Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 bằng phương pháp lên men chìm

Kỷ yếu Hội nghị: Nghiên cứu cơ bản trong “Khoa học Trái đất và Môi trường” DOI: 10.15625/vap.2019.000222 632 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SR3 BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM Nguyễn Phạm Tuấn1, Bằng Hồng Lam2, Nguyễn Công Kha1, Nguyễn Hoài Vững1, Nguyễn Phạm Tú1 và Huỳnh Cảm Thủy Trang1 1 Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang, Email: ngphamtuan1983@gmail.com 2Đại học An Giang, Email: bhlam@agu.edu.vn TÓM TẮT Prodigiosin là một sắc tố màu đỏ và được ứng dụng phong phú như kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, chống ung thư, ức chế miễn dịch và bảo vệ trước tác động của tia UV và có khả năng tiêu diệt côn trùng, Nghiên cứu “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 bằng phương pháp lên men chìm” được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 bằng phương pháp lên men chìm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, vi khuẩn Serratia marcescens SR3 sản xuất prodigiosin dưới điều kiện môi trường (LB), thể tích vi khuẩn ban đầu bổ sung (7%, v/v), pH môi trường (pH = 8) và thời gian lên men (96 giờ), hàm lượng prodigiosin đạt 488,27 Unit/tế bào. Từ khóa: prodigiosin, pH, môi trường, thời gian lên men, Serratia marcescens. 1. GIỚI THIỆU Prodigiosin là một sắc tố màu đỏ tripyrrole tuyến tính và chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học thứ cấp được tích lũy bên trong màng tế bào và hạt bên trong tế bào. Prodigiosin thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (Tsuji et al., 1992) và có khả năng tiêu diệt côn trùng đã được nghiên cứu và báo cáo (Wang et al., 2011). Với tiềm năng ứng dụng của prodigiosin trong y học và thuốc trừ sâu sinh học nên prodigiosin đang thu hút sự quan tâm ngày càng tăng của các nhà khoa học (Siva et al., 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens có thể tổng hợp prodigiosin bằng phương pháp lên men chìm. Tuy nhiên, trong quá trình lên men chịu sự tác động của nhiều yếu tố sinh học và phi sinh học ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của sản phẩm. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3 bằng phương pháp lên men chìm” được thực hiện nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn. 2. PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu Dòng vi khuẩn Serratia marcescens SR3 được lưu giữ phòng thí nghiệm vi sinh của Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang. Hóa chất và thiết bị: peptone, yeast extract, cân phân tích, máy đo quang phổ, máy đo pH,.. hóa chất và thiết bị cần thiết khác. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình sinh prodigiosin Chuẩn bị 100 mL môi trường dinh dưỡng khác nhau trong bình tam giác 250 mL, điều chỉnh pH môi trường là pH = 7. Chủng 5 mL vi khuẩn nội sinh (mật số tế bào là 106 tế bào/mL) trong môi trường nhân sinh khối, ủ trong điều kiện nhiệt độ 28±20C trong 3 ngày. Hàm lượng prodigiosin được tính dựa theo Darshan và Manonmani (2016) và có điều chỉnh để phù hợp với điều kiện thí nghiệm: mẫu vi khuẩn được nuôi trong môi trường lên men với nhiệt độ 28±20C và tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 72 giờ. Tiến hành thu dịch lọc bằng phương pháp ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/10 Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2019 633 phút, thu phần cặn. Phần cặn được ly trích với 1 mL hỗn hợp HCL 1N-methanol (4: 96, v/v) để tế bào vi khuẩn phóng thích prodigiosin. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/10 phút, phần dịch trong đo ở λ = 499 nm. Prodigiosin (unit/tế bào) = [OD499 - (1,381 x OD620)]/ OD620 x 1000 OD499: độ hấp thụ chất màu; OD620: độ hấp thụ tế bào vi khuẩn; 1,381: hệ số chuyển đổi. 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh prodigiosin Chuẩn bị 100 mL môi trường dinh dưỡng LB lỏng trong bình tam giác 250 mL, điều chỉnh pH môi trường khác nhau. Chủng 5 mL vi khuẩn nội sinh (mật số tế bào là 106 tế bào/mL) trong môi trường nhân sinh khối, ủ trong nhiệt độ 28±20C, lắc 200 vòng/phút trong 3 ngày. 2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh prodigiosin Chuẩn bị 100 mL môi trường dinh dưỡng LB lỏng trong bình tam giác 250 mL, chỉnh về pH = 8. Chủng 5 mL vi khuẩn nội sinh trong môi trường nhân sinh khối, ủ trong nhiệt độ 28±20C, lắc 200 vòng/phút trong thời gian nuôi cấy khác nhau. 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích ban đầu đến quá trình sinh prodigiosin Chuẩn bị 100 mL môi trường dinh dưỡng LB lỏng trong bình tam giác 250 mL, chỉnh về pH = 8 và thời gian lên men là 96 giờ. Chủng vi khuẩn nội sinh trong môi trường nhân sinh khối với lượng thể tích khác nhau, ủ trong nhiệt độ 28±20C, lắc 200 vòng/phút trong 3 ngày. 2.3 Phƣơng pháp thống kê Các số liệu được xử lý và thống kê bằng phần mềm Excel và Statghraphics plus 16.0. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến quá trình sinh prodigiosin Các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin được tiến hành nghiên cứu và đánh giá hiệu quả (Hình 1). Môi trường LB cho hàm lượng cao nhất với prodigiosin đạt 456,57 Unit/tế bào; kế đến là môi trường NB, prodigiosin đạt 400,15 Unit/tế bào và thấp nhất là môi trường đậu tương, prodigiosin chỉ đạt 397,33 Unit/tế bào. Kết quả nghiên cứu khác so Giri et al. (2004), vi khuẩn Serratia marcescens sản xuất prodigiosin cao nhất trong môi trường NB (0,52 mg/mL) so với peptone glycerol, hàm lượng prodigiosin đạt 0,02 mg/mL. Môi trường LB và NB có chứa peptone, thịt và men chiết xuất. Peptone là một loại tiêu hóa có sẵn trên thị trường của một loại protein thực vật hoặc động vật cụ thể, được tạo sẵn cho các sinh vật dưới dạng peptide và acid amin để giúp đáp ứng các yêu cầu về nitơ, lưu huỳnh, carbon và năng lượng. Chiết xuất nấm men và thịt có chứa các mô nhân chuẩn (nấm men, cơ thịt bò, não và tim,) được chiết xuất bằng cách đun sôi và cô đặc thành bột nhão hoặc sấy khô thành bột và được sử dụng như một nguồn acid amin, vitamin và coenzyme, yếu tố tăng trưởng sinh vật. Nguyên nhân của sự khác biệt này là do loài sinh vật sản xuất hợp chất màu và điều kiện sinh trưởng khác nhau. 3.2. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình sinh prodigiosin pH ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin đã được nghiên cứu bởi các nhà khoa học (Ahmed et al., 2013). Buckland et al. (1989), pH của môi trường đóng vai trò quan trọng cho sự phát triển của tế bào vi khuẩn và sản xuất các hợp chất thứ cấp hoặc kích thích và kìm hãm hoạt tính của enzyme. Các mức pH khác nhau của môi trường được sử dụng để tối ưu hóa quá trình sản xuất prodigiosin từ S. marcescens. Kết quả, các giá trị pH khác nhau cho hiệu quả sản xuất prodigiosin khác nhau (Hình 2). Cụ thể, prodigiosin được sản xuất cao nhất ở mức pH=8, với giá trị prodigiosin là 475,78 Unit/tế bào; kế đến là mức pH = 7 với prodigiosin đạt 413,59 Unit/tế bào; thấp nhất là ở mức pH=5, prodigiosin chỉ đạt 291,19 Unit/tế bào. Kết quả này tương tự Giri et al. (2004), pH kiềm thích hợp cho quá trình sản xuất prodigiosin. Ngoài ra, khi tăng hoặc giảm pH môi trường sản xuất trên hoặc dưới mức pH tối ưu cho sản xuất prodigiosin, điều này do sự thay đổi hoạt động của tất cả các gen chịu trách nhiệm sinh tổng hợp prodigiosin (Sole et al., 1997). pH ảnh hưởng đến quá trình sản xuất chất màu là do hai lý do, thứ nhất là ảnh hưởng đến các tính chất của môi trường nuôi cấy Kỷ yếu Hội nghị: Nghiên cứu cơ bản trong “Khoa học Trái đất và Môi trường” 634 bao gồm độ hòa tan của các chất dinh dưỡng, vận chuyển và ion hóa và thứ hai là ảnh hưởng của pH đến độ ổn định của chất màu. Hình 1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và pH môi trường đến quá trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3. Hình 2. Ảnh hưởng của thời gian lên men và thể tích chủng đến quá trình sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens SR3. 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến quá trình sinh prodigiosin Thời kỳ lên men đóng một vai trò rất quan trọng trong sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp của vi khuẩn. Thời gian lên men khác nhau cho hàm lượng prodigiosin khác nhau (Hình 2). Khi gia tăng thời gian lên men hàm lượng prodigiosin tăng tỷ lệ thuận với nhau. Cụ thể, thời gian lên men là 96 và 120 giờ, hàm lượng prodigiosin cao nhất đạt 471,72 Unit/tế bào và 480,92 Unit/tế bào; thời gian lên men là 72 giờ, hàm lượng prodigisoin đạt 243,19 Unit/tế bào và thấp nhất, hàm lượng prodigiosin chỉ đạt 116,43 Unit/tế bào khi thời gian lên men 24 giờ. 3.4. Ảnh hƣởng của thể tích ban đầu đến quá trình sinh prodigiosin Một trong các tham số quan trọng của quá trình lên men là thể tích chủng ban đầu, bởi vì thể tích chủng ban đầu rất cần thiết khi nghiên cứu sản xuất các hợp chất sinh học sử dụng phương pháp lên men chìm. Nếu thể tích chủng quá ít sẽ ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn từ đó dẫn đến sản xuất không đủ các chất chuyển hóa và sản phẩm cuối cùng cần đạt (Varalakshmi và Jaya, 2013) (Hình 2). Hàm lượng prodigiosin đạt cao nhất ở thể tích cấy ban đầu là 7% và 10%, với hàm lượng prodigiosin lần lượt là 488,27 Unit/tế bào và 485,32 Unit/tế bào; kế đến là thể tích ban đầu 5% với hàm lượng prodigiosin là 469,81 Unit/tế bào và thấp nhất là ở thể tích 1% với hàm lượng prodigiosin 400,09 Unit/tế bào. Khi thể tích chủng thấp hơn 7% làm giảm hàm lượng prodigiosin sản xuất, nguyên nhân của sự khác biệt này là do không sản xuất đủ sinh khối (thể tích chùng thấp) hoặc hình thành các chất ức chế ảnh hưởng đến sản phẩm tạo thành (Bilgrami và Verma, 1981). 4. KẾT LUẬN Vi khuẩn Serratia marcescens SR3 là nguồn sản xuất prodigiosin trong tự nhiên và sản xuất prodigiosin bằng phương pháp lên men chìm. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ly Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2019 635 trích, tinh sạch và bảo quản prodigiosin, kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật gây bệnh, tế bào ung thư của prodigiosin trong điều kiện in vitro và in vivo. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Ahmad WA, Wan Ahmad WY, Zakaria ZA and Yusof NZ, 2012. Appl Bact Pigments Colorant. 2012 doi: 10.1007/978-3-642-24520-6. [2]. Buckland, B., Gbewonyo, K., Hallada, T., Kaplan, L. and Masurekar, P, 1989. Production of lovastatin, an inhibitor of cholesterol accumulation in humans. In: Novel Microbial Products for Medicine and Agriculture, A.L.Demain, G.A.Somkuti, JC.Hunter-Cevera and H.W.Rossmoore, eds., 161-169, Elsevier. [3]. Darshan N, Manonmani HK, 2016. Prodigiosin and its potential applications. J Food Sci Technol;52, 5393-5407. doi: 10.1007/s13197-015-1740-4. [4]. Giri AV, Anandkumar N and Muthukumaran G, 2004. A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil. BMC Microbiol, 4, 11-18. [5]. VaralakshmiV., Jaya K, 2013. Optimization of L-Asparaginase production by Aspergillus terreus MTCC 1782 using Bajra seed flour under solid state fermentation. International Journal of Research in Engineering and Technology, 2 (9), 121-126. [6]. Siva R, Subha K and Bhakta D, 2012. Characterization and enhanced production of prodigiosin from the spoiled coconut. Appl Biochem Biotechnol, 166, 187-196. [7]. Sole M, Francia A and Rius N, 1997. The role of pH in the glucose effect on prodigiosin production by non-proliferating cells of Serratia marcescens. Lett Appl Microbiol 25, 81-84. [8]. Tsuji R.F., Magae J., Jamashita M., Nagai K. and Yamasaki M, 1992. Immunomodulating properties of prodigiosin 25-C, an antibiotic which preferentially suppresses of cytotoxic T cells. J. Antibiot. 45, 1295-1302. [9]. Wang SL, Wang CY and Yen YH, 2011. Enhanced production of insecticidal prodigiosin from Serratia marcescens TKU011 in media containing squid pen. Process Biochem, 47, 1684-1690. INVESTIGATING FACTORS AFFECTING PRODIGIOSIN PRODUCTION FROM SERRATIA MARCESCENS SR3 BY SUBMERGED FERMENTATION Nguyen Pham Tuan 1 , Bang Hong Lam 2 , Nguyen Cong Kha 1 , Nguyen Hoai Vung 1 , Nguyen Pham Tu 1 và Huynh Cam Thuy Trang 1 1 Biotechnology An Giang Center. Email: ngphamtuan1983@gmail.com 2 An Giang University. Email: bhlam@agu.edu.vn ABSTRACT Prodigiosin is a red pigment and widely applied as antimicrobial, antifungal, anti-malarial, anti-cancer, immunosuppressant agent, UV protection and disinfestation,... This study "Investigating factors affecting prodigiosin production from S. marcescens SR3 by submerged fermentation" was conducted to analyze the effect of various factors on prodigiosin production process of S. marcescens SR3 by submerged fermentation method. The results showed that S. marcescens SR3 could produce prodigiosin in LB medium with initial bacterial volume (7%, v/v), pH = 8, fermentation time (96 hours), and prodigiosin content reached 488.27 Unit/cell. Keywords: Prodigiosin, pH, Serratia marcescens, medium, time of fermentation.