Khảo sát môi trường nuôi cấy bacillus sinh carotenoid từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 189 KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY BACILLUS SINH CAROTENOID TỪ CÁC NGUỒN NGUYÊN LIỆU RẺ TIỀN Lê Minh Trí*, Trần Hữu Tâm**, Trần Thị Thanh Thảo*, Trần Cát Đông* TÓM TẮT Mở đầu: Bacillus là một chi vi khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Gần đây, một số chủng Bacillus đã được chứng minh có khả năng sinh carotenoid, một chất chống oxi hóa tự nhiên có khả năng ngăn ngừa một số bệnh ung thư. Mục tiêu: Khảo sát môi trường thay thế từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền với mục đích thay thế môi trường thương mại đắt tiền Tryptic Soy Broth (TSB) đối với 4 chủng Bacillus sinh carotenoid. Phương pháp: Tiến hành khảo sát các yếu tố nuôi cấy như nhiệt độ, pH, %NaCl thích hợp đối với 4 chủng Bacillus sinh carotenoid gồm AT22 (Bacillus licheniformis), AT14 (Bacillus infantis), HC28 (Bacillus vietnamensis), DD1.1 (Bacillus marisflavi). Sau đó khảo sát các môi trường thay thế từ các dịch chiết gạo, khoai tây, đậu nành, bắp và các phối hợp của các dịch chiết này ở tỷ lệ 1:1. Thí nghiệm được tiến hành dưới các điều kiện nuôi cấy đã khảo sát. Cuối cùng, xác định sự ảnh hưởng của khoáng chất như phosphat và kali lên sự phát triển của vi khuẩn bằng cách bổ sung K2HPO4 (2,5 g/l) vào môi trường thay thế đối với từng chủng Bacillus. Tổng số tế bào (cfu/ml) nuôi cấy trên các môi trường thử nghiệm được xác định và so sánh với môi trường TSB. Kết quả: Tất cả các chủng Baillus phát triển tốt nhất ở 30-35oC. Chủng AT22, DD1.1, và AT14 phát triển tốt nhất ở pH 8, và HC28 ở pH 7. Cả 2 chủng DD1.1 và AT14 phát triển tốt nhất với 1 % NaCl và 2 chủng AT22 và HC28 phát triển tốt khi không bổ sung NaCl. Chọn được bốn môi trường thay thế: dịch chiết đậu nành 20% + K2HPO4 đối với DD1.1 và HC28, dịch chiết đậu nành-khoai tây (20%) + K2HPO4 cho chủng AT22 và dịch chiết đậu nành-khoai tây (20%) cho chủng AT14. Kết luận: Đã tìm được môi trường thay thế rẻ tiền cho 4 chủng Bacillus sinh carotenoid và tổng số tế bào vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường thay thế cao gấp 2 lần trở lên so với môi trường thương mại TSB. Từ khóa: Bacillus; môi trường; carotenoid; thực phẩm chức năng. ABSTRACT ALTERNATIVE MEDIA FOR CAROTENOGENIC BACILLUS FROM CHEAP MATERIALS Le Minh Tri , Tran Huu Tam , Tran Thi Thanh Thao , Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 189 - 194 Background: The Bacillus bacteria were widely distributed in nature. Recently, some Bacillus species were demonstrated to have carotenoids, a natural antioxidant which is thought to be able to prevent some kinds of cancer. Objectives: To investigate alternative media derived from low cost materials for four carotenogenic Bacillus to replace Tryptic Soy Broth (TSB). Methods: Culture condition like pH, temperature and NaCl concentration for growing carotenogenic Bacillus strains including AT22 (Bacillus licheniformis), AT14 (Bacillus infantis), HC28 (Bacillus *Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược, khoa Dược, ĐH Y Dược TPHCM **Trung tâm Kiểm chuẩn xét nghiệm Tác giả liên lạc: PGS. TS Trần Cát Đông ĐT: 08. 38295641 – 127 Email: trancdong@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 190 vietnamensis), DD1.1 (Bacillus marisflavi) were investigated. Then, the alternative media from extracts of rice (R), potato (P), soybean (S), corn (C) and combination of these extracts at ratio 1:1 were investigated. Determine the influence of phosphate and potassium on the bacterial growth by adding K2HPO4 (2,5g/l) to the alternative media. The growth of these strains on alternative media was determined and compared with TSB by viable count method on Tryptic Soy Agar (TSA). Results: All four Bacillus strains grew optimally at 30-35 oC. The optimal pH value for AT22, DD1.1, and AT14 is 8 and for HC28 is 7. Suitable NaCl for growing DD1.1 and AT14 is 1 %. Strains AT22 and HC28 can grow optimally without adding NaCl. The alternative media were soy bean extract (20%) + K2HPO4 for DD1.1 and HC28; soy bean+potato extract (20%)+K2HPO4 for AT22 and soy bean + potato extract (20%) for AT14. Conclusions: Alternative media from low cost materials have been defined and cell number on alternative media was at least two times higher than Tryptic Soy Broth medium. Keywords: Bacillus; medium; carotenoid; functional food. ĐẶT VẤN ĐỀ Bacillus là chi vi khuẩn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến các chủng này do sự đa dạng về loài cũng như các lợi ích kinh tế. Một trong những ứng dụng quan trọng của Bacillus là dùng làm chế phẩm probiotic, ví dụ như Bacillus subtilis(4), để bổ sung trong thực phẩm ở một số nước Châu Âu. Bên cạnh đó, một vài chủng Bacillus đã được chứng minh có khả năng sinh carotenoid, một chất chống oxi hóa tự nhiên có khả năng ngăn chặn một số bệnh ung thư thông qua việc bảo vệ tế bào tránh các tổn thương do tia UV và các tác nhân oxi hóa khác(5). Các chủng Bacillus sinh carotenoid liên quan đến việc sản xuất các sắc tố đỏ, cam, vàng(5). Trong đó một số loài có khả năng sinh carotenoid ở cả dạng tế bào sinh dưỡng và bào tử(1). Những nghiên cứu trước đây trên Bacillus đều sử dụng môi trường thương mại đắt tiền như Tryptic Soy Broth (TSB). Vì vậy, hướng đến việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa carotenoid, cần phải tìm kiếm các môi trường nuôi cấy rẻ tiền để thay thế cho TSB và các điều kiện tăng trưởng tốt nhất. Trong báo cáo này, chúng tôi nghiên cứu môi trường thay thế đối với bốn chủng Bacillus gồm: Bacillus marisflavi, Bacillus licheniformis, Bacillus infantis và Bacillus vietnamensis dựa trên các nguồn nguyên liệu gạo, khoai tây, đậu nành và bắp với các thành phần dinh dưỡng đa dạng như carbon, protein. Đồng thời, khảo sát ảnh hưởng của khoáng lên các chủng Bacillus này vì nguồn khoáng đóng một vai trò quan trọng đối với các chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ môi trường biển(7). VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi khuẩn Các chủng Bacillus sử dụng trong nghiên cứu: AT22 (Bacillus licheniformis), AT14 (Bacillus infantis), HC28 (Bacillus vietnamensis), DD1.1 (Bacillus marisflavi) phân lập tại các vùng biển và ao tôm ở Việt Nam, do phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược ở Đại học Y Dược phân lập. Điều kiện phát triển Nhiệt độ phát triển thích hợp của bốn chủng Bacillus được khảo sát ở các mốc 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC , 45oC trên môi trường Tryptic Soy Broth (TSB). pH tăng trưởng thích hợp được khảo sát ở mức 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nồng độ NaCl phù hợp đối với sự phát triển của các chủng vi khuẩn được khảo sát ở các mức 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 9%, 11%. Sau 24 h nuôi cấy, xác định sự phát triển của chủng vi khuẩn bằng cách đo quang ở bước sóng 600 nm. Môi trường thay thế Môi trường thay thế được điều chế từ các dịch chiết đậu nành (Đ), gạo (G), bắp (B) và khoai tây (K), đây là các nguyên liệu phổ biến và có giá thành tương đối thấp ở Việt Nam. Các Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 191 nguyên liệu này có thành phần đa dạng do đó có thể dùng như nguồn cung cấp carbon, nitơ, vitamin và các khoáng chất(8). Các môi trường khảo sát được chuẩn bị theo phương pháp của Ekwealor(2) và được biến đổi để phù hợp với nghiên cứu. Chuẩn bị môi trường Nguyên liệu được cân 10 g, ngâm trong 100 ml nước và nấu trong 15 phút. Riêng đậu nành được ngâm trong nước nóng khoảng 30 phút để làm mềm hạt đậu và xay nhuyễn với 100 ml nước. Lọc thu dịch chiết, bổ sung nước vừa đủ 100ml. Như vậy, các dịch chiết sẽ có nồng độ là 10%. Tiến hành tương tự với dịch chiết có nồng độ 15 % và 20 %. Sau đó, phối trộn bốn loại dịch chiết ở tỉ lệ 1:1. Mười môi trường thí nghiệm được khảo sát cho mỗi chủng Bacillus được trình bày trong Bảng 1. Hấp tiệt trùng môi trường ở 121 oC/ 15 phút. Bảng 1. Các môi trường thí nghiệm Dịch chiết (%) Môi trường thử nghiệm 10 G B Đ K GB GĐ GK BĐ BK ĐK 15 G B Đ K GB GĐ GK BĐ BK ĐK 20 G B Đ K GB GĐ GK BĐ BK ĐK G: Dịch chiết gạo Đ: Dịch chiết đậu nành B: Dịch chiết bắp K: Dịch chiết khoai tây Các chủng Bacillus được nuôi trong 10 môi trường tại các điều kiện nuôi cấy thích hợp về nhiệt độ, pH và nồng độ muối. Chủng vi khuẩn được nhân giống trong 10 ml TSB, ủ qua đêm ở 37oC. Sau đó, dịch vi khuẩn được điều chỉnh về mật độ 108 CFU/ml và cấy vào các môi trường thử nghiệm với tỷ lệ 1%. Môi trường thử nghiệm ủ ở 37oC/ 24 giờ, lắc ở 200 vòng/phút. Số tế bào (CFU/ml) trên các môi trường thử nghiệm được xác định bằng phương pháp đếm sống trên TSA và so sánh với môi trường TSB. Khảo sát ảnh hưởng của muối khoáng Một số muối khoáng quan trọng đối với các vi khuẩn phân lập từ biển như KCl, K2HPO4, NaCl, CaCl2, MgSO4...(3,10). Nhằm mục đích so sánh với môi trường thương mại TSB để tìm ra môi trường thay thế với giá thành thấp hơn, chúng tôi sử dụng K2HPO4 với nồng độ tương tự trong thành phần TSB là 2,5 g/l để bổ sung vào môi trường thay thế. Xác định sự ảnh hưởng của K2HPO4 lên sự phát triển của vi khuẩn bằng cách so sánh với môi trường thay thế không bổ sung K2HPO4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Điều kiện nuôi cấy Chúng tôi nhận thấy các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl và môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của vi khuẩn. Kết quả cho thấy, các chủng Bacillus phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 30- 40oC và không phát triển ở nhiệt độ dưới 25oC hoặc trên 40oC. Tất cả các chủng phát triển tốt nhất ở 35oC. Cả bốn chủng Bacillus khảo sát đều phát triển trong khoảng pH 7-9, không sống được dưới pH 6. Chủng AT22, DD1.1, và AT14 phát triển tốt nhất ở pH 8 và HC28 ở pH 7. Tất cả các chủng đều không phát triển ở nồng độ NaCl trên 2 %. Cả 2 chủng DD1.1 và AT14 đều phát triển tốt nhất với 1 % NaCl và 2 chủng AT22 và HC28 phát triển tốt nhất khi không bổ sung NaCl. Đối với các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy một vài đặc điểm của các chủng vi khuẩn này khác với những kết quả đã được công bố ở các nghiên cứu trước như chủng Bacillus marisflavi(13) phát triển tốt nhất trong khoảng 2-5 % NaCl, và Bacillus vietnamensis ở 1 % NaCl(9). Sự khác biệt này có thể do các chủng Bacillus được phân lập tại các vùng biển nhiệt đới ở Việt Nam với sự khác biệt về địa lý cũng như về khí hậu. Môi trường thay thế Sau khi thử nghiệm 10 môi trường từ các dịch chiết đậu nành, khoai tây, bắp và gạo với tỉ lệ phối trộn 1:1, chúng tôi nhận thấy cả bốn chủng vi khuẩn sử dụng các nguồn nguyên liệu với hiệu quả khác nhau. Đồ thị ở Hình 1 cho thấy sự phát triển của 4 chủng Bacillus trên 10 môi trường thử nghiệm. Chẳng hạn chủng DD1.1 phát triển trên 5 loại môi trường như Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 192 dịch chiết khoai tây, dịch chiết đậu nành, dịch chiết gạo-khoai (1:1), dịch chiết đậu-bắp (1:1) và dịch chiết đậu-khoai (1:1). Trong số 5 môi trường trên, DD1.1 sử dụng dịch chiết đậu nành ở nồng độ 20% tốt nhất (1200 x 106 CFU/ml) cao gấp 171 lần so với trên môi trường TSB (7 x 106 CFU/ml) sau 24 h nuôi cấy. Chủng AT22 phát triển trên tất cả môi trường thử nghiệm ngoại trừ dịch chiết bắp và dịch chiết khoai tây, và phát triển tốt nhất trên môi trường dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1) ở nồng độ 20% (961,62 x 106 CFU/ml) cao hơn gấp 2 lần so với TSB (466,25 x 106 CFU/ml). Đối với chủng AT14 phát triển trên cả 10 môi trường thử nghiệm nhưng môi trường tốt nhất là dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1) ở nồng độ 20% (781,2 x 106 CFU/ml) cao hơn 4,5 lần so với TSB (139 x 106 CFU/ml). DD1.1 0 0 21.47 1200 0 25.94 0 0 0.017 321.5 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 G B K Đ GB GK GĐ BK BĐ KĐ TSB Môi trường thử nghiệm Số tế b ào x 1 0 6 C FU /m l HC28 0 0 0 8.13 0 0 2.15 0 0.005 1.45 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 G B K Đ GB GK GĐ BK BĐ KĐ TSB Môi trường thử nghiệm S ố tế b ào x 1 0 6 CF U /m l AT22 0 0.32 14.6 3.88 0.24 39.5 51 40 16.32 961.62 0 200 400 600 800 1000 1200 G B K Đ GB GK GĐ BK BĐ KĐ TSB Môi trường thử nghiệm Số tế b ào x 1 0 6 C FU /m l AT14 35.4 0.1 105 72.1 4.21 56.1 156.3 2.63 5.12 781.2 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 G B K Đ GB GK GĐ BK BĐ KĐ TSB Môi trường thử nghiệm S ố tế b ào x 1 0 6 CF U/ m l Nổng độ 10 % Nồng độ 15 % Nồng độ 20 % TSB Hình 1. Số tế bào (CFU/ml) của Bacillus trên 10 môi trường thử nghiệm và TSB. Dịch chiết của 10 môi trường thử nghiệm được khảo sát tại các nồng độ 10%, 15%, 20% Cuối cùng, chủng HC28 phát triển kém trên hầu hết các môi trường thử nghiệm, ngoại trừ dịch chiết đậu nành ở nồng độ 20 % là môi trường thay thế tốt nhất đối với chủng HC28 (8,13 x 106 CFU/ml) cao hơn 6 lần so với TSB (1,35 x 106 CFU/ml). Các chủng Bacillus sử dụng các nguồn nguyên liệu với hiệu quả khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm của từng loài. Trong đó, môi trường thay thế tốt nhất cho DD1.1 và HC28 là dịch chiết đậu nành, cả 2 chủng AT14 và AT22 đều phát triển tốt trong môi trường dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1). Những môi trường này đều chứa đậu nành với hàm lượng nitơ cao và các khoáng chất cần thiết thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn(6,13). Bên cạnh đó, đối với 2 chủng AT22 và AT14, dịch chiết khoai tây phù hợp cho sự phát triển của chúng vì nguồn nguyên liệu này đầy đủ cung cấp carbon, nitơ, vitamin và khoáng(12). Trên môi trường thay thế, các chủng Bacillus tạo sinh khối cao hơn so với môi trường TSB. Như vậy những nguồn nguyên liệu rẻ tiền này thật sự có tiềm năng ứng dụng trong việc sản xuất carotenoid ở quy mô lớn, mang lại hiệu quả kinh tế cao. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 193 Theo một số tác giả(7), một đặc điểm quan trọng của các chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường biển là nhu cầu về khoáng như: Na+, K+, Mg2+, và Ca2+ ...Vì vậy cần nghiên cứu sự ảnh hưởng của các ion này trong sự phát triển của 4 chủng Bacillus được phân lập từ môi trường biển. Nhưng với mục đích so sánh với môi trường TSB, chúng tôi chỉ sử dụng K2HPO4 trong nghiên cứu này. K2HPO4 cũng được sử dụng nhiều trong một số nghiên cứu như thành phần quan trọng đối với sự phát triển của vi khuẩn(11). Ngoài ra, K2HPO4 cũng đóng vai trò chất đệm để ổn định pH trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn. Hình 2 cho thấy sự phát triển của 4 chủng Bacillus thí nghiệm trong môi trường thay thế có bổ sung và không bổ sung 0,25 % K2HPO4. 1480 30.5 531 270.2 1530 405 282.75 1112 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 DD 1.1 AT 22 AT 14 HC 28 Chủng Bacillus Số tế b ào x 1 06 C FU /m l Môi trường thay thế Môi trường thay thế+K2HPO4 Hình 2. Sự phát triển của 4 chủng Bacillus trên môi trường thay thế (20 %) có và không có bổ sung muối khoáng K2HPO4 DD1.1 : Môi trường dịch chiết đậu nành AT22 : Môi trường dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1) AT14 : Môi trường dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1) HC28 : Môi trường dịch chiết đậu nành Chúng tôi nhận thấy khi bổ sung thêm K2HPO4 AT22 phát triển tốt với mật độ 405 x 106 CFU/ml cao hơn 13,5 lần so với môi trường không bổ sung K2HPO4. Mật độ tế bào của DD1.1 trên môi trường có K2HPO4 (1530 x 106 CFU/ml) cao hơn không đáng kể so với môi trường không bổ sung K2HPO4. HC28 phát triển tốt khi bổ sung K2HPO4 (1112 x 106 CFU/ml) cao hơn 4 lần so với môi trường không bổ sung (270,2 x 106 CFU/ml). Việc bổ sung phosphat còn đóng vai trò như đệm giúp ổn định pH môi trường đối với sự phát triển của tế bào(7). Cả 3 chủng AT22, HC28, và DD1.1 đều phát triển tốt nhất với 0,125 % K2HPO4 trong môi trường thay thế. Ngoại trừ chủng AT14 phát triển kém hơn 2 lần so với môi trường thay thế không bổ sung muối khoáng. Môi trường thay thế của 4 chủng Bacillus được thể hiện trong Bảng 2. Bảng 2. Môi trường thay thế của bốn chủng Bacillus Môi trường thay thế Chủng Bacillus Dịch chiết nguyên liệu K2HPO4 (0,25 %) DD1.1 Đậu nành (20%) + AT22 Đậu nành + Khoai tây (20%) + AT14 Đậu nành + Khoai tây (20%) – HC28 Đậu nành (20%) + KẾT LUẬN Bốn chủng Bacillus sinh carotenoid đều phát triển tốt nhất trên môi trường thay thế từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền. Trên môi trường thay thế, các chủng Bacillus này đạt sinh khối cao gấp 2 lần trở lên so với môi trường TSB. Cảm ơn: Nghiên cứu này sử dụng kinh phí từ dự án Colorspore (KBBE-2007-207948) cấp cho Trần Cát Đông Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 194 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Duc L. H., Fraser P. D., et al. (2006). Carotenoids present in halotolerant Bacillus spore formers. FEMS Microbiol Lett 255: 215-224. 2. Ekwealor L. A., Ebele O. A. (2003). Preliminary study of L- lysine production by Bacillus species using various agricultural by-products. Food / Nahrung. 47(4): 226-227. 3. Hidaka T. (1965). The specificity of mineral requirements of marine bacteria. Mem. Fac. Fish. 14: 127-180. 4. Hong H. A., Huang J. M., et al. (2008). The safety of Bacillus subtilis and Bacillus indicus as food probiotics. Journal of Applied Microbiology. 105: 510-520. 5. Khaneja R., Perez-Fons L., et al. (2010). Carotenoids found in Bacillus. Journal of Applied Microbiology. 108(6): 1889-1902. 6. Ko K. S., Oh W. S., et al. (2006). Bacillus infantis sp. nov. and Bacillus idriensis sp. nov., isolated from a patient with neonatal sepsis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 56: 2541-2544. 7. MacLeod R. A. (1968). On the role of inorganic ions in the physiology of marine bacteria. Adv. Microbiol. Sea. 1: 95-126. 8. Noah K., Bruhn D., et al. (2005). Surfactin Production from Potato Process Effluent by Bacillus subtilis in a Chemostat. Applied biochemistry and biotechnology 122(1-3): 465-474. 9. Noguchi H., Uchino M., et al. (2004). Bacillus vietnamensis sp. nov., a moderately halotolerant, aerobic, endospore-forming bacterium isolated from Vietnamese fish sauce. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54: 2117-2120. 10. Ruger H.J., Hentzschel G. (1980). Mineral Salt Requirements of Bacillus globisporus subsp. marinus Strains. Arch. Microbiol. (126): 83-86. 11. Sangkharak K., Prasertsan P. (2008). Nutrient optimization for production of polyhydroxybutyrate from halotolerant photosynthetic bacteria cultivated under aerobic-dark condition. Electronic Journal of Biotechnology. 11(3): 1-12. 12. Thompson DN F. S., Bala GA (2000). Biosurfactants from potato process effluents. Appl Biochem Biotechnol 84-86: 917- 930. 13. Yoon J.H., Kim I.G., et al. (2003). Bacillus marisflavi sp. nov. and Bacillus aquimaris sp. nov., isolated from sea water of a tidal flat of the Yellow Sea in Korea. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 53: 1297–1303.