Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống Saccharomyces cerevisae F28

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống Saccharomyces cerevisae F28 Quan sát vi thể và đại thể tế bào nấm men: Để quan sát hình thái tế bào nấm men ta tiến hành nhuộm đơn tế bào nấm men bằng cách làm tiêu bản giọt ép với thuốc nhuộm fushin. Kết quả chúng tôi quan sát được nấm men Saccharomyces cerevisae F28 có cấu tạo đơn bào, hình trứng, kích thước tương đối lớn. Hình 4.1 : Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi Tiếp theo để khảo sát tính thuần của giống chúng tôi tiến hành cấy ria, trải đĩa và tiến hành quan sát khuẩn lạc sau khi ủ được 2 ngày ở nhiệt độ 320C. Quan sát khuẩn lạc sau khi ủ chúng tôi nhận thấy giống Saccharomyces cerevisae F28 nhận được từ phòng thí nghiệm trường Đại Học Bách Khoa là giống thuần. Khuẩn lạc có màu trắng, mọc lồi trên môi trường thạch, đường kính vào khoảng 1,5-2mm. Hình 4.2: Khuẩn lạc của Saccharomyces cerevisae F28 (a) Trải đĩa (b) Cấy ria Chủng Saccharomyces cerevisae F28 được bảo quản để sử dụng trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm. Kết quả khảo sát nguyên liệu Bưởi sau khi ép tiến hành khảo sát các chỉ tiêu: pH, đường khử, đường tổng, acid citric, vitamin C. Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm hóa sinh, thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Bảng 4.1: Kết quả xác định một số chỉ tiêu của bưởi Năm Roi tại phòng thí nghiệm Chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình pH 4,05 4,05 4,05 4,05 Aci tổng(g/l) 5,41 5,42 5,41 5,41 Đường tổng (%) 2,56 2,56 2,57 2,56 Đường khử(%) 3,85 3,85 3,85 3,85 Vitamin C 572 563,2 572 572 Kết quả từ bảng 4.1 cho thấy độ acid và độ pH của nguyên liệu tương đối phù hợp với khả năng lên men của nấm men. Hàm lượng đường tổng, đường khử tương đối thấp không thuận lợi cho quá trình lên men. Do đó trong quá trình lên men cần bổ sung và điều chỉnh hàm lượng đường thích hợp để quá trình lên men đạt hiệu quả. Kết quả quá trình lên men rượu 4.3.1 Thí nghiệm khảo sát độ pha loãng của dịch bưởi trước khi lên men rượu Dịch bưởi sau khi ép tiến hành kiểm tra các thông số: 0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, cảm quan. Sau đó tiến hành pha loãng mẫu và kiểm tra các thông số như trên để từ đó chọn ra độ pha loãng thích hợp nhằm đạt hiệu quả cao trong các quá trình lên men sau này. Ở đây chúng tôi tiến hành pha loãng dịch bưởi ở các độ pha loãng: 1:0; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4 (dịch bưởi : nước). Dịch bưởi sau khi pha loãng tiến hành kiểm tra các thông số và thu được kết quả trong bảng sau: Bảng 4.2: Ảnh hưởng của độ pha loãng của dịch bưởi đến quá trình lên men rượu Độ pha loãng (dịch bưởi : nước) 1:0 1:1 1:2 1:3 1:4 Hàm lượng chất khô (0Bx) 12 6 4 3 2 Đường tổng(g/l) 0,213 0,190 0,141 0,132 0,130 pH 4,05 4,1 4,12 4,27 4,3 Acid tổng(g/l) 7,68 3,45 1,85 1,34 1,12 Từ kết quả nhận được ở bảng 4.2 chúng tôi nhận thấy đối với dịch bưởi càng pha loãng thì hàm lượng đường tổng thấp, 0Bx càng thấp. Đối với dịch bưởi nguyên chất thì có mùi thơm dịu của bưởi, vị chua ngọt hài hòa, 0Bx cao, hàm lượng đường cao. Dịch bưởi sau khi pha loãng thì hàm lượng đường giảm, 0Bx thấp, vị nhạt. Xét các thông số ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu thì ứng với dịch bưởi nguyên chất và dịch bưởi pha loãng theo tỷ lệ 1:1 là thích hợp để tiến hành lên men rượu. Tuy nhiên xét về tính kinh tế thì chúng tôi chọn dịch bưởi pha loãng theo tỷ lệ 1:1 để tiến hành lên men cho những thí nghiệm sau là hợp lý và hiệu quả. 4.3.2 Thí nghiệm khảo sát thời gian lên men chính rượu bưởi Sau khi kết thúc quá trình lên men chính nấm men thường giảm hoặc ngừng phân giải đường thành rượu và khí CO2, lúc này hầu hết tế bào nấm men sẽ chết và xảy ra hiện tượng tự phân làm tăng chất dinh dưỡng. Đây là điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật xâm nhiễm và phát triển. Do đó việc xác định thời gian lên men thích hợp là rất quan trọng nhằm tiết kiệm thời gian lên men, hạn chế vi sinh vật tạp nhiễm cũng như thu được độ rượu cao. Dịch bưởi sau khi ép tiến hành pha loãng theo tỷ lệ 1:1, điều chỉnh 0Bx=20, chỉnh pH về pH=4,5, bổ sung Na2SO3 với hàm lượng 50mg/l. Sau đó bổ sung giống với tỷ lệ 10% tiến hành lên men và kiểm tra các thông số 0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, độ rượu theo thời gian (ngày). Mỗi ngày nên xả bớt lượng khí CO2 tạo ra để tránh hiện tượng gây vỡ bình và khí CO2 nhiều sẽ ức chế nấm men phát triển. Sau 8 ngày lên men kết quả nhận được thể hiện ở bảng 4.3. Bảng 4.3: Biến động của quá trình lên men theo thời gian (ngày) Thời gian(ngày) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Hàm lượng chất khô (0Bx) 20 15 11 8 7 6 5 5 5 pH 4,5 4,03 3,80 3,61 3,59 3,80 3,86 3,88 4,0 Đường tổng (g/l) 130,5 50,11 40,21 20,33 3,55 3,23 2,95 2,84 2,82 Acid tổng (g/l) 3,45 3,85 4,10 4,50 4,71 4,42 4,29 4,12 4,08 Độ rượu (%V) 0 3,1 6,23 8,0 9,0 10,23 10,85 11 11 Dựa vào kết quả ghi nhận được chúng tôi thấy theo thời gian hàm lượng chất khô và đường tổng giảm dần. Điều này chứng tỏ nấm men đã sử dụng đường làm cơ chất để sinh trưởng và phát triển và tạo ra sản phẩm là khí CO2, các acid hữu cơ và độ rượu. Ban đầu pH giảm dần theo thời gian từ ngày đầu tiên đến ngày thứ tư, sau đó từ ngày thứ năm trở đi pH lại tăng lên. Điều này có thể giải thích như sau: trong quá trình lên men nấm men sử dụng cơ chất để sinh trưởng phát triển tạo ra sản phẩm là cồn, CO2, và các acid hữu cơ. Thời gian đầu nấm men sinh trưởng phát triển mạnh nên lượng CO2 và các acid hữu cơ tạo ra nhiều làm cho pH giảm. Bên cạnh đó lượng acid tổng cũng tăng lên. Từ ngày thứ 5 trở đi chúng tôi nhận thấy pH lại có xu hướng tăng lên, điều này có nghĩa là lượng CO2 tạo ra không còn nhiều như lúc đầu, hơn nữa lượng CO2 ban đầu cũng được xả bỏ bớt để tránh hiện tượng vỡ bình và lượng CO2 nhiều quá sẽ ức chế nấm men phát triển, do đó mà pH môi trường có xu hướng tăng nhẹ. Dựa vào bảng 4.3 và biểu đồ 4.1 chúng tôi nhận thấy từ ngày đầu tiên đến ngày thứ tư hàm lượng đường tổng, hàm lượng chất khô giảm mạnh, đồng thời nồng độ rượu tăng mạnh đến ngày thứ năm. Từ ngày thứ năm trở đi hàm lượng đường tổng giảm dần và nồng độ rượu tăng dần đến ngày thứ bảy thì nồng độ rượu đạt được là cao nhất. 20 15 11 8 7 6 5 5 5 0 3,1 6,23 8 9 10,23 10,85 11 11 0 5 10 15 20 25 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Thời gian (ngày) Hàm lượng chất khô (0Bx) Độ rượu (%V) Biểu đồ 4.1: Mối quan hệ của 0Bx, độ rượu theo thời gian Từ kết quả thu được ở trên chúng tôi có thể kết luận thời gian lên men chính tốt nhất là 7 ngày. Đây là cơ sở để tiến hành lên men cho những thí nghiệm sau. 4.3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men của dịch bưởi Nồng độ H+ của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của nấm men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong một môi trường pH nhất định. Đối với các loại nấm men để sản xuất rượu vang, pH thích hợp nhất để chúng hoạt động là từ 4 đến 6. Nếu pH thấp hơn thì nấm men có thể thay đổi hình thái, tế bào nhỏ hơn, khả năng lên men của nấm men sẽ giảm. Do đó việc xác định giá trị pH thích hợp là điều kiện cần thiết nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình lên men. Dịch bưởi sau khi ép tiến hành pha loãng theo tỷ lệ 1:1, điều chỉnh 0Bx=20, bổ sung Na2SO3 với hàm lượng 50mg/l, chuẩn bị 4 bình chứa dịch bưởi dùng lên men. Điều chỉnh pH ở 4 bình lần lượt về các giá trị pH=3,5; 4,0; 4,5; 5,0, sau đó bổ sung giống với tỷ lệ giống 10%. Tiến hành lên men và kiểm tra các thông số 0Bx, pH, đường tổng, acid tổng và độ rượu sau 7 ngày lên men. Số liệu thu được ghi nhận ở bảng 4.4. Bảng 4.4: Biến động của quá trình lên men theo các giá trị pH pH ban đầu 3,5 4 4,5 5,0 Hàm lượng chất khô (0Bx) 6,5 5 6 6,5 pH sau 7 ngày lên men 3,45 3,84 4,04 4,27 Đường tổng (g/l) 5,23 2,45 2,87 3,14 Acid tổng (g/l) 7,68 6,272 4,864 1,792 Độ rượu (%V) 9,56 10,72 10,25 9,84 Dựa vào bảng số liệu nhận được ta thấy sau 7 ngày lên men giá trị 0Bx ứng với 4 giá trị pH ban đầu có sự chênh lệch đáng kể. Ta nhận thấy ở pH=4 hàm lượng chất khô còn lại ít nhất. Mặc khác lượng đường còn sót lại cũng ít nhất điều này chứng tỏ ở giá trị pH= 4,0 thì khả năng lên men là tốt nhất và độ rượu thu được cao nhất so với các giá trị pH còn lại. Dựa vào biểu đồ 4.2 ta thấy ở giá trị pH =3,5 lượng chất khô còn lại cao nhất đồng thời lượng cồn thu được thấp nhất so với các giá trị pH còn lại. Điều này chứng tỏ ở pH =3,5 nấm men bị ức chế một phần nào đó do đó hoạt động kém hiệu quả, hàm lượng đường còn sót lại nhiều và lượng cồn thu được không cao. Trái lại ở pH=4,0 nấm men hoạt động rất mạnh, lượng đường sót lại còn rất ít, hơn nữa độ rượu thu được cao hơn hẳn so với các giá trị pH còn lại. 6,5 5 6 6,5 9,56 10,72 10,25 9,84 0 2 4 6 8 10 12 3,5 4 4,5 5 pH Hàm lượng chất khô (0Bx) Độ rượu (%V) Biểu đồ 4.2: Mối quan hệ của 0Bx, độ rượu theo các giá trị pH khảo sát Từ kết quả nhận được ở trên chúng tôi chọn giá trị pH = 4,0 là giá trị pH thích hợp để tiến hành khảo sát các thông số còn lại trong các thí nghiệm sau. 4.3.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất khô đến khả năng lên men Nấm men sử dụng đường là nguồn cơ chất chủ yếu để sinh trưởng phát triển và tạo ra sản phẩm chính là cồn, các acid hữu cơ và CO2. Nếu nồng độ đường trong dịch lên men cao thì quá trình lên men vẫn xảy ra nhưng tốc độ chậm, và tốc độ lên men dường như ngừng lại khi nồng độ đường vượt quá 30%. Lý do là nếu nồng độ đường của dịch lên men quá cao sẽ gây ra áp suất thẩm thấu lớn, khi đó nó sẽ phá hủy trạng thái bình thường của nấm men, hậu quả là nấm men bị ức chế, cồn etylic sản xuất ra được ít, rượu nhạt. Còn nếu hàm lượng đường quá ít thì độ rượu thu được sẽ thấp và rượu vang dễ bị hỏng do nhiễm vi sinh vật. Do đó việc xác định hàm lượng đường thích hợp để lên men là yếu tố cần thiết mang lại hiệu quả trong quá trình lên men rượu. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất khô đến khả năng lên men rượu chúng tôi tiến hành khảo sát với ở 4 giá trị 0Bx khác nhau: 18; 20; 22; 24. Dịch bưởi sau khi ép đem lọc sau đó pha loãng với tỷ lệ 1:1, chuẩn bị 4 bình chứa dịch bưởi dùng lên men. Điều chỉnh 0Bx ở 4 bình lần lượt về các giá trị 0Bx=18; 20; 22; 24, bổ sung tỷ lệ giống 10%, bổ sung Na2SO3 với hàm lượng 50mg/l, chỉnh pH về giá trị pH = 4,0. Tiến hành lên men và kiểm tra các thông số 0Bx, pH, đường tổng, acid tổng và độ rượu sau 7 ngày lên men. Số liệu thu được ghi nhận ở bảng 4.5. Bảng 4.5: Biến động của quá trình lên men theo hàm lượng chất khô Hàm lượng chất khô ban đầu (0Bx) 18 20 22 24 Hàm lượng chất khô sau 7 ngày (0Bx) 6 6 6 7 pH 3,84 3,75 3,75 3,70 Đường tổng (g/l) 2,45 1,75 2,13 2,65 Acid tổng (g/l) 4,0 4,08 4,35 4,99 Độ rượu (%V) 8,0 10,45 10,50 10,50 Sau 7 ngày lên men ở mẫu 180Bx lượng đường còn lại khá nhiều (2.45g/l) so với ba mẫu còn lại đồng thời lượng cồn tạo ra rất thấp. Do đó chúng tôi không chọn giá trị 0Bx = 18 để lên men. Ở ba mẫu 0Bx = 20, 0Bx = 22 và 0Bx = 24 chúng tôi nhận thấy lượng đường còn lại trong mẫu 240Bx khá cao (2,65g/l), mặc khác lượng cồn tạo ra chênh lệch với hai mẫu 200Bx và 220Bx là không lớn lắm. Do đó chúng tôi cũng không chọn giá trị này để lên men. Dựa vào biểu đồ 4.3 chúng tôi nhận thấy ở mẫu 220Bx hàm lượng chất khô còn lại là ít nhất và độ cồn thu được là cao nhất. Do đó chúng tôi chọn giá trị 0Bx=22 là giá trị tối ưu cho các thí nghiệm sau. 6 6 6 7 8 10,45 10,5 10,5 0 2 4 6 8 10 12 18 20 22 24 Hàm lượng chất khô (0Bx) Hàm lượng chất khô (0Bx) Độ rượu (%V) Biểu đồ 4.3: Mối quan hệ của 0Bx, độ rượu theo các giá trị 0Bx khảo sát 4.3.5 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng lên men Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men diễn ra tốt và hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm cũng tốt hơn. Nếu lượng tế bào nấm men cho vào quá ít thì tốc độ lên men chậm, sinh khối tế bào nấm men quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ cho nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ chết dần, sản phẩm sinh ra mùi lạ, vị lạ đồng thời phí đi một lượng đáng kể men không có ích. Do đó việc xác định tỷ lệ nấm men thích hợp là rất cần thiết. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ men giống cho vào dịch lên men, đầu tiên chúng tôi tiến hành ép bưởi lấy dịch sau đó lọc và pha loãng theo tỷ lệ 1:1, tiến hành lên men với pH = 4,0, hàm lượng chất khô là 220Bx, bổ sung Na2SO3 50mg/l. Sau đó bổ sung giống với tỷ lệ 5%, 7%, 10%, 12% với chất lượng dịch nhân giống là 1,3tế bào/ml. Lên men ở nhiệt độ phòng và tiến hành kiểm tra các thông số sau 7 ngày lên men. Kết quả sau 7 ngày lên men được thể hiện trong bảng sau: Bảng 4.6: Biến động của quá trình lên men theo các tỷ lệ giống khảo sát Tỷ lệ giống (%) 5 7 10 12 Hàm lượng chất khô sau 7 ngày (0Bx) 6 6 6 5,5 pH 3,62 3,80 3,75 3,50 Đường tổng (g/l) 3,02 2,96 2,12 1,93 Acid tổng (g/l) 4,45 4,03 4,26 4,55 Độ rượu (%V) 9,0 10,15 10,85 10,90 6 6 6 5,5 9 10,15 10,85 10,9 0 2 4 6 8 10 12 5 7 10 12 Tỷ lệ giống (%) Hàm lượng chất khô sau 7 ngày (0Bx) Độ rượu (%V) Biểu đồ 4.4: Mối quan hệ của 0Bx, độ rượu theo các tỷ lệ giống khảo sát. Dựa vào bảng 4.6 và biểu đồ 4.4 cho thấy khi tăng hàm lượng nấm men bổ sung vào dịch lên men thì độ rượu cũng tăng lên. Ở tỷ lệ giống 5% và 7% thì lượng đường còn sót lại nhiều thể hiện ở giá trị đường tổng và 0Bx, đồng thời độ rượu tạo ra thấp. Cũng ở tỷ lệ nấm men này quá trình lên men dễ bị ảnh hưởng của sự tấn công bởi vi sinh vật khác. Đối với thí nghiệm bổ sung 10% và 12% tỷ lệ giống thì tổng số tế bào có trong dịch rượu bưởi cũng nhiều hơn so với tỷ lệ giống 5% và 7%. Do đó sinh khối tế bào nấm men tăng nhanh, quá trình lên men diễn ra nhanh và triệt để hơn. Độ rượu tạo ra cũng cao hơn. Ở tỷ lệ nấm men 12% thì độ rượu tạo ra cao hơn ở tỷ lệ 10%, tuy nhiên cao hơn không đáng kể. Do đó, chúng tôi chọn tỷ lệ nấm men bổ sung là 10% để làm cơ sở cho thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm lên men tối ưu Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men chúng tôi tiến hành lên men rượu với các thông số tối ưu đã thu nhận được từ các thí nghiệm trên. Bưởi sau khi ép lấy dịch bưởi đem lọc rồi pha loãng theo tỷ lệ 1:1, điều chỉnh 0Bx=22, bổ sung Na2SO3 với hàm lượng 50mg/l, chỉnh pH=4,0, bổ sung tỷ lệ nấm men 10%. Sau đó chúng tôi tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng. Kết thúc quá trình lên men chúng tôi thu nhận được kết quả trong bảng sau: Hàm lượng chất khô (0Bx) pH Đường tổng (g/l) Acid tổng (g/l) Độ rượu (%V) 5,5 3,85 1,65 4,90 10,98 Bảng 4.7: Kết quả của quá trình lên men tối ưu Từ kết quả nhận được chúng tôi thấy sau khi tối ưu các thông số và tiến hành lên men chúng tôi thu được rượu bưởi với độ rượu cao đồng thời hàm lượng đường tổng còn lại rất ít. Điều này chứng tỏ khả năng lên men rượu với các thông số tối ưu mang lại hiệu quả. Tuy nhiên trong quá trình lên men do có sự biến động nhiệt độ giữa các lần thí nghiệm nên kết quả giữa các lần thí nghiệm có sự thay đổi khác nhau, vì chúng tôi thực hiện các thí nghiệm ở nhiệt độ phòng chưa khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ nên vẫn chưa đạt được kết quả tốt nhất. Mặc khác do chúng tôi chưa có điều kiện lặp lại tất cả các thí nghiệm nên chưa thể khắc phục được các sai số trong thực nghiệm và ít nhiều có ảnh hưởng đến kết quả. Tuy nhiên, qua khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu bưởi chúng tôi đã đưa ra được các thông số như sau: tỷ lệ pha loãng dịch bưởi là 1:1; thời gian lên men chính tốt nhất là 7 ngày; pH ban đầu thích hợp là 4,0; hàm lượng chất khô thích hợp là 220Bx; tỷ lệ nấm men thích hợp là 10%. Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm rượu bưởi Sản phẩm đã được đánh giá bởi 8 thành viên có kết quả đánh giá cảm quan tương đồng nhau. Kết quả được thể hiện trong bảng sau: Cảm quan viên (CQV) Các chỉ tiêu Độ trong và màu sắc Mùi Vị CQV 1 CQV 2 CQV 3 CQV 4 CQV 5 CQV 6 CQV 7 CQV 8 4 4 5 4 4 5 5 4 4 4 4 5 4 4 4 4 4 4 5 4 5 4 5 5 Tổng 35 33 36 TB chưa có trọng lượng 4,38 4,13 4,5 Hệ số trọng lượng 0,8 1,2 2 TB có trọng lượng 3,5 4,96 9 Tổng 17,46 Nhận xét: Với tổng số điểm đạt được là 17,46 thì sản phẩm đạt loại khá, kết quả đánh giá cảm quan cho thấy hầu hết đều đánh giá khá tốt về màu, mùi, vị và độ trong của sản phẩm.