Theo những kết quả nghiên cứu trước đây của phòng thí nghiệm, KIF2A và AP-2 là protein partner tương ứng của PIP5KA và PIP5KC661. Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng vùng hình cầu của KIF2A và vùng ear của β2-AP2 như“mẫu dò” để phát hiện PIP5KA và PIP5KC661 hoạt hóa trong tế bào COS-7, HeLa clone 3. Nội dung thí nghiệm bao gồm:
37 trang |
Chia sẻ: vietpd | Lượt xem: 1452 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Kết quả và thảo luận về PIP5KA, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
39
Theo những kết quả nghiên cứu trước đây của phòng thí nghiệm, KIF2A và
AP-2 là protein partner tương ứng của PIP5KA và PIP5KC661. Trong luận văn này,
chúng tôi sử dụng vùng hình cầu của KIF2A và vùng ear của β2-AP2 như “mẫu dò”
để phát hiện PIP5KA và PIP5KC661 hoạt hóa trong tế bào COS-7, HeLa clone 3.
Nội dung thí nghiệm bao gồm: Tạo dòng cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A
và vùng ear của β2-AP2 vào vector pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238). Sau
đó, kiểm tra sự biểu hiện của các protein và hiệu quả hoạt động của hệ thống Split
Venus. Và xác định sự hoạt hóa của PIP5KA, PIP5KC661 và những biến đổi kiểu
hình trên dòng tế bào HeLa clone 3.
3.1. Tạo dòng và kiểm tra trình tự cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A
(KIF2A-GD) và vùng ear của protein β2-Adaptin (β2-Adaptin-ear)
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành dòng hóa hai cDNA mã hóa cho hai “mẫu dò”
này vào hệ thống vector biểu hiện pVenus và kiểm tra kết quả tạo dòng bằng
phương pháp giải trình tự.
3.1.1. Thu nhận cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear bằng phương pháp
PCR.
1 2 3
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin
ear từ DNA plasmid.
Giếng 1: Thang 1kb (kích thước các vạch tương ứng từ trên xuống: 10 kb, 8 kb, 6
kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1,5 kb, 1 kb và 500 bp); Giếng 2: sản phẩm PCR cDNA
của β2-Adaptin ear; Giếng 3: sản phẩm PCR cDNA của KIF2A-GD
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
40
Để thu nhận được một lượng lớn cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear
cần thiết cho quá trình tạo dòng, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR nhân bản
trình tự cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A và vùng ear của protein β2-
Adaptin từ hai plasmid tương ứng là pCMV5-Flag-Kif2a full length (100 ng/µl) và
pDNA3-Myc- β2-Adaptin (100 ng/µl).
Phản ứng PCR được thực hiện bằng enzyme PrimeSTAR (Takara), là một
polymerase có tính trung thực cao và hiệu quả nhân bản lớn để hạn chế những đột
biến xảy ra trong quá trình sao chép [41]. Kết quả điện di (hình 3.1- giếng 3) cho
thấy sản phẩm PCR với cặp mồi KIF2A-01F và KIF2A-02B có kích thước khoảng
586 bp tương ứng với kích thước cDNA của KIF2A-GD. Giếng (2) là sản phẩm
PCR có kích thước khoảng 733 bp phù hợp với kích thước cDNA của β2-Adaptin
ear.
Như vậy, bằng phương pháp PCR, chúng tôi đã thu nhận được hai sản phẩm
cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear có kích thước đúng như dự đoán.
3.1.2. Dòng hóa cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear vào vector pVenus
(1-173) N1 và pVenus (155-238) N1.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi sử dụng vector pVenus (1-173) N1
và pVenus (155-238) N1 làm vector biểu hiện trình tự mã hóa cho KIF2A-GD và
β2-Adaptin-ear. Đối với vector pVenus (1-173) N1, protein được biểu hiện dưới
dạng dung hợp vào đầu N của mảnh Venus gồm trình tự amino acid thứ 1 đến
amino acid thứ 173 (gọi là mảnh N-Venus). Đối với vector pVenus (155-238) N1,
protein được biểu hiện dưới dạng dung hợp vào đầu N của mảnh Venus gồm amino
acid thứ 155 đến amino acid 238 (gọi là mảnh C-Venus).
Sản phẩm PCR nói trên và plasmid pVenus (1-173) N1, pVenus (155-238)
N1 được xử lí với enzyme cắt giới hạn XhoI/EcoRI và tiến hành phản ứng nối để tạo
plasmid tái tổ hợp. Các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào chủng Ecoli DH5α,
sau đó được sàng lọc trên môi trường LB có bổ sung Kanamycin (50 µg/ml). Tách
chiết plasmid và sàng lọc các plasmid tái tổ hợp có mang đoạn cDNA mục tiêu
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
41
bằng phản ứng cắt với cặp enzyme XhoI/EcoRI. Đối với plasmid pVenus (1-173)-
KIF2A-GD (hoặc pVenus (1-173)-β2-Adaptin-ear), khi điện di sản phẩm cắt sẽ có
hai vạch có kích thước khoảng 4596 bp và 567 bp (hoặc 714 bp). Tương tự, với
plasmid tái tổ hợp pVenus(155-238) có mang cDNA β2-Adaptin-ear (hoặc cDNA
KIF2A-GD), kết quả sản phẩm cắt sẽ có một vạch 4313 bp tương ứng với kích
thước của plasmid và một vạch 714 bp (hoặc 567 bp).
Kết quả hình 3.2 cho phép xác định plasmid tái tổ hợp (2); (3);
(4); (5) và (6) có mang trình tự cDNA của KIF2A-GD, các plasmid tái tổ hợp (7);
Hình 3.2. Kết quả điện di phản ứng cắt sàng lọc plasmid tái tổ hợp.
Giếng 1: Thang 1 kb(kích thước các vạch tương ứng từ trên xuống: 10 kb, 8 kb, 6
kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1,5 kb, 1 kb và 500 bp),
Giếng 2, 3, 4 và 5: các plasmid tái tổ hợp pVenus (1-173)-KIF2A-GD được xử lí với
cặp enzyme XhoI/EcoRI.
Giếng 6: plasmid tái tổ hợp pVenus (155-238)-KIF2A-GD được xử lí với cặp
enzyme XhoI/EcoRI.
Giếng 7, 8, 9 và 10: các plasmid tái tổ hợp pVenus (1-173)-β2Adaptin-ear được xử
lí với cặp enzyme XhoI/EcoRI.
Giếng 11, 12 và 13: các plasmid tái tổ hợp pVenus (155-238)-β2Adaptin-ear được
xử lí với cặp enzyme XhoI/EcoRI
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
42
(8); (9); (10); (11); (12) và (13) có mang trình tự cDNA của β2-Adaptin-ear. Bốn
plasmid tái tổ hợp (2); (6); (8) và (12) được tiến hành giải trình tự để kiểm tra.
3.1.3. Kết quả giải trình tự
Chúng tôi sử dụng mồi pEGFP #F bao ngoài vùng KIF2A-GD và β2-
Adaptin-ear trên plasmid pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1 để giải trình
tự các plasmid tái tổ hợp nói trên. Kết quả so sánh trình tự thu được với trình tự trên
ngân hàng gene (NCBI) bằng phần mềm ClustalX như sau:
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự plasmid pVenus (1-173) KIF2A-GD và so sánh
với trình tự NM 00844.2 trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm
ClustalX.
Linker Venus (1-173)
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
43
Dựa vào kết quả so sánh trên hình 3.3 và 3.4, chúng tôi kết luận trình tự gene
KIF2A-GD thu được tương đồng hoàn toàn (99,9 %) với trình tự NM 00844.2 trên
ngân hàng dữ liệu NCBI. Tại vị trí Nucleotide thứ 142 xuất hiện một đột biến A
thành G, tuy nhiên đột biến này không làm thay đổi trình tự amino acid của protein
KIF2A-GD vì cả hai codon GTA và GTG đều mã hóa cho Valine.
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự plasmid pVenus (155-238) KIF2A-GD và
so sánh với trình tự NM 00844.2 trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần
mềm ClustalX.
Linker
Venus (155-238)
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
44
Như vậy, cDNA KIF2A-GD đã được gắn chèn đồng khung vào plasmid
pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1.
Hình 3.5 và 3.6 là kết quả giải trình tự plasmid pVenus (1-173) và pVenus
(155-238) tái tổ hợp có mang đoạn chèn β2-Adaptin-ear. Kết quả so sánh sắp gióng
cột cho thấy cDNA của β2-Adaptin-ear chúng tôi thu nhận hoàn toàn tương đồng
Linker
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự plasmid pVenus (1-173) β2Adaptin-ear và so
sánh với trình tự M34175.1 trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm
ClustalX.
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
45
(99,9 %) với trình tự mang mã số M34175.1 trên ngân hàng gene và đã được gắn
chèn đồng khung.
Khi so sánh trình tự linker (là trình tự nằm giữa gene mục tiêu của chúng tôi
và gene mã hóa cho mảnh N-Venus) của plasmid pVenus (1-173) tái tổ hợp (hình
3.3 và hình 3.5) với trình tự linker của plAasmid pVenus (1-173) N1 [phụ lục],
Hình 3.6. Kết quả giải trình tự plasmid pVenus (155-238) β2Adaptin-ear và
so sánh với trình tự M34175.1trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm
ClustalX.
Linker
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
46
chúng tôi nhận thấy có sự thay đổi ở codon thứ 2 (CCG thành CCT). Vì hai codon
CCG và CCT đều mã hóa cho acid amin Proline nên đột biến này không ảnh hưởng
đến khung dịch mã của linker và mảnh N-Venus.
Tóm lại, chúng tôi đã dòng hóa thành công lần lượt cDNA KIF2A-GD và
β2-Adaptin-ear vào hai vector biểu hiện pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238).
Hai cDNA này được thu nhận chính xác và tạo dòng vào đúng vị mong muốn là gắn
vào đầu 5’của trình tự mã hóa cho protein mảnh N-Venus và mảnh C-Venus thông
qua một linker.
3.2. Kiểm tra sự biểu hiện của các protein và hiệu quả hoạt động của hệ thống
Split Venus.
COS-7 là dòng tế bào nguyên bào sợi thận khỉ xanh Châu Phi mang trình tự
DNA của virus SV40, được sử dụng như là tế bào chủ trong quá trình chuyển gene
vào tế bào động vật [43]. Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi sử dụng phương
pháp chuyển gene tạm thời, plasmid sau khi được chuyển vào trong tế bào sẽ không
sáp nhập vào bộ gene của tế bào chủ mà tồn tại ở dạng episome, có thể tự sao chép
và biểu hiện độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của những gene này ngắn.
Chúng tôi đồng chuyển các plasmid tái tổ hợp nói trên và plasmid pVenus
(1-173); pVenus (155-238) mang gene mã hóa cho protein PIP5KA và PIP5KC661
vào tế bào COS-7 để kiểm tra sự biểu hiện của protein dựa vào tín hiệu huỳnh
quang. Sơ đồ đồng chuyển các plasmid được trình bày ở bảng 2.1 và bảng 2.2
(chương 2-Vật liệu và phương pháp).
3.2.1. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang.
Protein Venus có bước sóng kích thích tối ưu là 515 nm và bước sóng phát ra
tương ứng là 528 nm [32]. Tuy nhiên do điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi
chỉ có thể quan sát tín hiệu huỳnh quang của protein Venus ở bước sóng kích thích
là 488 nm và phát ra ở bước sóng 507 nm. Hai bước sóng này vẫn nằm trong
ngưỡng kích thích và phát ra của protein Venus.
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
47
Các plasmid đồng chuyển pVenus (1-173) và pVenus (155-238) hoạt động
theo nguyên tắc của hệ thống BIFC, nghĩa là tín hiệu huỳnh quang phát ra khi hai
protein dung hợp vào mảnh N và mảnh C của protein Venus tương tác với nhau.
Kết quả hình 3.7 cho thấy vùng hình cầu của protein KIF2A chỉ tương tác với
protein PIP5KA mà không tương tác với protein PIP5KC661. Điều này phù hợp với
kết quả trước đó của nhóm chúng tôi khi sử dụng lai kép hai hệ thống (two-hybrid
system) trên hai protein này (Nakano và cs). Và tương tác này chỉ xảy ra trong môi
trường có bổ sung huyết thanh (FBS 10 %) hoặc có sự hiện diện của protein ARF6
QL (hình 3.7 A1, A3, A4, B1, B3 và B4) [21][30]. Thành phần chính của huyết
thanh là hormone, nhân tố tăng trưởng. Những nhân tố này đã được chứng minh
tham gia vào quá trình hoạt hóa phân tử PIP5K, làm tăng mức độ PIP2 tại màng tế
bào [24]. Protein ARF6 cũng là nhân tố trực tiếp hoạt hóa PIP5K [21]. Như vậy,
chúng tôi có thể kết luận KIF2A-GD chỉ gắn lên protein PIP5KA khi protein này
được hoạt hóa.
Tín hiệu huỳnh quang cũng được ghi nhận khi biểu hiện đồng thời vùng ear
của tiểu phần β2-Adaptin và protein PIP5KC trong tế bào COS-7 (hình 3.8) nhưng
không được ghi nhận trong trường hợp đồng biểu hiện KIF2A-GD và PIP5KC661;
hay β2-Adaptin-ear và PIP5KA (hình 3.7 C và 3.8 C). Như đã nói trên, protein
KIF2A chỉ tương tác với PIP5KA, tiểu phần β2 của AP-2 tương tác đặc hiệu với
PIP5KC661. Vì vậy, kết quả hình 3.7 và 3.8 cho thấy hệ thống hai plasmid pVenus
của chúng tôi hoạt động ổn định và 4 plasmid tái tổ hợp được tạo dòng ở trên được
biểu hiện trong tế bào COS-7.
Ngoài ra, kết quả hình 3.7 và 3.8 cho phép xác định vị trí biểu hiện của
PIP5KA và PIP5KC661. PIP5KA chủ yếu tập trung ở nhân và khu vực quanh nhân,
PIP5KC661 biểu hiện trong nhân và rải rác trong tế bào chất của COS-7. Trường
hợp tế bào COS-7 được chuyển gene mã hóa cho protein ARF6 QL, chúng tôi nhận
thấy có sự thay đổi vị trí biểu hiện của PIP5KA và PIP5KC661, hai protein này tập
trung chủ yếu tại những khu vực gần màng tế bào.
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
48
Hình 3.7. Kết quả tương tác của protein KIF2A-GD và protein PIP5KA trong tế bào COS-7 với các điều kiện khác nhau
A1, A2, A3 và A4: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- KIF2A-GD-(155-238) C1- PIP5KA.
B1, B2, B3 và B4: tế bào được đồng chuyển plasmid (155-238) N1- KIF2A-GD-(1-173) C1- PIP5KA.
C: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- KIF2A-GD-(155-238) C1- PIP5KC661.
A1, A3, B1, B3 và C: hai protein tương tác trong điều kiện có huyết thanh FBS 10 %. A2, A4, B2 và B4: hai protein tương tác trong
điều kiện không có huyết thanh FBS 10 %. A3, A4, B3 và B4: hai protein tương tác trong điều kiện có protein ARF6 QL.
Thanh tỉ lệ kích thước: 5 µm
+
ARF6
QL
A1 A2
A3
B1 B2
B3 B4
C
A4
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
49
Hình 3.8. Kết quả tương tác của protein β2 AP2-ear và protein PIP5KC661 trong tế bào COS-7 với các điều kiện khác nhau
A1, A2, A3 và A4: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- β2 AP2-ear -(155-238) C1- PIP5KC661.
B1, B2, B3 và B4: tế bào được đồng chuyển plasmid (155-238) N1- β2 AP2-ear -(1-173) C1- PIP5K C661.
C: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- β2 AP2-ear -(155-238) C1- PIP5KA.
A1, A3, B1, B3 và C: hai protein tương tác trong điều kiện có huyết thanh FBS 10 %. A2, A4, B2 và B4: hai protein tương tác trong
điều kiện không có huyết thanh FBS 10 %. A3, A4, B3 và B4: hai protein tương tác trong điều kiện có protein ARF6 QL.
Thanh tỉ lệ kích thước: 5 µm.
+
ARF6
QL
A1
A3 A4
A2 B1
B3
B2
B4
C
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
50
3.2.2. Kết quả xác định hiệu quả biểu hiện của các cặp plasmid
Bên cạnh đó, chúng tôi xác định phần trăm (%) tế bào phát huỳnh quang
nhằm so sánh hiệu quả biểu hiện của các cặp plasmid. Đồ thị hình 3.9 cho thấy
trong cùng một điều kiện (trong môi trường có 10 % FBS hoặc có sự hiện diện của
ARF6 QL), trường hợp đồng chuyển plasmid pVenus (1-173) N1-KIF2A-GD và
pVenus (155-238) C1-PIP5KA có số lượng tế bào phát huỳnh quang cao hơn
trường hợp chuyển hai plasmid pVenus (155-238) N1-KIF2A-GD và pVenus (1-
173) C1-PIP5KA.
Chúng tôi thu được kết quả tương tự (hình 3.10) đối với trường hợp biểu
hiện đồng thời protein β2-Adaptin-ear và PIP5KC661 trong tế bào COS-7. Khi có
sự hiện diện của protein ARF6 QL số lượng protein PIP5KA và PIP5KC661 được
hoạt hóa nhiều hơn thể hiện qua phần trăm tế bào phát huỳnh quang.
Hình 3.9. Đồ thị thể hiện phần trăm tế bào phát huỳnh quang khi đồng
chuyển các plasmid mang trình tự mã hóa cho PIP5KA và KIF2A-GD vào
tế bào COS-7
ST: kí hiệu tế bào được nuôi trong môi trường D’MEM 0 % FBS
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
51
Dựa vào kết quả đồ thị 3.9 và 3.10, chúng tôi chọn cặp plasmid tương ứng
sau để xác định PIP5KA và PIP5KC661 tương ứng được hoạt hóa ở tế bào HeLa
clone 3:
3.3. Xác định sự hoạt hóa của PIP5KA và PIP5KC661 trên dòng tế bào HeLa
clone 3.
Chúng tôi tiến hành xác định ảnh hưởng của nhân tố tăng trưởng biểu mô
EGF và protein ARF6 QL đối với sự hoạt hóa PIP5KA, PIP5KC661 cũng như
những biến đổi kiểu hình tương ứng trên dòng tế bào HeLa clone 3.
pVenus(1-173)N1-KIF2A-GD
pVenus(155-238)C1-PIP5KA
và
pVenus(1-173)N1-β2-Adaptin-ear
pVenus(155-238)C1-PIP5KC661
Hình 3.10. Đồ thị thể hiện phần trăm tế bào phát huỳnh quang khi đồng
chuyển các plasmid mang trình tự mã hóa cho PIP5KC661 và β2-Adaptin-
ear vào tế bào COS-7
ST: kí hiệu tế bào được nuôi trong môi trường D’MEM 0 % FBS
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
52
3.3.1. Kết quả biến đổi kiểu hình của tế bào HeLa clone 3 khi được kích thích
bởi nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF.
Nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF đóng vai trò quan trọng trong quá trình
tăng sinh và biệt hóa của tế bào. Khi nhân tố này gắn vào thụ thể tương ứng của nó
(EGFR) trên màng tế bào sẽ khởi động các con đường truyền tín hiệu [7]. Ở tế bào
HeLa khi được kích thích bởi nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF, PIP5KB cùng với
protein ARF6 tham gia vào quá trình tạo nếp gấp trên màng (membrane ruffle) [17].
Protein ARF6 là một protein G, thuộc họ protein ARF. Protein này được hoạt
hóa khi gắn với GTP và bất hoạt khi gắn với GDP. Khi được hoạt hóa bởi nhân tố
trao đổi guanine (GEF), ARF6-GTP trực tiếp hoạt hóa PIP5K, dẫn đến quá trình tạo
protein PIP2, theo sau đó là những biến đổi trên màng tế bào và hoạt động của actin
[21].
Sự di chuyển của tế bào (cell migration) có vai trò quan trọng trong việc tái
tạo mô, đáp ứng viêm, ung thư và di căn. Quá trình này gồm nhiều bước, bắt đầu
với việc hình thành cấu trúc lamellipodia, filopodia, tiếp đến là kết dính các chất
bên trong tế bào và cuối cùng giải phóng các chất này. Khi quá trình di chuyển của
tế bào bị hạn chế do lamellipodia không được tạo ra không hiệu quả, những nếp gấp
trên màng sẽ được hình thành. Những nếp gấp này sau đó tham gia tái sắp xếp lại
actin [4][22].
Để so sánh tác động của nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF đối với PIP5KA
và PIP5KC661, chúng tôi tiến hành đồng chuyển các cặp plasmid trên vào dòng tế
bào HeLa clone 3 kích thích tế bào bằng nhân tố này (100 ng/ml) trong thời gian 5
phút. Sự sắp xếp của F-actin trong tế bào được xác định bằng cách nhuộm tế bào
với Alexa Fluor 568 (Invitrogen)
Kết quả hình 3.11 cho thấy nếp gấp trên màng chỉ được hình thành ở tế bào
biểu hiện PIP5KA mà không có ở tế bào biểu hiện PIP5KC661. Đồng thời PIP5KA
cũng định vị tại những nếp gấp trên màng khi tế bào được kích thích bởi EGF (hình
3.11 – A2). Vị trí biểu hiện của PIP5KC661 và sự sắp xếp actin trong tế bào này
không thay đổi trong trường hợp tế bào được kích thích bởi EGF (hình 3.11 – B2).
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
53
Theo công trình của Doughman và cs (2003), PIP5KA và Rac1 khi biểu hiện đồng
thời cũng cảm ứng hình thành những nếp gấp trên màng tế bào trong nguyên bào
sợi sarcoma xương ở người MG-63 khi có nhân tố tăng trưởng tiểu cầu (platelet-
derived growth - PDGF) kích thích [11].
Trong điều kiện bình thường của tế bào, quá trình hoạt hóa và bất hoạt ARF6
xảy ra thuận nghịch. Khi tế bào HeLa clone 3 được kích thích bởi EGF, protein
ARF6 nội bào được hoạt hóa, tác động đến hoạt động của PIP5KA, quá trình
polymer hóa actin xảy ra và hình thành nếp gấp trên màng tế bào. Nhưng ARF6
cũng có thể bị bất hoạt bởi các protein thủy giải liên kết GTP-ARF6 bên trong tế
bào. Vì vậy, membrane ruffle chỉ được hình thành trong thời gian ngắn [6][17].
Như vậy, chúng tôi có thể kết luận hoạt động của PIP5KA liên quan đến sự
hình thành nếp gấp trên màng khi tế bào nhận được các kích thích, trong khi đó,
hoạt động của protein PIP5KC661 không bị ảnh hưởng.
3.3.2. Kết quả biến đổi kiểu hình của tế bào HeLa clone 3 khi protein ARF6
QL biểu hiện vượt mức.
Protein ARF6 QL được sử dụng trong đề tài này là dạng đột biến của ARF6,
đột biến này kháng lại quá trình thủy giải GTP thành GDP [20]. Tương tự kết quả
trên dòng tế bào COS-7, PIP5KA và PIP5KC661 đều di chuyển đến vị trí gần màng
tế bào chỉ khi có sự hiện diện của protein ARF6 đã được hoạt hóa (ARF6 QL). Kết
quả nhuộm F-actin cũng cho thấy các sợi actin tập trung ngay tại vị trí biểu hiện của
PIP5KA và PIP5KC661 (hình 3.12). Nghiên cứu của Brown và cộng sự (2001) cho
thấy khi đồng chuyển gene mã hóa protein ARF6 QL và gene mã hóa protein PIP2
vào tế bào HeLa, protein PIP2 biểu hiện và tích lũy thành “cụm”, những “cụm” này
được bao phủ bởi actin. Kết quả kiểu hình tương tự ở dòng tế bào COS sau 18 giờ
chuyển gene mã hóa protein ARF6 QL, số lượng và kích thước của các “cụm” PIP2
tăng lên ở thời điểm 40 phút sau đó [6].
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
54
A2
PIP5KA F-actin
PIP5KA F-actin
A1 B1
B2
PIP5KC661
PIP5KC661
F-actin
F-actin
Hình 3.11. Kết quả sắp xếp của actin trong tế bào HeLa clone 3 khi kích thích bởi EGF và mẫu chứng
“PIP5KA”: kí hiệu tế bào HeLa clone 3 được đồng chuyển plasmid (1-173) KIF2A-GD và (155-238) PIP5KA.
“PIP5KC661”: kí hiệu tế bào HeLa clone 3 được đồng chuyển plasmid (1-173) β2-Adaptin-ear và (155-238) PIP5KC661.
“F-actin”: kí hiệu kết quả nhuộm actin của tế bào bằng Alexa Fluor 568. A1 và B1: tế bào không bị kích thích bởi EGF; A2 và B2: tế
bào bị kích thích bởi EGF trong 5 phút. Thanh tỉ lệ kích thước: 10 µm. “ “: vị trí membrane ruffle.
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
55
3.3.2. Kết quả định lượng cường độ huỳnh quang trên dòng tế bào HeLa clone
3.
Để xác định ảnh hưởng của EGF và ARF6QL lên sự hoạt hóa của PIP5KA
và PIP5KC661, chúng tôi sử dụng phần mềm Image J (NIH) để tính toán cường độ
huỳnh quang trên dòng tế bào HeLa clone 3 khi có sự hiện diện của nhân tố tăng
Hình 3.12. Kết quả sắp xếp actin trong tế bào HeLa