Kháng sinh đồ của S. sonnei Cro R

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kháng sinh đồ của S. sonnei CroR Các chủng vi khuẩn S. sonnei có kiểu hình kháng ceftriazone phân lập từ các mẫu bệnh phẩm được tiến hành làm kháng sinh đồ bằng phương pháp khuếch tán đĩa. Kết quả thể hiện trong bảng 3.1 và biểu đồ 3.1. Bảng 3.1 Kháng sinh đồ của vi khuẩn S. sonnei CroR STT Chủng Amp SxT Chl Na Te CN Ofx Cip Gat Cro Caz 1 DE611 R R S S R S S S S R S 2 EG162 R R S R R S S S S R S 3 EG187 R R S S R S S S S R S 4 EG204 R R S R R S S S S R S 5 EG250 R R S R R S S S S R S 6 EG356 R R S R R S S S S R S 7 EG373 R R S S R S S S S R S 8 EG384 R R S R R S S S S R S 9 EG390 R R S R R S S S S R S 10 EG395 R R S R R S S S S R S 11 EG421 R R S R R S S S S R S 12 EG424 R R S R R S S S S R S 13 EG430 R R S R R S S S S R S 14 EG472 R R S R R S S S S R S 15 EG1007 R R S R R S S S S R S 16 EG1008 R R S R R S S S S R S 17 EG1009 R R S R R S S S S R S 18 EG1010 R R S R R S S S S R S 19 EG1011 R R S R R S S S S R S 20 EG1012 R R S R R S S S S R S 21 EG1013 R R S R R S S S S R S Ghi chú: R: Kháng kháng sinh S: Nhạy kháng sinh Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của S. sonnei CroR Ghi chú: Các chữ kháng sinh viết tắt: Amp: Ampicillin Chl: Chloramphenicol Te: Tetracycline Ofx: Ofloxacine Gat: Gatifloxacin Caz: Ceftazidime SxT: Trimethoprim – sulfamethoxazole Na: Nalidixic acid CN: Gentamicin Cip: Ciprofloxacin Cro: Ceftriaxone Các chủng S. sonnei CroR phân lập được vẫn còn nhạy với chloramphenicol, gentamicin, ofloxacine, ciprofloxacin, gatifloxacin, và ceftazidime. Tuy nhiên, tất cả các chủng S. sonnei này đều là vi khuẩn đa kháng thuốc. 100% chủng đa kháng với các kháng sinh thông thường như ampicillin, trimethoprime/sulphamethoxazole và tetracycline, trong số đó có 85,7% (18/21) kháng thêm nalidixic acid (biểu đồ 3.1). Điều này cho thấy tình hình kháng kháng sinh của các chủng Shigella ngày càng nghiêm trọng. Do đó, việc dùng các kháng sinh thông thường hầu như không còn hiệu quả. Tình hình S. sonnei đa kháng thuốc ở Việt Nam đối với các kháng sinh như ampicillin, tetracycline, trimethoprime/sulphamethoxazole cũng tương tự như ở Nhật, Iran, Trung Quốc [8, 9, 25] Tính kháng của Shigella spp. nói chung và S. sonnei nói riêng đối với ceftriaxone đang có khuynh hướng gia tăng trên thế giới và ở Việt Nam. Từ năm 1995 – 1998, vẫn chưa có trường hợp kháng ceftriaxone nào được công bố ở châu Á. Tuy nhiên, từ năm 2001 – 2004, tỷ lệ Shigella CroR là 5% tổng số ca phân lập được ở Hàn Quốc, Đài Loan, Singapore, Việt Nam, Sri Lanka, Thái Lan, Hồng Kông và Philippine [8]. Tại Việt Nam, ca nhiễm Shigella kháng với ceftriaxone đầu tiên được báo cáo từ một bé trai 10 tuổi tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh (HTD) vào tháng 2 năm 2001. Tuy nhiên, từ tháng 6 năm 2006 đến tháng 1 năm 2008, tỷ lệ nhiễm Shigella CroR phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm (tại HTD và bệnh viện Đồng Tháp) là 15,3% (11 ca trong tổng số 72 ca Shigella phân lập được), trong đó S. sonnei chiếm đến 91,7% [28]. Đặc biệt, trong 3 tháng đầu năm 2009, tất cả các Shigella phân lập được từ bệnh phẩm tại HTD đều là S. sonnei và đều kháng với cefriaxone (Hà Vinh, số liệu chưa công bố). Số liệu trên cho thấy việc kháng ceftriaxone của Shigella, đặc biệt là S. sonnei tăng nhanh một cách đáng kể. Tình hình này, cùng với việc Shigella đa kháng thuốc đang gia tăng làm việc chọn lựa kháng sinh dùng trong điều trị Shigella trở nên khó khăn hơn. 3.2 Kiểu hình tạo ESBL của S. sonnei CroR Thử nghiệm khả năng sinh ESBL bằng phương pháp dùng đĩa đôi xác nhận kết quả theo hướng dẫn của WHO. Kết quả ESBL dương tính khi đường kính vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh chứa ceftazidime kết hợp với clavulanic acid và/hoặc đường kính vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh chứa cefotaxime kết hợp với clavulanic acid lớn hơn đường kính vòng vô khuẩn xung quanh đĩa chỉ chứa kháng sinh 5mm. Điều này là do clavulanic acid đã ức chế enzyme ESBL sinh ra bởi vi khuẩn, làm vi khuẩn trở nên nhạy cảm với kháng sinh β-lactam. Cefotaxime / Clavulanic id Cefotaxime / Clavulanic acid Ceftazidime / Clavulanic acid Ceftazidime / Clavulanic acid Ceftazidime Ceftazidime Cefotaxime Cefotaxime B Cefotaxime / Clavulanic acid Ceftazidime / Clavulanic Ceftazidime Cefotaxime A Cefotaxime / Clavulanic acid Ceftazidime / Clavulanic acid Ceftazidime Cefotaxime C D Hình 3.1 Kết quả kiểm tra khả năng tạo ESBL của các chủng Shigella kháng ceftriazone. (A) ESBL dương tính (với cả hai cặp đĩa); (B) ESBL dương tính (với 1 trong hai cặp đĩa); (C) ESBL âm tính (chủng S. sonnei nhạy với tất cả các kháng sinh); (D) ESBL âm tính (S. flexneri kháng với ceftriaxone). Kết quả kiểm tra khả năng sinh enzyme ESBL của các chủng S. sonnei CroR (hình 3.1) cho thấy tất cả các chủng S. sonnei CroR (21/21 chủng) phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm đều sinh enzyme ESBL. Trong đó, 18/21 chủng (85,7%) dương tính với cả hai cặp đĩa kháng sinh (ceftazidime và ceftazidime/clavulanic acid; cefotaxime và cefotaxime/clavulanic acid); 3 chủng còn lại (14,3%) chỉ cho kết quả dương tính với cặp đĩa kháng sinh cefotaxime và cefotaxime/clavulanic acid (bảng 3.2). Kết quả ESBL cho thấy enzyme ESBL của Shigella sonnei có khả năng phân cắt cefotaxime cao hơn ceftazidime (đường kính vòng vô khuẩn xung quanh đĩa ceftazidime cao gấp 2 đến 3 lần so với đường kính vòng vô khuẩn xung quanh đĩa cefotaxime). Các chủng cho kết quả ESBL dương tính với hai cặp đĩa kháng sinh – kháng sinh/chất ức chế (hình 3.1A) phân cắt cefotaxime và ceftazidime tốt hơn những chủng chỉ dương tính với một cặp đĩa kháng sinh – kháng sinh/chất ức chế (hình 3.1B) (thể hiện ở đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn). Ở kiểu hình ESBL dương tính với cả 2 cặp đĩa kháng sinh – kháng sinh/chất ức chế, clavulanic acid đã ức chế enzyme ESBL, làm vi khuẩn trở nên kém hiệu quả trong phân giải cefotaxime cũng như ceftazidime. Ở kiểu hình ESBL chỉ dương tính với 1 cặp đĩa kháng sinh – kháng sinh/chất ức chế, clavulanic acid ức chế enzyme ESBL làm vi khuẩn kém phân giải cefotaxime, nhưng không ảnh hưởng đến sự phân giải ceftazidime (do ESBL của những chủng này phân giải ceftazidime rất kém) (bảng 3.3). Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra khả năng sinh enzyme ESBL của S. sonnei CroR Đường kính vòng vô khuẩn (mm) STT Chủng CAZ/CLA CAZ CTX/CLA CTX Kết quả ESBL 1 DE611 32 28 28 13 Dương tính với 1 cặp đĩa 2 EG162 29 18 30 0 Dương tính với 2 cặp đĩa 3 EG187 30 27 30 13 Dương tính với 1 cặp đĩa 4 EG204 30 19 27 0 Dương tính với 2 cặp đĩa 5 EG250 31 19 23 0 Dương tính với 2 cặp đĩa 6 EG356 32 28 23 9 Dương tính với 1 cặp đĩa 7 EG373 30 18 31 0 Dương tính với 2 cặp đĩa 8 EG384 32 20 24 7 Dương tính với 2 cặp đĩa 9 EG390 32 22 30 10 Dương tính với 2 cặp đĩa 10 EG395 30 20 31 9 Dương tính với 2 cặp đĩa 11 EG421 31 20 31 8 Dương tính với 2 cặp đĩa 12 EG424 31 21 32 9 Dương tính với 2 cặp đĩa 13 EG430 32 21 31 10 Dương tính với 2 cặp đĩa 14 EG472 33 21 30 10 Dương tính với 2 cặp đĩa 15 EG1007 33 22 31 10 Dương tính với 2 cặp đĩa 16 EG1008 33 20 31 8 Dương tính với 2 cặp đĩa 17 EG1009 32 21 31 8 Dương tính với 2 cặp đĩa 18 EG1010 32 21 32 10 Dương tính với 2 cặp đĩa 19 EG1011 30 21 31 8 Dương tính với 2 cặp đĩa 20 EG1012 31 20 31 10 Dương tính với 2 cặp đĩa 21 EG1013 30 19 30 8 Dương tính với 2 cặp đĩa Bảng 3.3 Đường kính vòng vô khuẩn trung bình Kết quả ESBL CAZ/CLA CAZ CTX/CLA CTX Dương tính với 2 cặp đĩa (n = 18) 31,14 mm 20,14 mm 30,03 mm 7,03 mm Dương tính với 1 cặp đĩa (n = 3) 31,33 mm 27,67 mm 27 mm 11,67 mm Ghi chú: Các chữ kháng sinh viết tắt CAZ: Ceftazidime CAZ/CLA: Ceftazidime/Clavulanate CTX: Cefotaxime CTX/CLA: Cefotaxime/Clavulanate 3.3 Plasmid của S. sonnei kháng với ceftriaxone và S. sonnei nhạy với ceftriaxone Từ kiểu hình hoạt động của enzyme ESBL ở các chủng S. sonnei kháng ceftriaxone chúng tôi đặt giả thuyết enzyme ESBL này có thể thuộc họ CTX-M, và gen blaCTX-M mã hóa cho protein này nằm trên plasmid [5, 6, 11]. Vì vậy, chúng tôi đã khảo sát độ tương đồng về kiểu plasmid giữa một số chủng S. sonnei kháng ceftriaxone và một số chủng S. sonnei nhạy với ceftriaxone. Plasmid được tách bằng phương pháp của Kado-Liu. Kết quả tách plasmid thể hiện trong hình 3.2. Hình 3.2 Kết quả điện di các plasmid của 1 số chủng Shigella sonnei. M: chủng E. coli 39R861 (4 plasmid với các kích thước lần lượt là 147 kb, 63 kb, 36 kb và 6 kb); từ EG373 đến EG1009: các chủng S. sonnei kháng ceftriaxone; từ DE115 đến DE1198: các chủng S. sonnei nhạy với ceftriaxone. Tất cả các chủng S. sonnei kháng ceftriaxone được khảo sát đều chứa từ 6 đến 10 plasmid với nhiều kích thước khác nhau, và đều chứa plasmid lớn có kích thước nằm trong khoảng từ 63 kb đến 147 kb. Trong khi đó, 6/9 chủng (66,7%) S. sonnei nhạy cảm với ceftriaxone không chứa plasmid lớn có kích thước nằm 63 kb 147 kb 36 kb 6 kb trong khoảng này. Vì vậy chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng gen kháng ceftriaxone nằm trên plasmid lớn có kích thước trong khoảng từ 63 kb đến 147 kb của S. sonnei. 3.4 Tạo dòng chủng E. coli mang gen kháng ceftriaxone 3.4.1 Cắt plasmid bằng AluI và cắt pUC bằng SmaI Plasmid của S. sonnei CroR phân lập từ các mẫu bệnh phẩm sau khi tách bằng bộ kít của NucleoBond được cắt ngẫu nhiên với enzyme AluI. Phản ứng cắt thành công khi tạo ra được những đoạn DNA có kích thước từ 300 bp đến 12 kb, và không còn plasmid chưa cắt (hình 3.3). Các đoạn DNA có kích thước từ 500 bp đến 2000 bp được tinh chế lại từ gel, và được sử dụng để nối với plasmid pUC19 (sau khi cắt với enzyme SmaI). Vì plasmid pUC19 chỉ có một vị trí cắt của enzyme SmaI, nên sản phẩm cắt được tạo ra là DNA mạch thẳng với kích thước là 2686 bp (hình 3.3, cột 7). Hình 3.3 Sản phẩm cắt plasmid của S. sonnei với enzyme AluI và pUC19 với enzyme SmaI. L: thang 1 kb plus; 1, 4: plasmid của S. sonnei trước khi cắt với enzyme AluI; 2-3, 5-6: plasmid của S. sonnei sau khi cắt với enzyme AluI; 7: pUC19 sau khi cắt với enzymeSmaI. 3.4.2 Tạo dòng chủng E. coli mang gen kháng ceftriaxone Kết quả tạo dòng cho được khuẩn lạc trắng trên đĩa môi trường LB-Amp- X_gal (hình 3.4). Như vậy, phản ứng nối những đoạn DNA plasmid của vi khuẩn sau khi cắt bằng enzyme AluI với pUC19 sau khi cắt bằng enzymeSmaI thành công. Tuy nhiên, trên môi trường LB-CRO không có khuẩn lạc nào mọc được, nghĩa là không tạo dòng được gen chịu trách nhiệm cho tính kháng ceftriaxone của S. sonnei. 2 500 2686 bp Hình 3.4 Khuẩn lạc trên môi trường LB-Amp-X_gal. Khuẩn lạc xanh: không có sản phẩm chèn vào pUC19; khuẩn lạc trắng: có sản phẩm chèn vào pUC19. Tuy tạo dòng gen là một phương pháp sinh học phân tử mang tính chất đột phá trong việc phát hiện một gen chưa biết nhưng phải tạm dừng vì thời gian thực hiện đề tài có hạn. PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho các nhóm gen mã hóa enzyme ESBL được lựa chọn là phương pháp thay thế. 3.5 Kết quả PCR gen mã hóa ESBL Việc kiểm tra khả năng tạo ESBL của các chủng S. sonnei CroR cho thấy, tất cả các chủng S. sonnei kháng ceftriaxone đều có kết quả ESBL dương tính. Điều này cho thấy rằng gen chịu trách nhiệm cho tính kháng ceftriaxone ở S. sonnei là gen mã hóa cho ESBL. Gen mã hóa cho ESBL gồm các nhóm như SHV, TEM, OXA và CTX-M. Tuy nhiên, do ESBL tạo ra bởi S. sonnei kháng ceftriaxone bị ức chế bởi clavulanic acid nên ESBL này không thể là enzyme thuộc họ OXA (đặc trưng bởi tính kháng lại chất ức chế như clavulanic acid) [6]. Vì vậy, chúng tôi chỉ sử dụng 3 cặp mồi đặc hiệu cho các nhóm ESBL thuộc họ SHV, TEM và CTX-M. Trình tự mồi và chương trình chạy PCR được thể hiện trong phần 2.7. Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR (hình 3.5) cho thấy tất cả các chủng S. sonnei CroR đều dương tính với cặp mồi đặc hiệu cho gen thuộc họ CTX-M khi trên gel agarose xuất hiện 1 vạch có kích thước 585 bp. Ơû cặp mồi SHV trên gel agarose xuất hiện một số vạch mờ nhưng không có vạch ở vị trí 593 bp đặc hiệu cho sản phẩm PCR của cặp mồi này. Như vậy, kết quả trên phù hợp với giả thuyết chúng tôi đặt ra ban đầu khi dựa vào đặc điểm của enzyme ESBL do S. sonnei CroR tạo ra (phân giải cefotaxime mạnh hơn ceftazidime, một đặc trưng của enzyme ESBL thuộc họ CTX-M). Hình 3.5 Kết quả điện di với các cặp mồi SHV, TEM và CTX-M. (1) cặp mồi SHV; (2) cặp mồi TEM; (3) cặp mồi CTX-M; L: thang 1kb plus; DE611 – EG1013: chủng S. sonnei kháng ceftriaxone; EG211: chủng S. sonnei nhạy với ceftriaxone; chứng âm: chứa nước thay vì DNA. Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho một số nhóm thuộc họ gen CTX-M như CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-9. Kết quả cho thấy 18/21 chủng (85,7%) dương tính với cặp mồi CTX-M-1 và 3/21 chủng (14,3%) dương tính với cặp mồi CTX-M-9 (hình 3.6). Hình 3.6 Kết quả điện di với các cặp mồi CTX-M-1, CTX-M-2 và CTX-M-9. (1) cặp mồi CTX-M-1; (2) cặp mồi CTX-M-2; (3) cặp mồi CTX-M-9; L: thang 1kb plus; DE611 – EG1013: chủng S. sonnei kháng ceftriaxone; EG211: chủng S. sonnei nhạy với ceftriaxone; chứng âm: chứa nước thay vì DNA. Ở những chủng DE611, EG187 (dương tính với cặp mồi CTX-M-9) và EG162 (dương tính với cặp mồi CTX-M-1), ngoài vạch dương tính với từng cặp mồi như đã nói trên, chúng tôi thấy có thêm 1 vạch mờø có cùng kích thước ở sản phẩm khuếch đại cho cặp mồi CTX-M-1 (chủng DE611 và EG187), và cặp mồi CTX-M-9 (chủng EG162). Để kiểm tra các sản phẩm này có đặc hiệu với các cặp mồi nêu trên hay không, chúng tôi thực hiện việc giải mã trình tự sản phẩm khuếch đại nêu trên. Kết quả cho thấy những tín hiệu không rõ ràng của các trình tự (nhiều tín hiệu của nhiều trình tự khác nhau trong sản phẩm khuếch đại). Như vậy,đây là các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Chúng tôi thấy rằng có sự tương quan giữa kết quả PCR với kết quả ESBL đã thực hiện trước đó (bảng 3.2). Các chủng S. sonnei cho kết quả ESBL dương tính với cả hai cặp đĩa kháng sinh – kháng sinh/chất ức chế có kết quả PCR dương tính với cặp mồi CTX-M-1. Trong khi đó, những chủng S. sonnei có kết quả ESBL chỉ dương tính với một cặp đĩa kháng sinh – kháng sinh/chất ức chế cho kết quả PCR dương tính với cặp mồi CTX-M-9 (bảng 3.4). Bảng 3.4 So sánh kết quả kiểm tra ESBL và PCR của các chủng S. sonnei CroR Số chủng Chủng Kết quả ESBL Kết quả PCR 18 chủng (85,7%) EG162, EG204, EG250, EG373, EG384, EG390, EG395, EG421, EG424, EG430, EG472, EG1007, Dương tính với 2 cặp đĩa kháng sinh CTX-M-1 EG1008, EG1009, EG1010, EG1011, EG1012, EG1013 3 chủng (14,3%) DE611, EG187, EG356 Dương tính với 1 cặp đĩa kháng sinh CTX-M-9 3.6 Trình tự gen mã hóa ESBL Sản phẩm PCR (với cặp mồi CTX-M-1 và CTX-M-9) được giải trình tự và phân tích bằng phần mềm BioEdit và Vector NTI 7.0. Kết quả sau khi phân tích được so sánh với cơ sở dữ liệu của ngân hàng gen NCBI (National Center for Biotechnology Information). Kết quả giải trình tự cho thấy tất cả trình tự của các sản phẩm khuếch đại từ các chủng bằng cặp mồi CTX-M-1 tương đồng 100% với trình tự của gen blaCTX-M-15 (mã số FJ668785.1) (hình 3.7). Trong khi đó, tất cả trình tự sản phẩm khuếch đại từ các chủng bằng cặp mồi CTX-M-9 tương đồng 100% với trình tự của gen blaCTX-M-14 (mã số DQ350884.1) đã công bố trên Ngân hàng Gen NCBI. Hình 3.7 Độ tương đồng về trình tự nucleotide của các sản phẩm khuếch đại với cặp mồi CTX-M-1 Chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt đáng kể giữa hai trình tự gen blaCTX- M-15 và blaCTX-M-14 khi so sánh độ tương đồng của chúng bằng phần mềm Vector NTI 7.0. Độ khác biệt giữa hai gen này là 31,6% (hình 3.8). Hình 3.8 Độ tương đồng về trình tự nucleotide của các sản phẩm khuếch đại với cặp mồi CTX-M-1 (mẫu EG162) và CTX-M-9 (mẫu DE611) Kể từ lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1986 tại Nhật Bản, các enzyme ESBL thuộc họ CTX-M hiện nay đã trở phổ biến trên thế giới, đặc biệt ở một số khu vực như Nam Mỹ, Châu Âu và vùng Đông Á [13, 23, 26]. Các CTX-M này chủ yếu được phát hiện ở các loài E. coli, Klebsiella pneumonia và Salmonella enterica. Hiện nay ở châu Á, CTX-M phổ biến nhất là CTX-M-15 và CTX-M-14. Ở Đông Nam Á, CTX-M mới chỉ được công bố ở Việt Nam (năm 2002), ở Singapore (năm 2004) và ở Thái Lan (năm 2007). Trong đó, CTX-M tại Việt Nam đã được công bố ở loài K. pneumonia là CTX-M-14 và CTX-M-17; tại Singapore là CTX-M-9, CTX-M-11, CTX-M-15, CTX-M-2 và CTX-M-20 ở E. coli và K. pneumonia; tại Thái Lan là CTX-M-9, CTX-M-14 và CTX-M-15 phát hiện ở các loài vi khuẩn E. coli và K. pneumonia [4, 26, 27]. Mặc dù CTX-M ngày càng trở nên phổ biến ở các vi khuẩn đường ruột, nhưng công bố về CTX-M ở Shigella spp. còn rất ít. Phát hiện đầu tiên về CTX- M ở S. sonnei là CTX-M-2 trong chủng phân lập được tại Argentina vào năm 2001 [18]. Cho đến nay, sự hiện diện của CTX-M trên Shigella chỉ được phát hiện ở một số nước như Hàn Quốc, Thổ Nhĩ Kì, Hồng Kông, Trung Quốc, Bangladesh, Ireland và gần đây nhất là Cộng hòa Séc [3, 9, 12, 29, 30]. Tại Việt Nam, chưa có một báo cáo nào về vi khuẩn Shigella spp. mang CTX-M. Như vậy, nghiên cứu này lần đầu tiên chứng minh có sự hiện diện của CTX-M-14 và CTX-M-15 ở Shigella sonnei ở Việt Nam. Ngoài ra, đây cũng là lần đầu tiên công bố có sự hiện diện của enzyme ESBL CTX-M-15 ở Việt Nam, và CTX-M- 15 là ESBL phổ biến trong những chủng S. sonnei CroR phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm tạo HTD và bệnh viện Đồng Tháp. 3.7 Kết quả chuyển plasmid mang gen mã hóa ESBL từ S. sonnei kháng ceftriaxone sang E. coli J53AzR bằng tiếp hợp Plasmid từ S. sonnei kháng ceftriaxone được chuyển sang E. coli J53AzR bằng tiếp hợp. E. coli J53AzR sau khi nhận plasmid được chọn lọc trên môi trường LB-Sodium azide-ceftriaxone (LB-SA-Cro). Các chủng mọc được trên môi trường này được tách chiết plasmid theo phương pháp của Kado-Liu, và so sánh với chủng hoang dại. Kết quả thể hiện trong hình 3.9 Hình 3.9 Các plasmid của chủng E. coli J53AzR tiếp hợp (1) và chủng S. sonnei Cro