Khảo sát các yếu tố môi trường trên cạn tại Bình Thạnh

20 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Khảo sát các yếu tố môi trường trên cạn tại Bình Thạnh. 3.1.2. Khảo sát các yếu tố môi trường nước tại Bình Thạnh. 3.1.3. Kiểu hình của Anopheles minimus. 3.1.4. Kiểu gen của Anopheles minimus. 3.1.5. Mùa phát triển của Anopheles minimus. 3.1.6. Tập tính của Anopheles minimus. 3.1.7. Tỉ lệ nhiễm KSTSR của Anopheles minimus. 3.1.8. Phản ứng của Anopheles minimus với hoá chất alpha cypermethrine và lambda-cyhalothrine. 3.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đề tài nghiên cứu trên đối tượng là muỗi Anopheles minimus Theobald, 1901. 3.2.1. Vòng đời muỗi Anopheles. Bệnh sốt rét được truyền cho người do muỗi cái thuộc giống Anopheles. Muỗi đực chỉ hút nhựa cây, mật hoa, không đốt máu người do đó không thể truyền bệnh. Theo G.B. White (1982) [50] trên thế giới có khoảng 400 loài Anopheles được phát hiện trong đó có khoảng 67 loài có khả năng truyền sốt rét. Theo Trần Đức Hinh (1997) [13] ở Việt Nam có 59 loài Anopheles, trong đó có 7 loài có phản ứng dương tính với kháng thể đơn dòng của KSTSR. Các véc tơ truyền sốt rét chính ở Việt Nam là Anopheles minimus, Anopheles dirus, Anopheles sundaicus. Vòng đời của Anopheles có 4 giai đoạn khác nhau: trứng, bọ gậy, quăng và muỗi, trong đó chỉ có giai đoạn muỗi sống trên cạn. Muỗi cái cần đốt máu để 22 phát triển trứng, trứng thường được đẻ trước khi muỗi đốt máu lần sau, hình thành các chu kỳ sinh thực trong đời sống của muỗi. Thời gian của một chu kỳ sinh thực phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường. Muỗi cái đẻ trứng trong suốt đời sống của nó. Trung bình chúng có thể đẻ được 1-3 lứa. Trong điều kiện thuận lợi muỗi cái Anopheles có thể sống từ 2-3 tuần. Trứng muỗi được đẻ xuống nước, mỗi lứa từ 100-150 trứng. Mỗi một loài Anopheles chọn một thuỷ vực thích hợp để đẻ trứng. Sau 2-3 ngày trứng nở thành bọ gậy. Bọ gậy Anopheles thường nằm song song với mặt nước để lấy không khí. Thời kỳ bọ gậy chia làm 4 giai đoạn (tuổi). Bọ gậy lột xác từ tuổi 1 sang tuổi 2, 3, 4. Mỗi giai đoạn kéo dài khoảng 2-3 ngày tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường có thuận lợi cho sự phát triển của chúng hay không. Nhiệt độ, ánh sáng, lượng thức ăn có ảnh hưởng lớn đến thời gian phát triển của bọ gậy. Trong điều kiện bình thường giai đoạn bọ gậy kéo dài từ 8 -10 ngày. Bọ gậy tuổi 4 lột xác thành quăng. Quăng không ăn, chỉ tiêu chất dự trử. Giai đoạn quăng kéo dài 2-3 ngày, sau đó quăng phát triển thành muỗi. Muỗi Anopheles giao phối với nhau khi đang bay. Sự thụ tinh chỉ xảy ra một lần sau đó tinh trùng được dự trử trong túi tinh trong cơ thể muỗi cái và thụ tinh cho trứng dần dần. Hầu hết Anopheles đốt mồi vào ban đêm, vào nửa đầu hay nửa cuối của đêm. Có loài thích vào nhà đốt mồi (endophagic), có loài thích đốt mồi ngoài nhà (exophagic). Có loài thích đốt người (anthropophilic), có loài thích đốt máu súc vật (zoophilic). Thời gian truyền KSTSR vào vật chủ có thể thay đổi tuỳ vào nhiệt độ, chủng loại KSTSR... 3.2.2. Chu kỳ của KSTSR trong cơ thể muỗi 23 Muỗi cái Anopheles hút máu bệnh nhân có KSTSR ở thể giao bào (gametocyste). Giao bào phát triển thành gametes đực và cái vào trong dạ dày muỗi, sau 10 - 20 phút kết hợp thành hợp tử (zygote), vài giờ sau hợp tử phát triển kéo dài ra thành hình thoi di động gọi là ookinete. Ookinete len qua những tế bào thành dạ dày, bám chặt vào thành ngoài dạ dày, biến thành nang bào (oocyste). Nang bào có hình tròn và không di động. Nang bào phát triển qua 4 giai đoạn, khi soi tươi dưới kính hiển vi thì có màu trong suốt, khi nhuộm thì bắt màu xanh sẫm. Thường nang bào xuất hiện ở thành ngoài dạ dày muỗi 2 ngày sau khi muỗi đốt máu bệnh nhân. Nang bào lớn dần, phân chia thành hàng ngàn phân tử nhỏ có hình thoi, dài khoảng 15μm, có một nhân ở giữa gọi là thoa trùng (sporozoite). Nang bào phát triển đến tuổi 4 phá vỡ thành dạ dày tung thoa trùng ra ngoài, thoa trùng theo hạch bạch huyết đến tập trung ở tuyến nước bọt của muỗi và truyền sang cho người khi muỗi đốt người. 3.2.3. Muỗi Anopheles minimus Muỗi Anopheles minimus trong hệ thống phân loại Ngành chân khớp : Arthropoda Lớp côn trùng : Insecta Bộ hai cánh : Diptera Bộ phụ râu dài: Nematocera Họ muỗi : Culicidae Phân họ muỗi sốt rét: Anophelinae Giống : Anopheles Phân giống: Cellia Muỗi Anopheles minimus 24 Anopheles minimus rất đa dạng về hình thái. Muỗi Anopheles minimus kiểu hình A có thân nhỏ, màu đen, xúc biện có 3 băng trắng, cánh có một điểm trắng gián đoạn ở gân gốc cánh, vòi muỗi nhỏ thanh, màu đen nhạt, đầu mút vòi có màu vàng nâu, gân cánh L6 có 2 điểm đen, L5 có 3 điểm đen, diềm cánh gián đoạn ở tất cả các gân trừ gân L6. (Phụ lục) Các tác giả Hồ Đình Trung, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Marc Coosemans (1996) [37], phân biệt các dạng của muỗi Anopheles minimus như sau: Anopheles minimus kiểu hình A: có gián đoạn gốc cánh tại tại điểm presector trên gân costa, không có điểm trắng humeral. Anopheles minimus kiểu hình B: không có gián đoạn gốc cánh ở cả 2 điểm presector và humeral trên gân costa. Anopheles minimus kiểu hình C: có gián đoạn gốc cánh ở cả 2 điểm presector và humeral trên gân costa.(Phụ lục) Bọ gậy Anopheles minimus Phần đầu: có lông môi trong xa nhau, lông ăng ten đơn, lông môi ngoài và lông môi trong không phân nhánh. Phần bụng: từ đốt IV - đốt VII có khánh lưng lớn ( rộng hơn khoảng cách giữa gốc các đôi lông lá cọ). Bờ dưới khánh lưng đốt bụng II nhẵn; lông số 0 từ đốt bụng đốt IV - đốt VII thường chia nhánh và nằm ngoài khánh. (Phụ lục) 3.3. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 3/2006 đến tháng 3/2007. 3.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 Nghiên cứu được thực hiện tại xã Bình Thạnh, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận. Bình Thuận là một tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ có địa hình phức tạp do ở tận cùng của Nam Trường Sơn, nơi có các dãy núi chạy ra sát biển, chia cắt dãy đồng bằng nhỏ hẹp ra thành nhiều đoạn nhỏ, các dãy núi này đều chạy theo hướng tây bắc - đông nam và thấp dần theo hướng đó tạo cho địa hình dốc về phía biển. Bình Thuận nằm trong khu vực khí hậu á xích đạo gió mùa hơi khô, có nhiệt độ cao và lượng mưa ít nhất trong cả nước [10]. Số liệu đo đạc được trong nhiều năm tại các trạm Khí tượng Thuỷ văn cho thấy nhiệt độ trung bình tại tỉnh Bình Thuận là 26,60C. Tháng 5 là tháng có nhiệt độ cao nhất (28,3˜0C). Tháng 1 là tháng có nhiệt độ thấp nhất (24,70C). Tháng10 là tháng có ẩm độ cao nhất (86,2%). Tháng 3 là tháng có ẩm độ thấp nhất (69,5%). Lượng mưa trung bình là 1152mm [6]. Xã Bình Thạnh thuộc huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận có toạ độ xác định 11011’82” vĩ độ Bắc, 1080 41’39” kinh độ Đông. Ranh giới : Phía bắc giáp thị trấn Liên Hương, phía tây giáp xã Chí Công, phía đông và nam giáp Biển Đông . Độ cao 6,55 m so với mực nước biển Theo tác giả Vũ Tự Lập (2003) [19] Bình Thạnh nằm trong hệ địa sinh thái cồn cát ven biển nội chí tuyến gió mùa khô hạn, hình thành trên đất cát nghèo nàn, đồng thời tác động của gió biển rất mạnh, cho nên sinh khối và năng suất rất thấp. Thực vật chủ yếu là cỏ, xen ít cây bụi, không phủ kín được mặt cát. Thảm thực vật gồm có Cỏ lông chông, Cỏ gà, Cỏ gấu, Cỏ gừng, Muống biển , Xương rồng, Dứa dại, Dứa sợi, cây gỗ chủ yếu có Phi lao. 26 Bình Thạnh có hai mùa: mùa khô từ tháng 1 đến tháng 6, mùa mưa từ tháng 7 đến tháng 12. Bình Thạnh có 2 hướng gió: gió đông bắc thổi vào các tháng 1, 2; gió tây nam thổi vào các tháng 7, 8. Số liệu điều tra tháng 3 năm 2006 cho thấy: Bình Thạnh có diện tích 26,682 km2. Dân số của xã là 2777 người, thuộc 551 hộ, trong đó 97% người Kinh, 3% người Chăm. Về cơ cấu nghề nghiệp có 37% số hộ làm nghề nông lâm thuỷ sản, 54 % làm dịch vụ, 9% là công nhân và các nghề khác . Các điều tra của Viện Sốt rét Ký sinh trùng Côn trùng Quy Nhơn từ 1977 đến 2000 cho thấy tại Bình Thạnh thường xuyên có mặt muỗi Anopheles minimus với mật độ cao: 13 con/giờ/người (Phương pháp mồi người, tháng 8 năm 1983). Từ 1980 - 1994 tỉ lệ nhiễm ký sinh trùng sốt rét của người dân địa phương luôn cao hơn 5% . Tháng 5 năm 1994 một điểm kính hiển vi được đặt ngay tại Trạm xá xã để phát hiện điều trị kịp thời bệnh nhân sốt rét. Từ 1994 - 2005, nhờ hoạt động hiệu quả của điểm kính, tỉ lệ nhiễm KSTSR giảm hẳn, thường không cao hơn 2% (Số liệu Trạm Y tế xã Bình Thạnh). 27 Bac Binh Tanh Linh Ham Tan Ham Thuan B ac Tuy Phong Ham Thuan N am Duc Linh Tp. Phan Thiet Bản đồ tỉnh Bình Thuận Phan Dung Phong Phu Phu Lac Vinh Tan Vinh Hao Chi Cong Binh Thanh Hoa Minh Hoa Phu Phuoc The Lien Huong town Phan Ri Cua town Bản đồ huyện Tuy Phong 28 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp khảo sát các yếu tố môi trường - Phương pháp đo đạc Các yếu tố môi trường trên cạn Việc xác định các yếu tố môi trường trên cạn được thực hiện trong các vườn cây nơi có muỗi Anopheles minimus sinh trưởng. Mỗi thôn chọn một nhà có vườn để đo đạc các yếu tố môi trường và điều tra muỗi Anopheles. Nhiệt độ, ẩm độ được đo trên máy tự ghi vào lúc 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, lấy giá trị trung bình. Tốc độ gió được đo 4 lần trong 1 ngày vào lúc 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, thời gian đo 5 phút, lấy giá trị trung bình. Cường độ ánh sáng đo 3 lần trong 1 ngày vào lúc 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, thời gian đo 5 phút, lấy giá trị trung bình. - Đo nhiệt độ, ẩm độ bằng máy đo TESTO 635. - Đo tốc độ gió bằng máy đo SIBATA Model ISA-80. - Đo cường độ ánh sáng bằng máy đo SIBATA Model ANA-F11. Các yếu tố môi trường nước Độ pH, độ mặn được đo tại 3 thuỷ vực cách nhau 1km, đo ở vị trí cách mặt nước 0,2 m, lấy giá trị trung bình. - Đo pH bằng máy đo pH JENWAY Model 3150. - Đo độ mặn bằng máy đo WQC-22A. - Đo mực nước 3 thuỷ vực cách nhau 1 km, lấy giá trị trung bình. - Sử dụng số liệu lượng mưa trong năm 2006 của Đài Khí tượng Thuỷ văn trạm Sông Luỹ (huyện Bắc Bình) cách Bình Thạnh 35 km. 29 3.5.2. Phương pháp điều tra Anopheles. Phương pháp chọn điểm điều tra Tại hai điểm nhỏ nghiên cứu là thôn 1 và thôn 2 thuộc xã Bình Thạnh, mỗi thôn chọn một nhà có người ở để điều tra mật độ muỗi tìm mồi trong nhà và ngoài nhà. Điều tra muỗi ở chuồng gia súc được thực hiện ở hai chuồng bò của hai nhà khác ở hai thôn. Điều tra bọ gậy ở các thuỷ vực của hai vườn trong hai thôn. Các điểm điều tra được chọn ngẫu nhiên và giữ cố định trong suốt thời gian nghiên cứu. 5 phương pháp điều tra Anopheles - Mồi người trong nhà : Hai người điều tra trong hai đêm từ 19 giờ đến 5 giờ sáng ngày hôm sau tại 2 nhà cố định. - Mồi người ngoài nhà : Hai người điều tra trong hai đêm từ 19 giờ đến 5 giờ sáng ngày hôm sau tại 2 nhà cố định. - Soi trong nhà ngày : Hai người điều tra trong hai ngày từ 6 giờ đến 8 giờ tại 10 nhà cố định . - Soi chuồng gia súc : Hai người điều tra trong hai đêm từ 20 giờ đến 24 giờ tại 2 chuồng cố định . - Thu thập bọ gậy : Mỗi loại thuỷ vực điều tra 100 bát. Mật độ muỗi được tính bằng số lượng muỗi một người thu thập được trong một giờ (con/giờ/người) . Mật độ bọ gậy được tính bằng số lượng bọ gậy một người thu thập được trong 100 bát (con/100 bát ). 3.5.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 3.5.3.1. Kỹ thuật định loại Anopheles 30 Sử dụng các bảng định loại Anopheles của Viện Sốt rét Ký sinh trùng Côn trùng Trung ương (1987), Reid (1968), Harison (1980). Nguyên tắc chung được sử dụng để thiết lập khoá định loại Khoá định loại được thiết lập theo nguyên tắc phân nhánh lưỡng phân, sử dụng các đặc điểm đối lập nhau để loại trừ, một loài khi có một đặc điểm này thì không có đặc điểm tương ứng khác. Ví dụ : Lông môi có phân nhánh, lông môi không phân nhánh . Lông bờ ngực đơn, lông bờ ngực kép. Cách sử dụng khoá định loại - Nhận biết các đặc điểm dùng để định loại từ tổng quát đến chi tiết. - Quan sát mẫu vật để tìm các đặc điểm phân loại. - Tra cứu các đặc điểm của mẫu vật trong khoá phân loại cho đến loài . - Khi có một đặc điểm trùng hợp cần xem xét các đặc điểm bổ sung ở các pha khác. Kỹ thuật định loại muỗi Anopheles - Gây mê muỗi bằng ether hay chloroform. - Cho muỗi ra đĩa petri, dùng kim mổ cắm vào ngực muỗi, giữa đôi chân thứ hai, chếch về phía sau cho 2 cánh muỗi xoè ra. - Quan sát muỗi bằng lúp tay có độ phóng đại 10x, 20x, hoặc lúp hai mắt có độ phóng đại 10x, 20x,40x sơ bộ nhận xét các đặc điểm sau : muỗi đực hay muỗi cái, Anophelinae hay Culicinae, cánh có điểm trắng đen hay đồng màu, chân có hoa hay đen tuyền, các đốt bàn chân có băng trắng hay không có băng trắng. Sau khi có khái niệm chung, dùng lúp tay quan sát chi tiết, so sánh các đặc điểm đó với bảng định loại và xác định loài. Đặc điểm của muỗi Anopheles 31 Ơû phần đầu quan sát các đặc điểm của vòi và xúc biện - Vòi : Quan sát màu sắc của vòi, vòi màu đen hay ánh vàng. - Xúc biện (palp): xác định số lượng, kích thước, sự phân bố của các băng trắng trên xúc biện. Ơû phần ngực quan sát các đặc điểm của cánh và diềm cánh - Cánh: Quan sát các gân costa, subcosta; xác định số lượng, kích thước, sự phân bố các điểm trắng đen trên gân cánh từ L1 - L6. - Diềm cánh: xác định sự phân bố của các điểm trắng đen trên diềm cánh. Ơû phần bụng quan sát và đếm các chùm lông trên các đốt bụng của muỗi. Phần chân - Quan sát các vảy trắng, điểm trắng, băng trắng, chùm lông trên chân. Xác định số lượng, kích thước, sự phân bố của chúng trên các đốt của chân. 3.5.3.2. Kỹ thuật định loại bọ gậy Anopheles Dùng ống hút đặt bọ gậy lên lam kính, bọ gậy Anopheles đặt nằm sấp, đầu bọ gậy hướng về phía người soi kính. Đặt lamen lên trên bọ gậy, tránh di chuyển lamen nhiều lần làm rụng lông và mất các đặc điểm định loại. Đầu tiên quan sát tổng quát bọ gậy ở vật kính 8x, sau đó chuyển sang vật kính 40x để quan sát các đặc điểm chi tiết, dựa vào bảng định loại để xác định loài. Chỉ định loại bọ gậy tuổi 3, 4; bọ gậy tuổi 1, 2 chưa có đủ đặc điểm để định loại. Đặc điểm của bọ gậy Anopheles Ơû phần đầu quan sát các lông ăng ten : đơn hay kép, vị trí của lông ăng ten. Các lông môi : các lông môi trong, ngoài, trước, sau có phân nhánh hay 32 không phân nhánh, vị trí của các lông môi. Lông đường nối trong, ngoài, có phân nhánh hay không phân nhánh , số lượng nhánh lông. Ơû phần ngực quan sát các lông bờ ngực: lông bờ ngực đơn hay kép (chỉ cần 1 trong 3 lông bờ ngực là kép thì kết luận đó là lông bờ ngực kép). Các lông vai lông vai trong, giữa, ngoài, chung gốc hay không chung gốc, phân nhánh hay không phân nhánh. Lông số 4 ngực giữa có phân nhánh hay không, rũ hay thẳng, số lượng nhánh. Lông lá cọ đốt ngực sau : lông lá cọ có phát triển hay không phát triển. Ơû phần bụng quan sát các lông lá cọ : các lông lá cọ phát triển hay không phát triển, sắc tố của các lông lá cọ. Xác định hình dạng, kích thước của khánh. Quan sát các lông số 0, 5, 7, 9… Khi định loại phải theo thứ tự của bảng định loại, loại dần những đặc điểm sai khác, không đi tắt hay đi ngược từ dưới lên. 3.5.3.3. Kỹ thuật điều tra muỗi - Phương pháp mồi người Mục đích của phương pháp này là xác định thành phần, mật độ các loài Anopheles đốt người, thời gian muỗi đốt mồi trong đêm và mùa phát triển của muỗi trong năm. Người mồi muỗi thường mặc quần cộc hoặc vén quần lên để chân ra thu hút muỗi. Vị trí mồi có thể ở trong nhà, ngoài sân hay ngoài rừng. Người mồi muỗi ngồi yên, chờ cho muỗi đến đốt máu thì soi đèn pin bắt. Dùng tube bằng thuỷ tinh có thủng hai đầu để bắt muỗi. Dùng bông không thấm nước để đậy miệng tube. Khoảng 2 - 3 phút phải bật đèn lên để kiểm tra, không chiếu đèn trực tiếp vào muỗi vì ánh sáng kích thích làm muỗi bay mất. Ghi lại giờ bắt 33 muỗi, nơi bắt muỗi. Mồi người thường được tiến hành từ 18 giờ đêm đến 6 giờ sáng hôm sau để xác định thời gian muỗi Anopheles hoạt động mạnh nhất trong đêm và thành phần, mật độ các loài Anopheles đốt một người trong một đêm ( chỉ số Macdonalt). - Phương pháp soi muỗi trong nhà ban ngày Mục đích của phương pháp điều tra này là xác định thành phần, mật độ các loài Anopheles có tập tính trú tiêu máu trong nhà. Xác định vị trí, độ cao, giá thể nơi muỗi trú tiêu máu. Đánh giá tác dụng của hoá chất phun tẩm trong nhà Thời gian điều tra : Tiến hành vào buổi sáng từ 6 -10 giờ ở trong nhà. Tay phải người điều tra cầm ống nghiệm, tay trái cầm đèn pin. Bắt đầu tìm muỗi từ cửa ra vào và đi dần vào trong, vừa đi vừa rọi đèn vào tường, đèn cách tường từ 30 - 40 cm, chiếu qua lại, lên xuống. Chú ý tìm những nơi có ít ánh sáng, kín gió, độ cao từ 2 mét trở xuống, muỗi thường đậu trên quần áo, chăn màn, trong các đồ dùng gia đình như xoong nồi, chum vại …Khi thấy muỗi úp nhanh ống nghiệm lên muỗi, di động qua lại cho muỗi bay vào ống, dùng bông nút ống lại. Ghi vào nhãn : địa điểm thu thập muỗi, huyện, xã, số nhà, nơi đậu, độ cao so với sàn nhà của từng con, số sella của muỗi . - Phương pháp thu thập muỗi chuồng gia súc Mục đích của phương pháp này là xác định thành phần, mật độ các loài Anopheles đốt máu súc vật. Thu thập muỗi cho các thử nghiệm nhạy kháng và tồn lưu hoá chất (bioassay). Tìm bắt muỗi đang đốt máu trâu bò, đang đậu trên tường hay trên các đám cỏ, bụi cây gần chuồng. Dùng tube bằng thuỷ tinh có thủng hai đầu để bắt muỗi. Dùng bông không thấm nước để đậy miệng tube. Ghi lại giờ bắt muỗi, nơi bắt muỗi. Thường thu thập muỗi ở chuồng gia súc từ 20 - 24 giờ. 34 3.5.3.4. Kỹ th