Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme phytase từ dòng nấm nội sinh Penicillium oxalicum HNC12-76 của cây ngải bún (Auttum crosscus)

681 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PHYTASE TỪ DÒNG NẤM NỘI SINH Penicillium oxalicum HNC12-76 CỦA CÂY NGẢI BÚN (Auttum crosscus) Nguyễn Phạm Tuấn, Nguyễn Công Kha, Nguyễn Hoài Vững, Huỳnh Cảm Thủy Trang 1 , Nguyễn Ngọc Giàu, Ngô Văn Chúng, Nguyễn Phạm Tú, Khƣu Minh Hiện Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang, tỉnh An Giang * Email: ngphamtuan1983@gmail.com TÓM TẮT Nghiên cứu ―Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme phytase từ dòng nấm nội sinh Penicillium oxalicum HNC12-76 của cây Ngải bún (Auttum crosscus)‖ được thực hiện nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme phytase từ nấm P. oxalicum như nguồn cơ chất, pH môi trường, nguồn carbon bổ sung và nguồn nitrogen bổ sung. Hoạt lực enzyme phytase được xác định bằng cách đo lường phosphate vô cơ. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dòng nấm P. oxalicum sinh enzyme phytase cao nhất dưới các điều kiện như cơ chất (cám bắp), pH (pH = 7), nguồn carbon (glucose 20 g/L) và nguồn nitrogen (peptone 5 g/L) sau 7 ngày lên men, với hoạt lực enzyme phytase là 7,98 U/g. Kết quả nghiên cứu góp phần tạo nguồn ban đầu cho quá trình tổng hợp enzyme theo phương pháp sinh học và ứng dụng trong các lĩnh vực nuôi trồng thủy sản và chăn nuôi. Từ khóa: Cơ chất, carbon, nitrogen, phytase, Penicillium oxalicum. 1. GIỚI THIỆU Phytase là enzyme làm giảm hiệu lực tính kháng dưỡng của thức ăn có hàm lượng phytate cao. Phytase hiện diện trong tự nhiên, từ vi sinh vật, thực vật cũng như một số mô động vật. Chẳng hạn như phytase được phân lập từ thực vật, vi khuẩn và nấm (Pasamontes et al., 1997) [1]. Phytase có thể làm tăng hấp thụ Phosphate trong cơ thể vật nuôi thêm 60% và được dùng như là chất bổ sung bắt buộc cho thức ăn chăn nuôi ở châu Âu, Đông Nam Á, Hàn Quốc,.. để giảm tác hại đến môi trường do Phosphate từ phân vật nuôi thải ra. Theo Furuya et al. (2001) [2], việc sử dụng phytase trong khẩu phần thức ăn nhằm tăng calcium và phosphor hữu dụng, cải thiện tốc độ tăng trưởng và tăng hiệu quả sử dụng thức ăn. Enzyme phytase từ các vi sinh vật với hàm lượng bổ sung hoạt độ là 1000 UI trong 1 kg thức ăn mang lại kết quả trong việc tăng trưởng và sử dụng các chất khoáng tương tự với việc sử dụng các khẩu phần thức ăn từ thực vật bổ sung phosphor vô cơ (Liebert và Portz, 2005) [3]. Những năm trở lại đây, nguồn nấm và vi khuẩn nội sinh được quan tâm chú ý và nghiên cứu, đặc biệt là các dòng nội sinh từ các cây dược liệu. Nấm Penicillium oxalicum là một trong những nguồn tiềm năng sản xuất enzyme phytase. Quá trình sản xuất enzyme phytase từ nấm chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau. Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu ―Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme phytase từ dòng nấm nội sinh Penicillium oxalicum HNC12-76 của cây Ngải bún (Auttum crosscus)‖ được thực hiện nhằm xác định các thông số thích hợp cho quá trình sản xuất enzyme phytase từ dòng nấm nội sinh bằng phương pháp lên men bán rắn và góp phần tạo nguồn nguyên liệu cho quá trình sản xuất các sản phẩm có khả năng ứng dụng trong chăn nuôi và thủy sản. 682 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Dòng nấm P. oxalicum HNC12-76 lưu giữ phòng thí nghiệm của Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang. Hóa chất và thiết bị: acid trichloroacetic cân phân tích, máy đo quang phổ, 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Dòng nấm nội sinh được nhân sinh khối trên môi trường của Awad et al. (2014) [4], với thành phần (g/100 mL) là KCl 0,05g; MgSO4 0,5 g; NH4NO3 0,05 g; MnSO4 0,01 g; CaCl2 0,5 g; FeSO4 0,001 g; Yeast extract 0,1 g và Soya bean meal 10 g (g/100 mL) và điều chỉnh về pH = 6. Ủ điều kiện nhiệt độ phòng và lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian từ 5 ngày. 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất đến quá trình sinh enzyme phytase Chuẩn bị môi trường lên men bán rắn là môi trường gồm sucrose 20 g/L; MgSO4 0,5 g/L; KH2PO4 1 g/L và yeast extract 5 g/L, điều chỉnh về pH = 6. Chuẩn bị 20 g cơ chất lên men khác nhau (rơm, trấu, gạo, cám bắp, gạo và cám bắp) và bổ sung 25 mL môi trường lên men (ẩm cơ chất 60%), hấp thanh trùng và để nguội. Tiến hành chủng 10 mL dung dịch nhân sinh khối nấm vào các keo thí nghiệm. Các keo nấm được ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày. Hoạt lực enzyme phytase được xác định theo phương pháp của Awad et al. (2014) [4]: các mẫu lên men bán rắn được ly trích với dung dịch đệm (làm lạnh ở điều kiện 4°C) (20 mL nước/g chất nền), trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó, tiến hành ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/20 phút ở điều kiện nhiệt độ 4°C, thu phần dịch, phần dịch được sử dụng cho phân tích hoạt lực enzyme. Hoạt lực enzyme phytase được xác định bằng cách đo lường phosphate vô cơ. Hỗn hợp phản ứng bao gồm 0,9 mL dung dịch đệm acetate (0,2 M, pH = 5,5) chứa 1 mM phytate và 0,1 mL dung dịch enzyme thô. Sau khi ủ trong 30 phút ở điều kiện nhiệt độ 370C, phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 1 mL trichloroacetic acid 10%. Một đơn vị phytase được định nghĩa là lượng enzyme giải phóng 1 µmol phospho vô cơ/mL/phút theo các điều kiện thí nghiệm. Hoạt lực enzyme phytase được xác định với đơn vị là U/g cơ chất. 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh enzyme phytase Chuẩn bị môi trường lên men bao gồm cơ chất 20 g (cám bắp) và 25 mL môi trường gồm sucrose 20 g/L; MgSO4 0,5 g/L; KH2PO4 1 g/L và yeast extract 5 g/L, điều chỉnh về pH khác nhau (5-9), hấp thanh trùng và để nguội. Tiến hành chủng 10 mL dung dịch nhân sinh khối nấm vào các keo thí nghiệm. Các keo nấm được ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày. 2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon đến quá trình sinh enzyme phytase Chuẩn bị môi trường lên men bao gồm cơ chất 20 g (cám bắp) và 25 mL môi trường gồm MgSO4 0,5 g/L; KH2PO4 1 g/L và yeast extract 5 g/L, điều chỉnh về pH = 7, bổ sung nguồn carbon khác nhau (glucose, sucrose, D-mantose, dextrose và đối chứng) (20 g/L), hấp thanh trùng và để nguội. Tiến hành chủng 10 mL dung dịch nhân sinh khối nấm vào các keo thí nghiệm. Các keo nấm được ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày. 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến quá trình sinh enzyme phytase Chuẩn bị môi trường lên men bao gồm cơ chất 20 g (cám bắp) và 25 mL môi trường gồm glucose 20 g/L; MgSO4 0,5 g/L; KH2PO4 1 g/L và nguồn nitrogen khác nhau (malt, yeast, beef, peptone, NH4NO3 và đối 683 chứng), điều chỉnh về pH = 7, hấp thanh trùng và để nguội. Tiến hành chủng 10 mL dung dịch nhân sinh khối nấm vào các keo thí nghiệm. Các keo nấm được ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày. 2.3. Phƣơng pháp thống kê Các số liệu của thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel. Thống kê bằng phần mềm Statgraphics 16.0. Kiểm tra sự khác biệt giữa các giá trị trung bình theo phép thử Duncan và LSD. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hƣởng của cơ chất đến quá trình sinh enzyme phytase Trong quá trình lên men bán rắn, việc lựa chọn chất nền phù hợp đóng vai trò quan trọng (Pandey, 1992) [5]. Sự hình thành sản phẩm trực tiếp phụ thuộc vào sự tăng trưởng của sinh vật, do chất nền cung cấp một số chất dinh dưỡng cần thiết cho các vi sinh vật phát triển bên cạnh các nhu cầu về nguồn carbon, nitrogen, muối khoáng,... Chủng Penicillium oxalicum phát triển trên các cơ chất khác nhau có khả năng sinh hoạt lực enzyme phytase khác nhau và khác biệt có ý nghĩa ở mức độ 5% (Hình 1). Hoạt lực enzyme phytase thể hiện cao nhất ở nguồn cơ chất là cám bắp và đạt hoạt lực enzyme phytase là 2,14 U/g; kế đến là nguồn cơ chất gạo và hỗn hợp gạo và cám bắp, hoạt lực enzyme phytase đạt lần lượt là 0,82 và 0,74 U/g; thấp nhất là rơm với hoạt lực enzyme phytase là 0,15 U/g. Kết quả nghiên cứu tương tự của Kumari et al. (2016) [6] và Awad et al. (2014) [4] cho rằng, nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình lên men sản xuất enzyme phytase đạt cao nhất từ nấm mốc Sporotrichum thermophile và nấm Penicillium purpurogenum GE1 là cám bắp với hoạt lực enzyme phytase lần lượt là 1890 U/g (bioreactor) và 40/U/g. Hình 1. Ảnh hưởng của cơ chất lên men đến quá trình sản xuất enzyme phytase. 3.2. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình sinh enzyme phytase Vohra và Satyanarayana (2003) [8] cho rằng, các yếu tố vật lý như pH, nhiệt độ, oxygen hòa tan và áp suất là những thông số vật lý quan trọng nhất ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng của sinh vật và sinh tổng hợp các chất chuyển hóa. Phytase từ nấm Penicillium oxalicum hoạt động mạnh ở môi trường trong khoảng pH = 6,0-8,0 và đạt giá trị tối ưu tại pH = 7 (Hình 2). Hoạt lực enzyme phytase thể hiện cao nhất ở pH = 7 và đạt hoạt lực enzyme phytase là 3,88 U/g; kế đến là pH = 6 và pH = 8, hoạt lực enzyme phytase đạt lần lượt là 2,83 và 2,69 U/g; thấp nhất là pH = 5 với hoạt lực enzyme phytase là 0,93 U/g. 0.15c 0.46bc 0.82b 2.14a 0.74b 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Rơm Trấu Gạo Cám bắp Gạo và cám bắp H o ạ t tí n h e n z y m e p h y ta s e ( U /g ) Cơ chất 684 Hình 2. Ảnh hưởng của pH lên men đến quá trình sản xuất enzyme phytase. Kết quả pH tối ưu tương tự với nghiên cứu của Ramandeep et al. (2017) [9], cho rằng giá trị pH = 7 thích hợp cho sự sản xuất enzyme phytase của nấm Penicillium oxalicum EUFR-3 với hoạt độ đạt 12,8 U/g. Mặc khác, kết quả này khác với hầu hết các nghiên cứu đã tham khảo, phytase ở các loài nấm khác như A. niger có 2 giá trị tối ưu ở khoảng pH từ pH = 2-2,5 và pH = 5,0-5,5. Sự khác biệt này là do loại nấm sản xuất và môi trường dinh dưỡng. Đồng thời, khoảng pH thích hợp cho hoạt động của enzyme phytase trong khoảng acid phù hợp với điều kiện tiêu hóa trong dạ dày (pH= 2,0-4,0) và ruột non (pH = 4,0-6,0) của động vật nên giúp tăng hiệu quả bổ sung trong thức ăn gia súc (Casey và Walsh, 2002) [10]. Howson và Davis (1983) [11], khoảng pH bền của phytase là từ 1,8-8,0. Nhưng kết quả này thấp hơn so với kết quả của Kim et al. (1998) [12] phytase từ B. subtilis có khoảng pH bền là từ 4,0-8,0. 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến quá trình sinh enzyme phytase Nguồn carbon có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ vi sinh vật. Hoạt lực enzyme phytase từ nấm Penicillium oxalicum chịu ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau như malt, yeast extract, peptone, beef extract, NH4NO3 (Hình 3) (Hình 3). Hoạt lực enzyme phytase thể hiện cao nhất ở nguồn carbon là glucose và đạt hoạt lực enzyme phytase 5,59 U/g; kế đến là nguồn carbon sucrose và lactose, hoạt lực enzyme phytase đạt lần lượt là 4,5 và 4,68 U/g; thấp nhất là không bổ sung nguồn carbon với hoạt lực enzyme phytase là 2,42 U/g. Nguyên nhân là khi hàm lượng carbon cao quá sẽ trở nên dư thừa và ức chế quá trình sinh phytase. Kết quả tương tự nghiên cứu củaVats và Banerjee (2002) [7] cho răng, nấm Aspergillus niger sinh enzyme phytase cao nhất khi sử dụng nguồn carbon là glucose. Hình 3. Ảnh hưởng của nguồn carbon khác nhau đến quá trình sản xuất enzyme phytase. 0.93d 2.83b 3.88a 2.69b 1.91c 0 1 2 3 4 5 5 6 7 8 9 H à m l ƣ ợ n g e n z y m e p h y ta se ( U /g ) pH 2.42c 5.59a 4.5b 2.54c 4.68b 0 1 2 3 4 5 6 đối chứng glucose sucrose D-Mantose lactose H o ạ t tí n h e n z y m e p h y ta se ( U /g ) Nguồn carbon 685 3.4. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến quá trình quá trình sinh enzyme phytase Hình 4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen khác nhau đến quá trình sản xuất enzyme phytase. Nguồn nitơ có sự ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ nấm P.oxalicum và khác biệt có ý nghĩa so với các nguồn nitơ khác (Hình 4). Hoạt lực enzyme phytase thể hiện cao nhất ở nguồn nitrogen là peptone và đạt hoạt lực enzyme phytase 7,98 U/g; kế đến là nguồn nitrogen NH4 và beef, hoạt lực enzyme phytase đạt lần lượt là 5,4 và 4,96 U/g; thấp nhất là không bổ sung nguồn nitrogen với hoạt lực enzyme phytase là 0,93 U/g. Kết quả nguồn nitrogen tối ưu tương tự với Ramandeep et al. (2017) [9], cho rằng giá trị nguồn nitrogen là peptone thích hợp cho sự sản xuất enzyme phytase của nấm Penicillium oxalicum EUFR-3 với hoạt độ đạt 12,8 U/g. Kết quả thí nghiệm này khác so với nghiên cứu của Vats và Banerjee (2002) [7], nguồn nitơ vô cơ có tác động giúp vi sinh vật tăng sinh khối và cho hoạt lực cao hơn nguồn nitơ hữu cơ. Điều này có thể là do đối với chủng Penicillium oxalicum nguồn nitơ hữu cơ có tác dụng tăng sinh khối và nguồn nitơ vô cơ có thể ảnh hưởng nhiều đến quá trình sinh tổng hợp phytase. 4. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã xác định các thông số cho quá trình sản xuất enzyme phytase từ dòng nấm nội sinh Penicillium oxalicum HNC12-76. Dòng nấm Penicillium oxalicum sinh enzyme phytase cao nhất dưới các điều kiện như cơ chất (cám bắp), pH (pH = 7), nguồn carbon (glucose) và nguồn nitrogen (peptone) sau 7 ngày lên men. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, nguồn nấm nội sinh cây ngải bún là nguồn cung cấp enzyme phong phú và tiềm năng cho việc sản xuất các sản phẩm enzyme ứng dụng trong thực tế. 5. LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn các thành viên của Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang và Sở Khoa học và Công nghệ An Giang đã tạo điều kiện và hỗ trợ để thực hiện nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Pasamontes, L., Haiker, M., Wyss, M., Loon, P (1997) Gene cloning, purification and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigates Appl Environ Micorbiol 63: 1696-1700. [2] Furuya W. M., Goncalves G. S., Rossetto V., Furuya B., Hayashi C (2001) Phytase as feeding for Nile tilapia (Oreochromis niloticus): performance and digestibility. Rev Brazil Zootech 30 (3):924- 929. 3.51d 4.83c 5.4b 4.96c 7.98a 3.3d 0 2 4 6 8 10 Malt Yeast NH₄NO₃ Beef Peptone đối chứng H o ạ t tí n h e n z y m e p h y ta se ( U /g ) Nguồn nitrogen 686 [3] Liebert, F. and Portz, L. (2005) Nutrient utilization and Nile tilapia Oreochromis niloticus fed plant based low phosphorus diets supplemented with graded levels of different sources of microbial phytase. Aquaculture, 248, 111-119. [4] Awad GE, Helal MM, Danial EN, Esawy MA (2014) Optimization of phytase production by Penicillium purpurogenum GE1 under solid state fermentation by using Box–Behnken design. Saudi J Biol Sci 21(1):81-88. [5] Pandey A (1992) Recent developments in solid state fermentation. Process Biochem, 27: 109-116. [6] Kumari A, Satyanarayana T, Singh B (2016) Mixed Substrate Fermentation for Enhanced Phytase Production by Thermophilic Mould Sporotrichum thermophile and Its Application in Beneficiation of Poultry Feed. Appl Biochem Biotechnol. 178 (1):197-210 [7] Vats P, Banerjee UC (2002). Studies on the production of phytase by a newly isolated strain of Aspergillus niger var teigham obtained from rotten wood-logs. Process Biochem. 38: 211-217. [8] Vohra, A. and Satyanarayana, T (2003) Phytases: Microbial Sources, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications. Critical Reviews in Biotechnology, 23: 29-60. [9] Ramandeep Kaur, Abhishake Saxena, Punesh sangwan, Ajar nath yadav, Vinod kumar, Harcharan Singh Dhaliwal (2014) Production and characterization of a neutral phytase of Penicillium oxalicum EUFR-3 isolated from Himalayan region. Nusantara Bioscience 9 (1): 68-76. [10] Casey A, and Walsh G (2002) Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus nigerATCC 9142. Bioresour Technol. 2002, 86:183-188. [11] Howson, S.J. and Davis, R.P (1983) Production of phytate-hydrolyzing enzyme by some fungi. Enzyme and Microbial Technology, 5: 377-382. [12] Kim YO, Kim HK, Bae KS, Yu JH, Oh TK (1998) Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp. DS11. Enzyme Microb Technol. 22:2-7.