với polysaccharide (CMC). Thuốc thử Congo đỏ có khả năng bắt màu với liên kết hidrogen của polysaccharide. Khi CMC bị phân hủy tạo thành các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp hơn thì sự bắt màu với Congo đỏ không còn nữa. Vùng trong suốt trên nền đỏ là nơi enzym tác dụng và phân hủy cơ chất. Tuy nhiên màu ở vùng này còn tùy thuộc vào sản phẩm cuối của quá trình thủy phân cellulose. Trong thí nghiệm này vùng thủy phân có màu vàng. Như vậy sản phẩm cuối không chỉ là đường đơn mà còn các chất khác có trọng lượng phân tử cao hơn. Ngoài ra, trong phương pháp này dung dịch enzym thu được từ môi trường lỏng cần được lọc để loại bỏ tế bào nấm mốc trước khi tiến hành thử trên hộp petri. Làm như vậy ta loại bỏ được ảnh hưởng của sợi nấm mốc đến khả năng bắt màu với thuốc thử Congo đỏ. Trong 9 loài nấm mốc ở trên thì chỉ có 4 loài A.Niger, A.awamori, A.aculactum và P.citrinum có xuất hiện vùng màu vàng trên nền đỏ. Vùng này chính là vùng CMC bị phân giải bởi enzym. Như vậy với điều kiện thí nghiệm, trong 9 loài nấm mốc đã chọn thử hoạt tính thì 4 loài này là có khả năng sinh enzym cellulase. Kết quả thu được chỉ là tương đối, bởi vì trong 9 loài nấm mốc mà ta chọn thuộc 4 giốngï: Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus và Penicillium. Mỗi giống này có tốc độ sinh trưởng khác nhau. Do đó, thời gian để chúng sinh tổng hợp enzym có hoạt tính cao nhất cũng khác nhau. Mà thí nghiệm này ta chỉ sử dụng ở cùng một thời điểm là 3 ngày, cho nên dựa trên kết quả này ta chỉ chọn được sơ bộ một số loài VSV có hoạt tính enzym cellulase chứ chưa chọn được loài VSV có hoạt tính enzym cellulase cao nhất. Muốn có kết quả chính xác ta cần khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym theo thời gian. Thí nghiệm 2: Chọn loài nấm mốc có hoạt tính enzym cao nhất Tiếp tục ta nuôi 4 loài nấm mốc này trên môi trường CZ với nguồn cơ chất là CMC 1%. Sau đó ta tiến hành xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp đo đường khử. Kết quả được đo ở ngày thứ 2, 3, 4, 5. Kết quả thí nghiệm Bảng 4.1– Hoạt tính CMCase của các loài nấm mốc theo thời gian (UI/ml) Thời gian (ngày) Nấm mốc 2 3 4 5 A.Niger 0,040 0,053 0,033 0,028 A.awamori 0,047 0,067 0,047 0,032 A.aculactum 0,029 0,066 0,047 0,036 P.citrinum 0,034 0,102 0,123 0,100 Hình 4.2- Đồ thị biểu diễn hoạt tính CMCase theo thời gian của 4 loài nấm mốc Nhận xét và bàn luận Dựa vào đồ thị 4.2 ta thấy rằng nấm mốc P.citrinum có hoạt tính CMCase cao nhất. Trong thí nghiệm này ta thấy các giống Aspergillus có hoạt tính enzym cao ở ngày thứ 3 còn P.citrinum ở ngày thứ 4. Tuy tốc độ phát triển của A.Niger, A.awamori, A.aculactum nhanh hơn P.citrinum nhưng hoạt tính enzym cao nhất của chúng thì lại thấp hơn. So sánh hoạt tính cao nhất của các loài này ta thấy loài A.Niger bằng 43%, A.awamori bằng 55%, A.aculactum bằng 54% hoạt tính của P.citrinum. Trong thực tế người ta thường sản xuất enzym cellulase từ A.Niger, T.reesei, A.awamori. Có rất ít nghiên cứu trên các loài Penicillium do tốc độ phát triển chậm và thường trong quá trình phát triển chúng tạo ra các chất kháng sinh gây khó khăn cho quá trình tinh sạch enzym sau này. Nhưng theo thí nghiệm trên đây thì loài có khả năng sinh hoạt tính enzym cao nhất là P.citrinum, đây có thể là một hướng nghiên cứu mới để sản xuất enzym cellulase. Mặt khác ở đây ta chỉ khảo sát hoạt tính CMCase biểu thị hoạt tính enzym EG. Còn hoạt tính enzym CBH và b-glucosidase thì chưa khảo sát nên ta chỉ có thể kết luận loài này sinh tổng hợp enzym EG cao nhất trong các loài nấm mốc đã chọn. Aûnh hưởng nguồn carbon (cellulose) đến khả năng sinh tổng hợp enzym Thí nghiệm 3: chọn nguồn carbon thích hợp cho nấm mốc P.citrinum Rơm, bã mía, mùn cưa sau khi xử lý được dùng làm nguồn carbon cho vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng 1%. Sau 4 ngày ta đo hoạt tính enzym trong dịch nuôi cấy và chọn ra nguồn carbon thích hợp nhất cho nấm mốc P.citrinum. Kết quả Bảng 4.2- Hoạt tính enzym của nấm mốc P.citrinum trên 3 nguồn carbon khác nhau Nguồn carbon Rơm Bã mía Mùn cưa CMCase (UI/ml) 0,911 0,755 0,223 Nhận xét và bàn luận Dựa vào bảng kết quả trên thì cơ chất rơm là tốt nhất đối với loài nấm mốc này. Từ kết quả trên thì môi trường rơm là tốt nhất. Bảng 4.3-Thành phần của nguyên liệu rơm, bã mía, mùn cưa [20] Cơ chất Cellulose (%) Hemicellulase (%) Lignin (%) Rơm 38,2 24,7 23,4 Bã mía 50,0 30,0 18,0 Mùn cưa 41,9 21,6 27,1 Dựa vào bảng trên ta thấy nếu dựa trên hàm lượng cơ chất thì đáng lẽ bã mía phải cho hàm lượng đường và hoạt tính enzym cao hơn. Thế nhưng kết quả thí nghiệm lại hoàn toàn khác.Ta thấy rằng hàm lượng đường và hoạt tính enzym trên nguyên liệu rơm là cao nhất, kế đến bã mía và thấp nhất là mùn cưa. Nghiên cứu của Solomon et al. thủy phân bã mía, mùn cưa và lõi bắp bởi nấm mốc A.flavus thì mùn cưa có hoạt tính enzym cao nhất (0,0743UI/ml), bã mía (0,0573 UI/ml) và lõi bắp (0,0502 UI/ml) [7]. Theo như kết quả nghiên cứu thì hoạt tính CMCase trên mùn cưa là 0,223UI/ml cao hơn kết quả nghiên cứu của Solomon et al. (2003) 3 lần; còn trên bã mía là 0,755 UI/ml cao hơn kết quả của Solomon et al. (2003) 13 lần. Như vậy loài nấm mốc P.citrinum có khả năng sinh hoạt tính CMCase cao hơn rất nhiều so với loài A.flavus trong nghiên cứu của Solomon et al. mặc dù trên cùng một cơ chất. Tuy nhiên điều này cũng phụ thuộc rất nhiều yếu tố. Khi thủy phân cơ chất ligno-cellulose thì thành phần gây cản trở khả năng tiếp xúc enzym với cơ chất cellulose chính là lignin. Lignin có cấu trúc vô cùng vững chắc rất khó phân cắt. Việc tiền xử lý nguyên liệu bằng NaOH là nhằm mục đích phá vỡ liên kết của lignin, nhưng việc xử lý này chỉ làm giảm được ½ lượng lignin. Tuy nhiên nguyên liệu khác nhau khả năng giảm lignin cũng khác nhau. Mặt khác, tỉ lệ vùng kết tinh và vùng vô định hình trên nguyên liệu khác nhau thì khác nhau. Cây càng lâu năm thì lượng cellulose kết tinh càng nhiều. Chính vì vậy mà hàm lượng cellulose kết tinh của mùn cưa là cao nhất, kế đến là bã mía và cuối cùng là rơm. Như vậy có thể rằng loài nấm mốc này có khả năng sản sinh lượng lớn enzym EG – một loại enzym cellulase có khả năng phân cắt tốt trên cơ chất cellulose vô định hình. Nhìn chung theo kết quả này thì loài nấm mốc P.citrinum hứa hẹn rất nhiều khả năng ứng dụng để sản xuất enzym cellulase trong công nghiệp. Thí nghiệm 4: khảo sát hàm lượng rơm tốt nhất cho vào môi trường nuôi cấy Ta tiến hành thí nghiệm ở các nồng độ rơm 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%. Kết quả thí nghiệm Bảng 4.4- Hoạt tính CMCase của P.citrinum với các nồng độ rơm khác nhau Rơm(%) CMCase(UI/ml) 0,5 0,383 1,0 0,962 1,5 1,111 2,0 1,150 2,5 1,022 3,0 0,953 3,5 0,832 Hình 4.3- Aûnh hưởng của nồng độ rơm đến hoạt tính enzym cellulase Nhận xét và bàn luận Dựa vào đồ thị trên ta thấy ở nồng độ 2% thì hoạt tính CMCase là cao nhất. Nồng độ rơm cao hơn 2% thì hoạt tính enzym giảm. Đó là do nồng độ cơ chất cao tạo ra áp suất thẩm thấu lớn ức chế khả năng sinh tổng hợp enzym của nấm mốc. Mặt khác sự tạo thành sản phẩm cellobiosa và các cellodextrin mạch ngắn trong quá trình thủy phân cellulose cũng gây ức chế đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Cellobiosa có khả năng ức chế cả enzym EG và CBH. Sự giảm hoạt tính cũng có thể là do thiếu nguồn dinh dưỡng khác như nguồn nitơ, nguồn khoáng,…hoặc do sự tạo thành liên kết đặc biệt của enzym với cơ chất làm giảm tính hoạt động của enzym. Theo [10] nghiên cứu sử dụng phế liệu nông nghiệp sản xuất enzym cellulase từ A.Niger thì hàm lượng nguồn carbon tốt nhất là 5%. Có sự khác biệt trong kết quả nghiên cứu là do sự khác nhau về loài nấm mốc. Mỗi loài nấm mốc có khả năng chịu áp suất thẩm thấu khác nhau. Nhưng cũng có thể là do môi trường nuôi cấy khác nhau, nguồn gốc cơ chất khác nhau. Một số nghiên cứu khác như từ vi khuẩn Thermomonospora curvata [20] sử dụng nguồn carbon là sợi cotton thì hàm lượng tối ưu là 0,8%; Chaetomium globosum [16] nguồn carbon là sợi cotton thì tối ưu là 1%. Aûnh hưởng nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp enzym Thí nghiệm 5: chọn nguồn nitơ Ta tiến hành thí nghiệm trên 3 mẫu: mẫu có bổ sung pepton 0,5%, mẫu có yeast extract 0,5%, và mẫu không bổ sung cả 2 thành phần trên. Kết quả Bảng 4.5- Hoạt tính CMCase của P.citrinum với các nguồn nitơ bổ sung khác nhau CMCase (UI/ml) None 0,572 Pepton 1,108 Yeast extract 1,092 Nhận xét và bàn luận Dựa vào kết quả trên ta thấy rằng pepton và yeast extract có ảnh hưởng như nhau đến hoạt tính enzym celullase. Vì vậy ta chọn nguồn bổ sung là pepton. Khi không bổ sung pepton hay Yeast extract thì hoạt tính CMCase chỉ bằng 50% khi có bổ sung. Như vậy ta thấy rằng môi trường CZ thiếu nguồn nitơ cho loài nấm mốc khảo sát. Nguồn nitơ rất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của VSV mặc dù việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng rất nhỏ. Bản thân môi trường CZ cũng có chứa nguồn nitơ dưới dạng muối vô cơ nhưng với hàm lượng rất thấp. Như vậy trong quá trình sinh trưởng và phát triển, ngoài nguồn nitơ vô cơ VSV còn cần bổ sung thêm nguồn nitơ hữu cơ như pepton, yeast extract hay meat extract. Thí nghiệm 6: chọn hàm lượng pepton bổ sung tốt nhất. Tiến hành thí nghiệm với nồng độ pepton bổ sung vào môi trường nuôi cấy là 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%, 0,9%. Kết quả Bảng 4.6- Hoạt tính CMCase ứng với nồng độ pepton khác nhau Pepton(%) CMCase (UI/ml) 0.1 0,520 0.3 0,645 0.5 1,011 0.7 0,857 0.9 0,874 Hình 4.4- Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ pepton đến hoạt tính CMCase Nhận xét và bàn luận Kết quả cho thấy hàm lượng pepton 0,5% là thích hợp nhất. Ở nồng độ pepton cao hơn gây ra áp suất thẩm thấu lớn ức chế khả năng sinh tổng hợp enzym của nấm mốc. So sánh với các nghiên cứu khác Thermophilic Clostridium [6] thì nguồn bổ sung yeast extract tốt nhất là 0,5%; Chaetomium globosum [16] hàm lượng pepton bổ sung tốt nhất là 0,6%. Aûnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzym Thí nghiệm 7:Tiến hành thí nghiệm với 6 giá trị pH của môi trường nuôi cấy: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Kết quả Bảng 4.7 – Hoạt tính CMCase ứng với pH và thời gian khác nhau Thời gian (ngày) pH 1 2 3 4 5 6 7 3 0,512 0,836 1,192 1,000 0,720 0,644 0,400 4 0,600 1,076 1,636 1,428 1,096 1,064 0,864 5 0,284 0,476 0,784 0,960 0,632 0,400 0,228 6 0,228 0,436 0,700 0,908 0,828 0,716 0,520 7 0,220 0,360 0,684 0,848 0,676 0,476 0,356 8 0,128 0,220 0,480 0,820 1,036 1,124 0,856 Sau đây là đồ thị biểu diễn hoạt tính CMCase theo thời gian ứng với các pH khác nhau: Hình 4.5– Đồ thị thể hiện hoạt tính CMCase theo thời gian ở các pH khác nhau Như vậy ở ngày thứ 3, pH=4 có hoạt tính CMCase cao nhất. Hình 4.6- Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt tính CMCase (đo ở ngày thứ 3) Nhận xét và bàn luận Dựa vào bảng 4.7 ta thấy pH=4 là pH tối ưu cho nấm mốc P.citrinum sinh tổng hợp enzym. Dựa vào đồ thị 4.5 biễu diễn ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính CMCase ở pH=4, thì thời gian tối ưu cho loài nấm mốc này là 3 ngày. Đến ngày thứ 4 hoạt tính còn 87%, đến ngày thứ 5 hoạt tính còn 70%, đến ngày thứ 6 còn 65%, ngày thứ 7 còn 52%. Như vậy hoạt tính enzym giảm nhanh, sau 7 ngày hoạt tính giảm 50%. Có sự giảm nhanh hoạt tính enzym là do trong quá trình nuôi cấy pH môi trường nuôi cấy luôn luôn thay đổi ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzym. Trong quá trình nuôi cấy VSV sinh tổng hợp enzym cellulase phân hủy cellulose thành hợp chất đơn giản hơn dextrose mà chúng có thể hấp thụ được. Sau khi vào cơ thể hợp chất dextrose tiếp tục bị phân giải theo 2 con đường: đường phân (EMP) và Pento-photphat (PP) tạo sản phẩm piruvat. Sau đó piruvat tham gia vào chu trình Krebs tạo ra năng lượng cung cấp cho các hoạt động sống của VSV. Quá trình này tạo ra nhiều acid hữu cơ làm thay đổi pH của môi trường. Sự thay đổi pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy cũng giải thích tại sao ở những pH khác nhau thì thời gian để nấm mốc sinh tổng hợp enzym có hoạt tính cao nhất cũng khác nhau. Ban đầu pH trong môi trường giảm nhưng sau đó lại tăng lên do VSV sử dụng nguồn carbon là các acid này để sinh trưởng và phát triển. Để khắc phục sự thay đổi pH trong suốt quá trình nuôi cấy người ta có thể sử dụng dung dịch đệm cho vào môi trường nuôi cấy hoặc sử dụng thiết bị nuôi cấy mà ta có thể điều chỉnh được pH trong suốt quá trình nuôi cấy. Sự giảm hoạt tính sau ngày thứ 3 là do sự ức chế bởi sản phẩm cuối như cellobiosa và các cellodextrin mạch ngắn do thủy phân cellulose. Theo [6] nghiên cứu trên loài Thermophilic Clostridium thì hàm lượng glucose và cellobiosa bắt đầu có tác dụng ức chế khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase là 0,05%, còn ở hàm lượng 0,3% cellobiose và 0,4% glucose thì có tác dụng ức chế hoàn toàn. Ngoài ra, sự thủy phân hợp chất lignin tạo các hợp chất thơm cũng có tác dụng ức chế sự sinh tổng hợp enzym của VSV. Nghiên cứu trên các loài VSV khác như vi khuẩn Thermomonospora curvata [20] thì pH tối thích là 8, thời gian là 6 ngày; A. Niger[8] pH=5, thời gian 5 ngày trên cơ chất xơ dừa, và pH=6, thời gian 5 ngày trên cơ chất mùn cưa; A.Niger[10] pH=3, thời gian là 3 ngày. Như vậy cùng 1 loài VSV nhưng với những cơ chất khác nhau thì kết quả cũng khác nhau. Aûnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym cellulase Thí nghiệm 8: Phản ứng được thực hiện ở các nhiệt độ 40, 45, 50, 55, 600C Kết quả Bảng 4.8– Hoạt tính CMCase ở các nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ(0C) CMCase (UI/ml) 40 1,503 45 1,566 50 1,794 55 1,725 60 1,647 Hình 4.7 – Đồ thị biểu diễn hoạt tính CMCase theo nhiệt độ Nhận xét và bàn luận Dựa vào đồ thị 4.7 thì nhiệt độ tốt nhất cho enzym cellulase thu nhận từ P.citrinum là 500C. Ở nhiệt độ 550C hoạt tính enzym giảm 3,8%, ở nhiệt độ 600C hoạt tính giảm 8%; còn ở nhiệt độ 450C hoạt tính giảm 10%, ở 400C là 16%. Nhìn chung enzym này có hoạt tính ổn định theo nhiệt độ. Tính ổn định của enzym có ý nghĩa rất lớn trong việc sản xuất cũng như ứng dụng enzym. Và tính ổn định nhiệt độ của enzym sản xuất từ loài nấm mốc này hứa hẹn rất lớn khả năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm enzym thương mại. Theo [22] nghiên cứu sinh tổng hợp enzym của nấm mốc A.Niger nhiệt độ tối thích cho enzym là 400C, enzym này ổn định hoạt tính ở nhiệt độ <400C và mất hoạt tính ở nhiệt độ 650C. Enzym thu nhận từ nấm mốc P.citrinum có khả năng chịu được cao hơn, ở nhiệt độ 600C hoạt tính chỉ giảm 8%. Theo [4] thì nhiệt độ tối thích của enzym cellulase thu được từ nấm mốc là 45-600C. Nhiệt độ tối thích của enzym cellulase thu được từ P.citrinum có giá trị thấp hơn enzym thương mại từ A.Niger (600C). Ở một số loài vi khuẩn thì nhiệt độ này thấp hơn Thermophilic Clostridium [6] là 670C, Thermomonospora curvata [20] là 600C, Bacillus pumilus[9] là 600C; nấm mốc A.Niger[10] là 550C. Tuy nhiên kết quả này cũng chưa thật sự là nhiệt độ tối thích của enzym cellulase được thu nhận từ nấm mốc P.citrinum vì đây chỉ là enzym thô. Trong hỗn hợp enzym thôø còn có rất nhiều thành phần khác có ảnh hưởng đến hoạt tính enzym Muốn có kết quả chính xác enzym cần được tinh sạch bằng các phương pháp như: kết tủa bằng cồn, trao đổi ion,…để thu được enzym tinh khiết. Aûnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym cellulase Thí nghiệm 9: dùng dung dịch đệm với các giá trị pH là 5; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0 để ổn định pH của phản ứng enzym. Kết quả thí nghiệm Bảng 4.9- Hoạt tính CMCase ở các pH khác nhau pH CMCase (UI/ml) 5,0 1,536 5,5 1,762 6,0 1,685 6,5 1,517 7,0 1,441 7,5 1,215 8,0 1,123 Hình 4.8- Đồ thị biểu diễn hoạt tính CMCase theo pH Nhận xét và bàn luận Kết quả thí nghiệm cho thấy pH=5.5 là thích hợp nhất đối với enzym cellulase. Ở giá trị pH=5 hoạt tính enzym giảm 12,83%, pH=6 giảm 4,37%, pH=6,5 giảm 13,34%, pH=7 giảm 18,22%, pH=7,5 giảm 31,04%, pH=8 giảm 36,27%. Nhìn chung khoảng pH=5-7 hoạt tính enzym thay đổi không đáng kể, trong khoảng pH này pH không có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzym. Khoảng pH tối thích cho enzym cellulase từ nấm mốc theo [2] là pH=4-6. Như vậy kết quả thu được pH tối thích của enzym từ loài nấm mốc này tương tự như kết quả thu được từ các loài nấm mốc khác. Nguyên nhân giảm hoạt tính khi pH khác 5,5 là do enzym có bản chất là protein nên dễ dàng bị biến tính bởi điều kiện pH của phản ứng. Một số nghiên cứu trên các loài VSV khác:pH tối thích của cellulase từ Thermophilic Clostridium [6] là 6,5, Bacillus pumilus[9] là 6, A.Niger[10] là 5. Qua nghiên cứu ta thu được enzym cellulase có hoạt tính CMCase là 1,762 UI/ml trên cơ chất là rơm với hàm lượng 2%, hàm lượng pepton bổ sung là 0,5%, pH môi trường nuôi cấy là 4; nhiệt độ tối thích của enzym là 500C, pH tối thích của enzym là 5,5. Hoạt tính CMCase của một số loài VSV được nghiên cứu: Thermophilic Clostridium là 183mUI/ml, Aspergilus flavus [7] là 0,0743 UI/ml trên cơ chất là mùn cưa, Thermomonospora curvata [20] là 5,9UI/ml trên cơ chất là sợi cotton, Aspergilus Niger[8] là 0,258 UI/ml đối với xơ dừa và 0,274 UI/ml đối với mùn cưa, Aspergilus fumigatus[8] là 0,292UI/ml đối với xơ dừa và 0,272 UI/ml đối với mùn cưa. Kết quả thu được khác nhau là do sự khác nhau về loài VSV, môi trường nuôi cấy, cơ chất sử dụng. Ứng dụng enzym cellulase để thủy phân cơ chất rơm Enzym được nuôi cấy với những điều kiện tối ưu như trên, sau đó được lọc và tiến hành cho thủy phân cơ chất rơm (ở đây cơ chất đã được xử lý). Lượng cơ chất được sử dụng trong ứng dụng này là 5%, 10