Khảo sát khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của cao chiết trà xanh (Camellia sinensis) trên chuột nhắt

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 118 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CẢI THIỆN SỰ SUY GIẢM TRÍ NHỚ CỦA CAO CHIẾT TRÀ XANH (CAMELLIA SINENSIS) TRÊN CHUỘT NHẮT Nguyễn Hải Hà*, Dương Phước An*, Trần Lê Tuyết Châu*, Trần Phi Hoàng Yến* TÓM TẮT Đặt vấn đề: EGCG, một trong những hoạt chất polyphenol chính của Trà xanh (TX), đã được chứng minh có khả năng bảo vệ tế bào não chống lại bệnh Alzheimer. Đề tài này được thực hiện nhằm góp phần khẳng định khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết TX bằng mô hình gây suy giảm trí nhớ sử dụng trimethyltin, một tác nhân gây tổn thương tế bào vùng hải mã não chuột và làm rối loạn chức năng nhận thức và nhớ. Mục tiêu: Đánh giá tác dụng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết toàn phần từ búp non lá trà xanh (TX) trên chuột nhắt. Phương pháp: Áp dụng mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin (TMT) để đánh giá khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết búp non lá trà xanh sử dụng mô hình Mê cung bơi (Morris Water Maze - MWM) và thông qua việc xác định các chỉ số sinh hóa (Acetylcholine và Acetylcholinesterase). Kết quả: Hai liều cao chiết toàn phần từ TX (30 mg/kg, và 60 mg/kg, p.o x 14 ngày) đều thể hiện khả năng chống lại tác dụng suy giảm học hỏi và ghi nhớ do TMT liều duy nhất (2,4 mg/kg, i.p) thông qua 3 thử nghiệm của mô hình MWM: Thử nghiệm ẩn chân đế (Hidden Platform Test, p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT với TX60 + TMT); thử nghiệm thăm dò (Probe Test, p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT và TX30 + TMT hoặc nhóm TX60 + TMT); và thử nghiệm trí nhớ hoạt động (Working Memory Test, p < 0,05 khi so giữa nhóm TMT với TX30 + TMT; p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT với nhóm TX60 + TMT). Kết quả định lượng acetylcholine (Ach) và Acetylcholinesterase (AchE) trong vùng hải mã cũng tương ứng với kết quả đạt được từ các thử nghiệm hành vi. Cả hai liều thử nghiệm Cao chiết TX đều thể hiện khả năng phục hồi sự giảm nồng độ Ach (p < 0,01) và sự gia tăng AchE (p < 0,01) do TMT gây ra. Kết luận: Cao chiết toàn phần từ búp non lá trà xanh thể hiện khả năng cải thiện sự suy giảm học hỏi và ghi nhớ qua mô hình MWM và hiệu quả này có liên quan đến hệ cholinergic, làm tăng Ach và giảm hoạt tính AchE trong vùng hải mã não chuột. Từ khóa: Trimethyltin, suy giảm khả năng học hỏi và ghi nhớ, acetylcholine, Trà xanh. ABSTRACT STUDY ON AMELIORATE OF MEMORY IMPAIRMENTS BY TRA XANH EXTRACT (CAMELLIA SINENSIS) IN MICE Nguyen Hai Ha, Duong Phuoc An, Tran Le Tuyet Chau, Tran Phi Hoang Yen * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 118 -123 Background: EGCG, one of polyphenol compound of Green tea (Camellia sinensis) (TX), was demonstrated to neuroprotective effect in Alzheimer’ Disease. This study is carried out to assert amelioration of memory impairment of extracts from fresh bud of TX applying memory impairments model by trimethyltin, a reagent caused degeneration of hippocampus in brain and memory and cognition dysfunction. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Trần Phi Hoàng Yến ĐT: 0937878365 Email: tranyen73@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 119 Objective: Evaluate effect of extract from fresh bud of Green tea leaf in memory impairments caused by trimethyltin in mice. Methods: Applying trimethyltin (TMT) model for memory impairments to evaluate the effect of TX extract using Morris Water Maze (MWM) protocol and biochemical detection (acetylcholine and acetylcholinesterase). Results: Two doses of TX (30 mg/kg, và 60 mg/kg, p.o x 14 days) show the protective role in impairments of learning and memory caused by TMT one dose exposure (2.4 mg/kg, i.p) by evaluation of MWM: Hidden Platform Test (p < 0.01 as compared between TMT and TX60 + TMT group); Probe Test (p < 0.01 as compared between TMT and TX30 + TMT or TX60 + TMT group); and Working Memory Test (p < 0.05 as compared between TMT and TX30 + TMT; p < 0.01 as compared between TMT and TX60 + TMT). Results in acetylcholine (Ach) content and Acetylcholinesterase (AchE) activity in hippocampus are correlated to results in behavior study. Two doses of TX ameliorate the decreases in Ach content (p < 0.01) and increases in AchE (p < 0.01) caused by TMT. Conclusion: Extracts from fresh bud of TX leaf ameliorate memory impairments using MWM test and this result correlates to cholinergic response, by increases in Ach content and decreases in AchE activity in hippocampus of mice. Keywords: Trimethyltin, memory impairments, acetylcholine, Green tea. ĐẶT VẤN ĐỀ Trimethyltin (TMT)(1) là hợp chất hữu cơ của thiếc, thường dùng TMT như là chất ổn định plastic, diệt nấm mốc trong nông nghiệp. Độc tính của TMT chủ yếu trên hệ thần kinh trung ương, tác động chủ yếu trên vùng Hippocampus của não chuột nhắt, làm suy giảm chức năng nhận thức và trí nhớ, gây ra các triệu chứng ngộ độc: khiếm thính, bồn chồn, dễ kích động, mất điều hòa, lú lẫn, mất định hướng, rối loạn trí nhớ ngắn hạn và dài hạn. Hiện nay, TMT được ứng dụng như một mô hình vừa gây tổn thương tế bào thần kinh vừa gây suy giảm trí nhớ, nhằm khảo sát các thuốc có khả năng bảo vệ tế bào thần kinh, chống suy giảm trí nhớ. Do vậy, TMT đã được ứng dụng trong nghiên cứu này nhằm khảo sát khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết TX, và mối liên hệ với acetylcholine, chất trung gian hóa học của hệ cholinergic, có vai trò quan trọng trong việc học và nhớ. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cao chiết toàn phần trà xanh Cao chiết ethanol toàn phần từ búp non lá trà xanh đã chuẩn hóa do ThS. Trần Lê Tuyết Châu* cung cấp (Hàm lượng EGCG đạt 65,3%). Chuột thử nghiệm Chuột nhắt trắng (đực) giống Swiss albino, trọng lượng 22 - 24 gam (khoảng 5 - 6 tuần tuổi), do Viện Vắc Xin và Sinh phẩm Y Tế Nha Trang cung cấp. Nguyên liệu, hóa chất khảo sát Trimethyltin hydrochlorid (Sigma), Reminyl (Hoạt chất là galantamin, Janssen); Memantine (Sigma); Coomassie [Bradford] (Thermo fisher Scientific); Amplex® Red Acetylcholine/ Acetylcholinesterase Assay Kit (A12217-InvitrogenTM/ Molecular Probe). Máy đo phổ hấp thu UV U-1900 UV/VIS Spectrophotometer 200V (HITACHI), máy Elisa (Thermo Electron) và máy nghiền đồng thể SONICATOR 3080 (USA). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 120 Thử nghiệm Morris Water Maze Là thử nghiệm dùng để đánh giá trí nhớ dài hạn trên chuột nhắt trắng. Hồ bơi có kích thước 1500 x 80 (cm) (đường kính x chiều cao), chân đế kích thước 10 x 25 (cm) (đường kính x chiều cao). Hồ bơi được đặt ở một nơi có màn che kín, trên tấm màn che này có đặt những hình vẽ với hình thù bất kỳ tại 4 góc hồ bơi. Nhiệt độ của hồ bơi phải nằm trong khoảng 27 ± 2 0C trong suốt thử nghiệm(3). Thử nghiệm mê cung bơi gồm 8 ngày thử nghiệm như sau: Hình 1. Sơ đồ bố trí thử nghiệm mô hình Morris Water Maze - Chuột được chia làm 6 nhóm, mỗi nhóm từ 8-10 con, thể tích tiêm hoặc uống thuốc là 0,1 µl/ 1 gam chuột): + Nhóm 1: Nước muối sinh lý (Sal.; n = 8) + Nhóm 2: TMT (2,4 mg/kg, i.p liều duy nhất; n = 10) + Nhóm 3: TX (30mg/kg, p.o x 14 ngày; n = 10) + TMT (2,4 mg/kg, i.p) + Nhóm 4: TX (60mg/kg, p.o x 14 ngày; n = 10) + TMT(2,4 mg/kg, i.p) + Nhóm 5: Memantine (MEM 2 mg/kg, i.p x 10 ngày; n = 10) + TMT (2,4 mg/kg, i.p) + Nhóm 6: Galantamin (Gal. 10 mg/ kg x 10 ngày, n = 10) + TMT (2,4 mg/kg, i.p) Định lượng Ach và AchE Nguyên tắc Sử dụng kit Amplex Red™ để định lượng Ach và AchE thông qua trung gian enzyme choline oxidase xúc tác các phản ứng. Ach sẽ bị chuyển thành choline dưới xúc tác của enzyme AchE, sau đó nó bị choline oxidase oxy hóa thành betain và H2O2. Dưới sự xúc tác của horseradish peroxidase (HRP), H2O2 phản ứng với 10 – acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red reagent) tạo chất có màu hồng. Đo cường độ huỳnh quang ở 563 nm. Cường độ huỳnh quang của Amplex Red™ tỷ lệ thuận với nồng độ Ach và AchE. Kết quả được biểu diễn là số nmol Ach/ mg protein và số mU AchE hoạt động/ mg protein. Xử lý và phân tích số liệu Số liệu được biểu diễn dưới dạng Mean ± SEM. Sử dụng phương pháp phân tích ANOVA 1 hoặc 2 yếu tố với Fisher’s PLST test. Ý nghĩa thống kê được xác định khi p < 0,05. MEM 2,0 mg/ kg, i.p Gal. 10 mg/ kg, i.p TX 30 mg/ kg, TX 60 mg/ kg, (p.o) TMT 2,4 mg/ kg, ip Ngày 1 Ngày 4 Ngày 7 14 ngày uống cao Bắt đầu các thử nghiệm hành vi Ngày 14 Khảo sát Ach và AchE Ngày 9 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 121 KẾT QUẢ Hình 2. Sự thay đổi thời gian chuột tìm thấy chân đế giữa các nhóm chứng (Sal. n = 8), TMT (TMT 2,4 mg/kg i.p chờ 7 ngày, n = 8), MEM (MEM 2,0 mg/ kg, i.p x 10 ngày, bắt đầu 3 ngày trước khi tiêm TMT, n = 8), các nhóm uống Cao TX (TX30 và TX60 tương ứng với 2 liều 30 và 60 mg/kg/ ngày x 14 ngày, bắt đầu trước khi tiêm TMT 7 ngày, n = 8) trong thử nghiệm ẩn chân đế (Hidden Platform Test) của mô hình MWM. ap<0,001 khi so với nhóm chứng, bp<0,01 khi so với nhóm TMT (Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 2 yếu tố với Fisher’s PLST test). Hình 3. Sự thay đổi số lần chuột bơi qua chân đế (Hình 3A) và thời gian chuột tìm thấy chân đế (Hình 3B) giữa các nhóm chứng (Sal. n = 8), TMT (Nhóm gây suy giảm trí nhớ bằng TMT 2,4 mg/ kg i.p chờ 7 ngày, n = 8), MEM (MEM 2,0 mg/ kg i.p x 10 ngày, bắt đầu 3 ngày trước khi tiêm TMT, n = 8), các nhóm uống Cao TX (TX 30 và 60 mg/kg/ngày x 14 ngày, bắt đầu trước khi tiêm TMT 7 ngày, n = 8) trong thử nghiệm thăm dò (Probe Test) và thử nghiệm trí nhớ hoạt động (Working Memory Test) của mô hình MWM. ap < 0,01 khi so với nhóm chứng, bp < 0,05, bbp < 0,01 khi so với nhóm TMT (Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 1 yếu tố với Fisher’s PLST test). 0 10 20 30 40 50 60 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Sal TMT MEM TX 30 TX 60 Th ờ i g ia n ch uộ t t ìm th ấy c hâ n đế (g iâ y) a b b 0 1 1 2 2 3 Sal TMT MEM TX 30 TX 60 A. Thử nghiệm thăm dò S ố lầ n ch uộ t b ơ i q ua c hâ n đế 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Sal TMT MEM TX 30 TX 60 B. Thử nghiệm trí nhớ hoạt động Th ờ i g ia n tìm th ấy c hâ n đế (g iâ y) a a b bb bb b bb bb Thử nghiệm ẩn chân đế Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 122 Nhận xét Sử dụng mô hình MWM để đánh giá tác dụng của Cao chiết TX đối với sự suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ do TMT gây ra, một số kết quả đã được ghi nhận: Khi so với nhóm Sal., nhóm TMT làm suy giảm khả năng học và nhớ của chuột thông qua sự gia tăng thời gian tìm thấy chân đế trong thử nghiệm ẩn chân đế, thử nghiệm thăm dò và thử nghiệm trí nhớ hoạt động. Đối với thử nghiệm ẩn chân đế, chỉ liều TX 60 mg/kg làm giảm thời gian tìm thấy platform so với nhóm TMT. Cả hai liều 30 mg/kg và 60 mg/kg Cao chiết TX đều thể hiện khả năng làm tăng số lần bơi qua chân đế (Thử nghiệm thăm dò) và làm giảm thời gian chuột tìm thấy chân đế (Thử nghiệm trí nhớ hoạt động). Điều này chứng tỏ liều thấp TX chỉ thể hiện tác dụng bảo vệ sự tổn thương khả năng học hỏi và ghi nhớ ở giai đoạn sau (trong thử nghiệm thăm dò và thử nghiệm trí nhớ hoạt động), trong khi liều cao hơn (60 mg/kg) thể hiện khả hiệu quả ở giai đoạn sớm của quá trình học tập thông tin mới. Hiệu quả của các nhóm Cao TX kém hơn nhóm đối chứng dương MEM, một chất đã được sử dụng trong điều trị bệnh alzheimer từ mức độ nhẹ tới nặng. Hình 4. Ảnh hưởng của Cao chiết TX trên sự thay đổi nồng độ Ach (hình 4A) và nồng độ AchE (hình 4B), sử dụng mô hình TMT. ap<0,001 khi so với nhóm chứng. bp < 0,001 khi so với nhóm TMT, cp < 0,05, ccp < 0,01 khi so với nhóm Gal. (Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 1 yếu tố với Fisher’s PLST test). Nhận xét Nồng độ Ach giảm và AchE tăng (trong vùng hippocampus) ở thời điểm 2 ngày sau khi tiêm TMT 2,4 mg/ kg. Điều trị bằng chất đối chứng dương Gal., chất ức chế cholinesterase, hoặc Cao TX 30 và 60 mg/ kg/ ngàyx 14 ngày đều thể hiện tác dụng làm tăng Ach và giảm AchE so với nhóm chỉ tiêm TMT. Điều này chứng tỏ Gal., Cao TX đều có khả năng bảo vệ sự tổn thương hệ cholinergic do TMT trong vùng hải mã não chuột. Khả năng bảo vệ sự tổn thương hệ cholinergic (làm tăng nồng độ Ach và giảm AchE) của nhóm điều trị bằng Gal. tốt hơn so với các nhóm điều trị với Cao TX với 2 liều thử nghiệm, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê. BÀN LUẬN Cao chiết búp non lá trà xanh (60 mg/kg, p.o x 14 ngày) đã thể hiện vai trò cải thiện sự suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ do TMT gây ra trên chuột thực nghiệm qua mô hình đánh giá hoạt động học và nhớ vị trí không gian 0 5 10 15 20 25 Sal. TMT Gal. TX30 TX60 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Sal. TMT Gal. HNT1 HNT2 N ồn g độ A ch (n m ol /m g pr ot ei n) H oạ t t ín h A ch E (m U /m g pr ot ei n) A. Acetylcholine B. Acetylcholinesterase a a b b,cc b,cc b b,c b,c TX30 TX60 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 123 Morris Water Maze (MWM), kết quả này phù hợp với khả năng bảo vệ sự tổn thương hệ cholinergic thông qua việc xác định nồng độ Ach và hoạt tính enzyme AchE. Điều này chứng tỏ khả năng cải thiện hoạt động nhận thức và nhớ của Cao TX có liên quan đến việc cải thiện sự tổn thương hệ cholinergic, kết quả này giúp định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo về khả năng bảo vệ tế bào não chống lại sự thoái hóa tế bào thần kinh dẫn đến các bệnh liên quan đến thoái hóa thần kinh như: Alzheimer, Parkinson, Hungtinton KẾT LUẬN Cao chiết từ búp non lá trà xanh có vai trò cải thiện sự suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ áp dụng mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin. Tác dụng này có liên quan đến khả năng bảo vệ sự tổn thương hệ cholinergic. Cảm ơn: Đề tài này được tài trợ kinh phí từ quỹ nghiên cứu khoa học của Sở Khoa Học và Công Nghệ TP.HCM (Năm 2010) TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Balaban C.D.(1998), “Trimethyltin-induced neuronal damage in the rat brain: Comparative studies using silver degeneration stains, immunocytochemistry and immunoassay for neuronotypic and gliotypic proteins”, Neuroscience, 26: 337-361. 2. Kavon R.Z. et al (2005), “Green Tea Epigallocatechin-3- Gallate (EGCG) Modulates Amyloid Precursor Protein Cleavage and Reduces Cerebral Amyloidosis in Alzheimer Transgenic Mice”, The Journal of Neuroscience, 25(38), 8807– 8814. 3. Vorhees V.C. & Williams T.M. (2006). Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols 1, - 848 – 858. 4. Yan X. (2009), “Green tea polyphenols inhibit cognitive impairment induced by chronic cerebral hypoperfusion via modulating oxidative stress”, The Journal of Nutritional Biochemistry, 21(8), 741-748.