Khảo sát ảnh hưởng của Javel và thời gian khửtrùng lên các chồi ngọn và chồi bên cây JCL khi đưa vào nuôi cấy in vitro

Kết quả - Thảo luận  Trang 43 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của Javel và thời gian khử trùng lên các chồi ngọn và chồi bên cây JCL khi đưa vào nuôi cấy in vitro Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Javel và thời gian khử trùng lên các chồi ngọn và chồi bên cây JCL theo thời gian Ngày thứ 7 Ngày thứ 10 Ngày thứ 14 Nghiệm thức (1) (2) (3) (1) (2) (3) (1) (2) (3) J25-10 0 40 40 0 60 60 0 70 70 J25-20 0 60 60 0 80 80 0 90 90 J25-30 0 50 50 0 90 90 0 90 90 J50-10 10 30 20 10 40 30 10 50 40 J50-20 0 0 0 0 0 0 0 40 40 J50-30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 J100-10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 J100-20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 J100-30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (1): Tỉ lệ nhiễm (%) (2): Tỉ lệ nảy chồi (%) (3): Tỉ lệ nảy chồi và không nhiễm (%) Nói chung khi đưa mẫu nuôi cấy của bất kỳ cây trồng nào vào nuôi cấy in vitro phục vụ công tác nghiên cứu đều cần phải khử trùng mẫu. Tuy nhiên, đối với cây JCL, thí nghiệm khử trùng mẫu được đặt thành vấn đề và được đặc biệt quan tâm, vì sau khi cắt mẫu khỏi cây mẹ thì ngay tại vết cắt, nhựa được tiết ra rất nhiều. Chính nhựa này có ảnh hưởng đến độ sống sót của chồi được đưa vào nuôi cấy. Hơn nữa, chất nhựa tạo cơ sở bám dính cho vi khuẩn và nấm nên làm cho việc khử trùng mẫu vô cùng khó khăn. Kết quả - Thảo luận  Trang 44 Kết quả ghi nhận cho thấy, việc sử dụng Javel (natri hypoclorid) trong khử trùng các mẫu chồi non cây JCL mang lại hiệu quả cao. Chỉ có nghiệm thức Javel ở nồng độ 50% (v/v), thời gian khử trùng 10 phút có hiện tượng nhiễm nấm, nhưng với tỉ lệ thấp (10%) so với những cây thân gỗ khác. Điều này cũng có thể còn do nguồn mẫu chồi non trước khi thí nghiệm đã tương đối sạch nấm bệnh. Khử trùng mẫu với nồng độ Javel 25% (v/v) trong thời gian 20-30 phút thích hợp để mẫu sau khử trùng không bị nhiễm và có tỉ lệ nảy chồi cao. 14 ngày 28 ngày Ảnh 3.1: Mẫu chồi bên đã khử trùng bằng Javel 25% (v/v) trong 30 phút nảy chồi khi được nuôi cấy trong điều kiện in vitro Ảnh 3.2: Mẫu bị nhiễm nấm Kết quả - Thảo luận  Trang 45 3.1.2. Sự hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL 3.1.2.1. Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá JCL Qua quá trình khảo sát sơ bộ trên môi trường W không được bổ sung chất ĐHSTTV hoặc được bổ sung một trong các lọai auxin sau: IAA (0,1; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l); IBA (0,1; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l); 2,4-D (0,1; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l) hoặc TDZ (0,1; 0,3; 0,5 và 1,0 mg/l), chúng tôi nhận thấy có những biến đổi rất khác nhau về sự tạo mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL in vitro. Sau 14 ngày nuôi cấy, các mẫu cấy có biểu hiện biến đổi hình thái tạo mô sẹo hoặc không phát triển và hóa nâu, chết dần ở những nghiệm thức có bổ sung auxin khác nhau. Các biến đổi được ghi nhận cho thấy chỉ những mẫu cấy được nuôi trên môi trường W có bổ sung 2,4-D mới có khả năng tạo mô sẹo. Ở các nghiệm thức được bổ sung IAA, IBA, TDZ, hoặc không được bổ sung chất ĐHSTTV, các mẫu cấy đều không đáp ứng, hóa nâu và chết dần sau 14 – 28 ngày nuôi cấy. Để tìm hiểu rõ hơn về ảnh hưởng của auxin lên khả năng hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL, chúng tôi tiếp tục khảo sát các nghiệm thức môi trường có bổ sung 2,4-D và IBA. Ảnh hưởng của 2,4-D và IBA lên khả năng hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL Mẫu cấy được nuôi trong môi trường W có bổ sung riêng lẻ 2,4-D và IBA ở các nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l. Kết quả cho thấy, mẫu cấy là lớp mỏng tế bào lá không có khả năng hình thành mô sẹo trên môi trường W chỉ được bổ sung IBA. Các mẫu cấy đều không đáp ứng, hóa nâu và chết dần sau 21 ngày nuôi cấy. Ảnh hưởng của 2,4-D lên trọng lượng tươi của các mẫu cấy được ghi nhận sau 28 ngày nuôi cấy và được trình bày ở bảng 3.2. Kết quả - Thảo luận  Trang 46 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo sau 28 ngày 2,4-D (mg/l) Nghiệm thức Trọng lượng tươi (mg) % mẫu cấy tạo mô sẹo Biến đổi hình thái sau 28 ngày nuôi cấy 0,1 D0,1 3,95 ± 0,30 0 Mẫu cấy không đáp ứng, dần hóa nâu và chết 0,5 D0,5 4,05 ± 0,39 0 Mẫu cấy không đáp ứng, dần hóa nâu và chết 1,0 D1 22,15 ± 9,97 47,22 ± 5,55 Mẫu cấy tạo khối mô sẹo nhỏ, trắng hơi trong, kết cấu xốp và rời rạc 1,5 D1,5 74,18 ± 16,44 100 Mẫu cấy tạo khối mô sẹo to, màu trắng hơi trong, kết cấu xốp và rời rạc. Phần tiếp xúc với môi trường dần hóa nâu đen Kết quả cho thấy mẫu cấy là lớp mỏng tế bào lá cây JCL có khả năng hình thành mô sẹo trên môi trường W được bổ sung 2,4-D. Tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo và trọng lượng tươi của mô sẹo gia tăng cùng với hàm lượng 2,4-D. So với các nghiệm thức D0,1, D0,5 và D1 thì nghiệm thức D1,5 có sự khác biệt rất rõ về gia tăng trọng lượng tươi của mẫu cấy và tỷ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo. Ghi nhận sự biến đổi hình thái mẫu cấy trên các nghiệm thức môi trường này cho thấy, các mẫu cấy bắt đầu quá trình hình thành mô sẹo sau khỏang 7 – 10 ngày nuôi cấy. Khối mô sẹo hình thành có trạng thái xốp, trắng hơi trong sau 28 ngày nuôi cấy, nuôi cấy tiếp tục sẽ dần hóa nâu và chết sau 56 ngày. 3.1.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp auxin và cytokinin lên sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá JCL 3.1.2.2.1. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4-D và BA lên khả năng hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL Mẫu cấy được nuôi trong môi trường W bổ sung 2,4-D ở nồng độ 0,1 mg/l và BA ở nồng độ 1,0 mg/l. Kết quả sự thay đổi trọng lượng tươi của mẫu cấy và tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo theo thời gian được ghi nhận ở bảng 3.3. Kết quả - Thảo luận  Trang 47 Bảng 3.3: Sự biến đổi hình thái khối mô sẹo theo thời gian trên môi trường W + 0,1 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BA Chỉ tiêu Thời gian (ngày) Trọng lượng tươi (mg) % mẫu cấy tạo mô sẹo Một số biến đổi hình thái 14 46,92 ± 23,59 100 Mẫu cấy phát triển, gia tăng kích thước mô cấy, tạo khối mô sẹo trắng, hơi trong, kết cấu chặt 28 100,50 ± 36,30 100 Phần trên khối mô sẹo chuyển dần sang màu xanh nhạt, kết cấu cứng chắc 56 117,54 ± 23,47 100 Mô sẹo hóa nâu và chết. Phần trên khối mô sẹo mất dần màu xanh và chuyển sang màu trắng hơi vàng, kết cấu trở nên lỏng lẻo; phần dưới hóa nâu đen, kết cấu chặt Ghi nhận sự biến đổi hình thái mẫu cấy trên môi trường này cho thấy các mẫu cấy có phản ứng rất sớm với tổ hợp auxin 2,4-D và cytokinin BA. Quá trình hình thành mô sẹo bắt đầu sau khỏang 7 ngày nuôi cấy, các mẫu cấy có dấu hiệu mất màu xanh. Sau 10 – 14 ngày, sự tăng sinh diễn ra mạnh mẽ. Sau khỏang 28 ngày nuôi, hình thành khối mô sẹo lớn, kết cấu cứng chắc, màu trắng, hơi trong, dần chuyển sang xanh lục nhạt. Nhìn chung, đây là dạng mô sẹo khó có khả năng tái sinh chồi. Sau 56 ngày, bên dưới khối mô sẹo (mặt tiếp xúc trực tiếp với môi trường) xuất hiện vùng hóa nâu đen, phần mô sẹo phía trên mất dần màu xanh, không tạo chồi. Quan sát tiếp tục cho thấy kết cấu khối mô sẹo dần trở nên lỏng lẻo, hóa nâu và chết. Kết quả - Thảo luận  Trang 48 2 tuần 4 tuần Ảnh 3.3: Hình thái mô sẹo trên môi trường W + 0,1 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BA theo thời gian Kết quả - Thảo luận  Trang 49 3.1.2.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA và BA lên khả năng hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL Mẫu cấy được nuôi trong môi trường W có bổ sung IBA ở nồng độ 0,1 mg/l và BA ở nồng độ 1,0 mg/l. Kết quả sự thay đổi trọng lượng tươi của mẫu cấy và tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo theo thời gian được ghi nhận ở bảng 3.4. Bảng 3.4: Sự biến đổi hình thái khối mô sẹo theo thời gian trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA Chỉ tiêu Thời gian (ngày) Trọng lượng tươi (mg) % mẫu cấy tạo mô sẹo Một số biển đổi hình thái 14 13,41 ± 7,71 63,89 ± 5,56 Gia tăng kích thước mô cấy, tạo khối mô sẹo rất nhỏ, màu trắng, xốp 28 22,96 ± 6,56 94,45 ± 5,55 Gia tăng kích thước mô cấy, tạo khối mô sẹo trắng xanh nhạt, dần chuyển sang xanh trắng, kết cấu cứng xốp 56 23,51 ± 5,84 97,22 ± 5,55 Hình thành vùng hóa nâu đen có kết cấu chặt ở mặt tiếp xúc trực tiếp với môi trường; phần mô sẹo phía trên mất dần màu xanh, kết cấu dần trở nên lỏng lẻo, hóa nâu và chết Trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA, mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá JCL cũng có sự thay đổi. Quan sát hình thái bên ngòai và cấu trúc giải phẫu bên trong của mẫu cấy cho thấy sau khỏang 7 – 10 ngày nuôi, bắt đầu có sự tăng sinh tế bào ở vùng tế bào nhu mô của mô thịt lá, khối mô sẹo ban đầu có màu trắng, xốp. Sau 28 ngày, hình thành khối mô sẹo màu trắng xanh, dần chuyển sang xanh trắng, với kết cấu cứng xốp xen lẫn có khả năng tạo chồi. Trong khối mô sẹo là những đám tế bào phân chia mạnh nằm chủ yếu vùng nhu mô thịt lá, và xuất hiện các bó mạch nằm rải rác bên Kết quả - Thảo luận  Trang 50 trong khối mô. Sau 56 ngày, khối mô sẹo cũng hình thành vùng hóa nâu đen có kết cấu chặt ở mặt tiếp xúc trực tiếp với môi trường, phần mô sẹo phía trên mất dần màu xanh. Tiếp tục theo dõi cho thấy kết cấu mô sẹo dần trở nên lỏng lẻo, hóa nâu và chết. Nhìn chung, quá trình hình thành mô sẹo trên môi trường được bổ sung BA (1,0 mg/l) kết hợp với IBA (0,1 mg/l) diễn ra chậm và yếu hơn so với khi kết hợp với 2,4-D (0,1 mg/l); tuy nhiên, đây là dạng mô sẹo có thể có khả năng tái sinh cơ quan cao. Kết quả - Thảo luận  Trang 51 2 tuần 3 tuần 4 tuần Ảnh 3.4: Hình thái mô sẹo trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA theo thời gian Kết quả - Thảo luận  Trang 52 Ảnh 3.5: Cấu trúc giải phẫu mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá ban đầu Kết quả - Thảo luận  Trang 53 Ảnh 3.6: Cấu trúc giải phẫu mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA, sau 1 tuần bắt đầu có sự phân chia tế bào ở vùng nhu mô thịt lá Kết quả - Thảo luận  Trang 54 Ảnh 3.7: Cấu trúc giải phẫu mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA, sau 2 tuần có sự phân chia tế bào ở vùng nhu mô thịt lá, hình thành các khối u nhỏ những tế bào đồng đều phát triển khỏi lớp biểu bì Kết quả - Thảo luận  Trang 55 Ảnh 3.8: Cấu trúc giải phẫu mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA, sau 4 tuần có sự phân chia mạnh tế bào và sự xuất hiện của các bó mạch Kết quả - Thảo luận  Trang 56 3.1.3. Sự tạo chồi từ mô sẹo tế bào lá cây JCL Sau 28 ngày được nuôi trong các môi trường cảm ứng tạo mô sẹo W + 0,1 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BA và W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA, các mẫu cấy tạo sẹo được cấy chuyển sang môi trường W không hoặc có bổ sung BA (1,0; 3,0 hoặc 5,0 mg/l), không có 2,4-D và IBA nhằm kích thích sự tạo chồi. Kết quả cho thấy những mô sẹo được tạo ra trong môi trường được bổ sung 2,4- D và BA không có khả năng tái sinh, hòan tòan không tạo chồi ở tất cả các nghiệm thức. Quan sát hình thái bên ngòai cho thấy, sau 14 ngày nuôi trong môi trường phát sinh chồi, các khối mô sẹo mất dần màu xanh. Sau khỏang 28 ngày, kết cấu mô sẹo trở nên lỏng lẻo, khối mô sẹo dần hóa nâu và chết. Chỉ những mô sẹo hình thành trên môi trường được bổ sung IBA kết hợp với BA là có khả năng tái sinh chồi. Kết quả thí nghiệm bao gồm tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số chồi tái sinh trung bình trên một mẫu cấy được ghi nhận ở bảng 3.5. Kết quả - Thảo luận  Trang 57 Bảng 3.5: Khả năng phát sinh chồi từ nuôi cấy các mô sẹo trên môi trường W có bổ sung BA (1,0; 3,0 và 5,0 mg/l) hoặc không có BA theo thời gian Thời gian Môi trường tái sinh Nghiệm thức % mẫu cấy tạo chồi Số chồi/mẫu cấy W B0 0 0 W + 1,0 mg/l BA B1 13,33 ± 13,33 0,13 ± 0,13 W + 3,0 mg/l BA B3 13,33 ± 13,33 0,13 ± 0,13 14 ngày W + 5,0 mg/l BA B5 0 0 W B0 0 0 W + 1,0 mg/l BA B1 53,33 ± 13,33 4,35 ± 1,20 W + 3,0 mg/l BA B3 46,67 ± 13,33 4,01 ± 1,89 28 ngày W + 5,0 mg/l BA B5 0 0 W B0 0 0 W + 1,0 mg/l BA B1 86,67 ± 13,33 7,80 ± 1,52 W + 3,0 mg/l BA B3 60,00 ± 26,67 5,66 ± 1,04 56 ngày W + 5,0 mg/l BA B5 0 0 Trong bốn nghiệm thức môi trường được dùng để tái sinh, tỷ lệ mô cấy tạo chồi và lượng chồi thu được cao nhất từ môi trường nghiệm thức B1 (W + 1,0 mg/l BA). Môi trường nghiệm thức B0 (W không bổ sung BA) và B5 (W + 5,0 mg/l BA) cho kết quả tái sinh thấp nhất. Trên các môi trường nghiệm thức B0 và B5, các mẫu cấy hòan tòan không đáp ứng. Mô sẹo dần hóa nâu và chết sau khỏang 28 ngày được nuôi trong môi trường này. Trên môi trường nghiệm thức B3, các mô cấy có dấu hiệu đáp ứng. Sau 7 ngày nuôi cấy, có sự tăng sinh tế bào làm kích thước mô cấy tăng lên. Sau 14 – 21 ngày, trên bề mặt mô cấy hình thành vài khối nốt sần. Sau 21 – 28 ngày, mô cấy hình thành các cơ quan chồi. Tuy nhiên, trên môi trường này, tỷ lệ mẫu cấy có khả năng tái sinh chồi và số chồi trên một mẫu cấy thấp hơn so với môi trường nghiệm thức B1. Sau 56 ngày, trung bình đạt khỏang 60,00 ± 26,67% mô cấy tạo chồi, số chồi tái sinh trên một mẫu cấy là 5,66 ± 1,04 chồi. Những mô cấy không tái sinh dần bị mất màu xanh, hóa nâu và chết. Kết quả - Thảo luận  Trang 58 Trên môi trường nghiệm thức B1, sự đáp ứng của các mô cấy thể hiện rất rõ. Sau 7 ngày nuôi cấy, mô cấy là những mô sẹo tăng sinh mạnh; và sau 14 – 21 ngày tạo nên một khối mô dày với nhiều nốt sần trên bề mặt mô cấy có cấu trúc như những sơ khởi chồi. Sau 28 – 35 ngày nuôi cấy, trên bề mặt các nốt sần xuất hiện các chồi; trung bình có khỏang 86,67 ± 13,33% mô cấy tạo chồi với 7,80 ± 1,52 chồi / mẫu cấy sau 56 ngày. Cấu trúc giải phẫu của mẫu cấy sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường này rất phức tạp, có sự phân chia mạnh ở các nốt sần của vùng tế bào ở bề mặt trên mẫu cấy và rất nhiều bó mạch nằm rải rác bên trong, bề mặt nốt sần hình thành cấu trúc sơ khởi chồi. Kết quả - Thảo luận  Trang 59 Ảnh 3.9: Cụm chồi hình thành ở mẫu cấy trên môi trường W + 1,0 mg/l BA sau 8 tuần nuôi cấy Ảnh 3.10: Cụm chồi phát triển ở mẫu cấy trên môi trường W + 1,0 mg/l BA sau 10 tuần nuôi cấy Ảnh 3.11: Chồi phát triển trên môi trường W + 1,0 mg/l BA sau 16 tuần nuôi cấy Kết quả - Thảo luận  Trang 60 Ảnh 3.12: Sự biệt hóa một nốt mạch từ tế bào nhu mô Kết quả - Thảo luận  Trang 61 Kết quả - Thảo luận  Trang 62 Ảnh 3.13: Phát sinh chồi ở mô cấy trên môi trường W + 1,0 mg/l BA, sau 3 tuần có sự hình thành phát thể chồi, tế bào nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân to Kết quả - Thảo luận  Trang 63 3.1.4. Sự tạo rễ từ mô sẹo tế bào lá cây JCL Các mô sẹo hình thành trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA sau khỏang 38 – 42 ngày được cấy chuyển sang môi trường W không có chất ĐHSTTV hoặc có bổ sung riêng lẻ IBA (0,5; 1,0; 3,0 và 5,0 mg/l) hoặc NAA (0,5; 1,0; 2,0 và 3,0 mg/l) nhằm kích thích sự tạo rễ. Kết quả cho thấy các khối mô sẹo chỉ có khả năng phát sinh rễ trong môi trường được bổ sung NAA. Kết quả thí nghiệm bao gồm tỷ lệ % mẫu cấy hình thành rễ, số rễ tái sinh trung bình trên một mẫu và chiều dài trung bình của rễ được ghi nhận ở bảng 3.6. Các mẫu cấy hòan tòan không đáp ứng trên các môi trường không được bổ sung chất ĐHSTTV hoặc được bổ sung IBA, mô sẹo dần hóa nâu và chết sau 14 – 28 ngày. Bảng 3.6: Khả năng phát sinh rễ từ nuôi cấy các mô sẹo trên môi trường W không có chất ĐHSTTV hoặc có bổ sung riêng lẻ NAA (0,5; 1,0; 2,0 và 3,0 mg/l) hoặc IBA (0,5; 1,0; 3,0 và 5,0 mg/l) sau 28 ngày Môi trường tái sinh Nghiệm thức % mẫu cấy tạo rễ Số rễ/mẫu cấy Chiều dài rễ (mm) W N0I0 0 0 0 0,5 mg/l N0,5 66,67 ± 2,45 4,10 ± 1,21 7,52 ± 1,86 1,0 mg/l N1 100 8,23 ± 1,75 11,9 ± 2,05 2,0 mg/l N2 100 5,41 ± 1,34 8,30 ± 1,90 W + NAA 3,0 mg/l N3 100 6,56 ± 0,87 7,43 ± 2,11 0,5 mg/l I0,5 0 0 0 1,0 mg/l I1 0 0 0 3,0 mg/l I3 0 0 0 W + IBA 5,0 mg/l I5 0 0 0 Kết quả ghi nhận cho thấy, sau khỏang 10 ngày nuôi cấy trên môi trường tạo rễ được bổ sung NAA, mẫu cấy là các mô sẹo dần phát triển thành các khối mô lớn, kết cấu chặt, màu trắng xanh lục nhạt. Sau khỏang 21 ngày, các sơ khởi rễ hình thành trên các khối mô này chuyển sang giai đọan kéo dài sơ khởi rễ. Rễ được tạo ra có kích thước lớn, nằm phía dưới bề mặt môi trường. Kết quả - Thảo luận  Trang 64 Trong bốn nghiệm thức môi trường được dùng để tái sinh rễ có bổ sung NAA, tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ, số lượng rễ trung bình trên một mẫu cấy và chiều dài trung bình của rễ đạt cao nhất ở môi trường nghiệm thức N1 (W + 1,0 mg/l NAA). Môi trường nghiệm thức N0,5 (W + 0,5 mg/l NAA) cho kết quả tái sinh thấp nhất (bảng 3.6). Kết quả - Thảo luận  Trang 65 Ảnh 3.14: Rễ hình thành và phát triển ở mô cấy trên môi trường W + 1,0 mg/l NAA sau 4 tuần nuôi cấy Kết quả - Thảo luận  Trang 66 Ảnh 3.15: Cấu trúc giải phẫu rễ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường W + 1,0mg/l NAA Kết quả - Thảo luận  Trang 67 3.1.5. Khảo sát họat tính các chất ĐHSTTV trong mẫu cấy ở các thí nghiệm nghiên cứu sự phát sinh hình thái từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL Các mô cấy lớp mỏng tế bào lá JCL tại các thời điểm nuôi cấy được đem ly trích, cô lập và sinh trắc nghiệm dịch trích để đo hàm lượng các chất ĐHSTTV nội sinh trong mẫu nuôi cấy. 3.1.5.1. Hàm lượng các chất ĐHSTTV trong mô cấy lớp mỏng tế bào lá JCL theo thời gian trên môi trường tạo mô sẹo W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA Tiến hành sinh trắc nghiệm họat tính tổng cộng của các chất ĐHSTTV nội sinh trong mẫu cấy lớp mỏng lá cây JCL trên môi trường tạo mô sẹo ở các thời điểm T0 (mẫu cấy ban đầu), T1 (sau 14 ngày nuôi cấy), T2 ( sau 28 ngày nuôi cấy), T3 (sau 56 ngày nuôi cấy), thu nhận được kết quả theo bảng 3.7. Bảng 3.7: Họat tính tổng cộng của các chất ĐHSTTV nội sinh trong mẫu cấy theo thời gian trên môi trường tạo mô sẹo W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA Họat tính chất ĐHSTTV nội sinh (mg/l) Chất ĐHSTTV T0 T1 T2 T3 Auxin 1,59 ± 0,07 2,02 ± 0,16 3,01 ± 0,29 0,75 ± 0,04 Cytokinin 0,42 ± 0,08 0,59 ± 0,10 1,27 ± 0,20 0,13 ± 0,03 Acid abcisic 0,37 ± 0,05 0,68 ± 0,04 0,50 ± 0,11 1,04 ± 0,09 Giberelin 2,06 ± 0,30 0,57 ± 0,10 1,98 ± 0,15 0 Kết quả - Thảo luận  Trang 68 Hình 3.1: Họat tính các chất ĐHSTTV nội sinh trong mô cấy lớp mỏng tế bào lá JCL theo thời gian trên môi trường tạo sẹo W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA Kết quả cho thấy: Hàm lượng auxin nội sinh tổng số tăng dần theo thời gian nuôi cấy từ thời điểm T0 (1,59 ± 0,07 mg/l) đến thời điểm T2 (3,01 ± 0,29 mg/l), sau đó lại giảm xuống khi mô cấy giảm sự phát triển về sinh khối và dần hóa nâu ở thời điểm T3 (0,75 ± 0,04 mg/l). Cùng với auxin, cytokinin nội sinh tổng số cũng tăng dần theo thời gian từ thời điểm T0 (0,42 ± 0,08 mg/l) đến thời điểm T2 (1,27 ± 0,20 mg/l) và sau đó giảm dần đến hàm lượng rất thấp ở thời điểm T3 (0,13 ± 0,03 mg/l). Qua kết quả ở bảng 3.7, chúng tôi cũng ghi nhận tỷ lệ auxin/cytokinin trong mẫu cấy luôn lớn hơn 1 trong suốt thời gian nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo. 3.1.5.2. Hàm lượng các chất ĐHSTTV trong mô cấy lớp mỏng tế bào lá JCL theo thời gian trên môi trường phát sinh chồi W + 1,0 mg/l BA Tiến hành sinh trắc nghiệm các chất ĐHSTTV nội sinh trong mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL tại các thời điểm T2-0 (mẫu cấy ban đầu, sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA), T2-1 (sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi W + 1,0 mg/l BA) và T2-2 (sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi W + 1,0 mg/l BA), thu nhận được kết quả theo bảng 3.8. Kết quả - Thảo luận  Trang 69 Bảng 3.8: Họat tính tổng cộng của các chất ĐHSTTV nội sinh trong mẫu cấy theo thời gian trên môi trường tái sinh chồi W + 1,0 mg/l BA Họat tính chất ĐHSTTV nội sinh (mg/l) Chất ĐHSTTV T2-0 T2-1 T2-2 Auxin 3,01 ± 0,29 1,85 ± 0,17 1,09 ± 0,15 Cytokinin 1,27 ± 0,20 2,18 ± 0,23 2,74 ± 0,30 Acid abcisic 0,50 ± 0,11 0,52 ± 0,07 0,37 ± 0,24 Giberelin 1,98 ± 0,15 1,04 ± 0,16 1,29 ± 0,13 Hình 3.2: Họat tính các chất ĐHSTTV nội sinh trong mô cấy theo thời gian trên môi trường tạo chồi W + 1,0 mg/l BA Kết quả ghi nhận cho thấy: Hàm lượng auxin nội sinh tổng cộng tr