Khảo sát mức độ nhạy cảm của Candida spp. với Fluconazol và Ketoconazol

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 450 KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHẠY CẢM CỦA CANDIDA SPP. VỚI FLUCONAZOL VÀ KETOCONAZOL Nguyễn Thị Thúy Anh**, Nguyễn Vũ Giang Bắc*, Nguyễn Đinh Nga* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Việc sử dụng thường xuyên một số kháng sinh kháng nấm trong điều trị là nguyên nhân gây ra sự kháng thuốc ở Candida albicans là vi nấm chiếm tỉ lệ cao trong các ca nhiễm nấm. Ngoài ra, theo một số báo cáo gần đây tỉ lệ Candida non albicans gây bệnh ngày càng tăng. Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát mức độ nhạy của các chủng Candida gây bệnh ở niêm mạc miệng và âm đạo với ketoconazol và fluconazol. Vật liệu và phương pháp: sử dụng phương pháp khuếch tán theo hướng dẫn của NCCLS M44-A và phương pháp pha loãng theo hướng dẫn của NCCLS M27-A2 nhưng sử dụng môi trường Mueller Hinton bổ sung glucose và xanh methylen (MHB-GMB) trong thí nghiệm để xác định mức độ nhạy của 30 chủng Candida albicans và 36 chủng Candida non albicans với ketoconazol và fluconazol. Kết quả: Kết quả nhận được từ cả hai phương pháp đều cho thấy tỉ lệ kháng thuốc của các chủng Candida chưa cao. Phương pháp pha loãng sử dụng môi trường Mueller Hinton bổ sung xanh methylen giúp đánh giá được các chủng nhạy tùy thuộc liều với MIC cao hơn mức nhạy. Kết luận: Để sử dụng liều điều trị bệnh Candida thích hợp cần xác định MIC để phát hiện các chủng nhạy tùy thuộc liều. Từ khóa: Candida albicans, Candida non albicans, MIC, MHA-GMB, MHB-GMB. ABSTRACT STUDY ON THE ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY OF CANDIDA SPP. TO FLUCONAZOLE AND KETOCONAZOL. Nguyen Thi Thuy Anh, Nguyen Dinh Nga, Nguyen Vu Giang Bac * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 450 - 454 Background: Over the past few decades, Candida spp. are the most common of fungal pathogens and the emergence of drug resistant Candida spp. become an important problem in therapy. Objective: To determine the antifungal susceptibility of Candida isolates to ketoconazole and fluconazole. Material and methods: The antifungal activity against 66 trains of Candida spp. of ketoconazole and fluconazole were determine by the Disk diffusion method and the dilution method according to the guidline of NCCLS M44-A and M27-A2. Outcome: MIC values and the inhibited zone sizes address that Candida spp. were sensible to fluconazole and ketoconazole in high ratio. Conclusion: Disk diffusion test are easy to set up and provide an screening test. However, it is better to confirm by dilution method. Results outcome in the dilution method used MHB-BMB was agree to which of disk diffusion method. Key words: Candida albicans, Candida non albicans, MIC, MHA-GMB, MHB-GMB. *Đại học Y Dược TP. HCM, Khoa Dược **Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP. HCM Tác giả liên hệ: PGS. TS. Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908 83 69 69 Email: nganguyendinh@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 451 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh do vi nấm gây ra gia tăng nhanh chóng bắt đầu từ thập niên 1990 đến nay, đặc biệt ở người suy giảm miễn dịch. Candida spp. là vi nấm gây bệnh thường gặp nhất, với Candida albicans chiếm tỉ lệ cao trên 80%, tuy nhiên các báo cáo gần đây cho thấy các bệnh nhiễm nấm với Candida non albicans chiếm tỉ lệ tăng dần(2,6). Amphophtericin B, fluconazol, itraconazol và ketoconazol là những thuốc thường dùng điều trị bệnh do Candida spp., ngoài ra còn có các thuốc mới, ít độc tính hơn, như amphophtericin B cấu trúc lipid, voriconazol, caspofungins, micafungins nhưng giá thành cao và chưa phổ biến ở Việt Nam. Vì vậy ketoconazol, itraconazol, nhất là fluconazol được các bác sĩ lâm sàng lựa chọn nhiều. Do các thuốc kháng nấm nhóm azole kể trên được sử dụng thường xuyên trong điều trị, Candida spp. trở nên đề kháng với các azole và đây là nguyên nhân làm kéo dài thời gian điều trị hoặc thất bại trong điều trị các bệnh nhiễm do Candida. Trong phạm vi đề tài chúng tôi khảo sát mức độ nhạy cảm của Candida spp. với ketoconazol và fluconazol là 2 trong 3 thuốc thường được lựa chọn trong điều trị ở Việt Nam. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 66 chủng Candida spp. phân lập từ bệnh nhân nhiễm Candida niêm mạc miệng và âm đạo từ 2008 đến 2009. Dựa vào các đặc điểm nuôi cấy trên môi trường Sabouraud, thạch bột ngô, Czapek – Dox bổ sung 1% Tween 80 và huyết thanh đã xác định 30 chủng thuộc Candida albicans và 36 chủng thuộc Candida non albicans. Candida albicans 10231 được sử dụng làm chủng đối chứng. Mức độ nhạy với fluconazol của Candida albicans 10231 xác định bằng phương pháp khuếch tán, môi trường MHA- GMB theo hướng dẫn của NCCLS M44-A cho đường kính vòng ức chế từ 43-45 mm. MIC = 2 μg/ml khi xác định bằng phương pháp pha loãng trên môi trường MHB-GMB. Chất kháng nấm Ketoconazole chất chuẩn đối chiếu, lô 50030107, hàm lượng 99,63%. Fluconazole USP, lô FLU-09 12 085, hàm lượng 99,41%. Môi trường: Mueller Hinton Broth (Merck), Mueller Hinton Agar (Merck) và Czapeck-Dox ((Merck). Phương pháp nghiên cứu(2,4,5) Các chủng Candida spp. được xác định mức độ nhạy với ketoconazol và fluconazol với hai phương pháp: Phương pháp khuếch tán theo đúng hướng dẫn NCCLS M44, sử dụng đĩa giấy tẩm fluconazol 25 μg và ketoconazol 15 μg. Môi trường thạch Mueller Hinton bổ sung 2% glucose và xanh methylen 5 μg/ml (MHA- GMB). Thử nghiệm được ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Đường kính vòng ức chế được đọc ở mức 80% sự ức chế. Phương pháp pha loãng: nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của vi nấm (MIC) được thực hiện trong môi trường lỏng Mueller Hinton bổ sung 2% glucose và xanh methylen 5 μg/ml (MHB-GMB). Kết quả được xác định bằng mắt thường, sau 24 và 48 giờ ủ ở 37 oC. KẾT QUẢ Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với fluconazol và ketoconazol xác định bằng phương pháp khếch tán Bảng 1. Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với fluconazol xác định bằng phương pháp khuếch tán. Đường kính vòng ức chế (mm)Chủng nấm Số chủng ≥ 19 15-18 ≤ 14 Candida albicans 30 29 0 1 Candida non albicans 36 33 2 1 Theo hướng dẫn của NCCLS M44-A, dựa vào đường kính vòng ức chế để qui định mức độ nhạy cảm của Candida spp. với fluconazol, thực hiện trên môi trường MHA-GMB được chia thành 3 mức, nhạy (S) khi đường kính vòng ức chế ≥ 19 mm; nhạy tùy thuộc liều Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 452 (SDD) khi đường kính vòng ức chế từ 15-18 mm và đề kháng (R) với đường kính vòng ức chế ≤ 14 mm. Bảng 2. Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với ketoconazol xác định bằng phương pháp khuếch tán Đường kính vòng ức chế (mm) Chủng nấm Số chủng ≥ 30 23-29 ≤ 22 Candida albicans 8 6 1 1 Candida non albicans 12 9 0 3 Đối với ketoconazole, các chủng phân lập được xác định là nhạy (S) khi đường kính vòng ức chế ≥ 30 mm; nhạy tùy thuộc liều (SDD) khi đường kính vòng ức chế từ 23-29 mm và đề kháng (R) với đường kính vòng ức chế ≤ 22 mm. Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với fluconazol và ketoconazol xác định bằng phương pháp pha loãng Mức độ nhạy của Candida spp. được xác định bằng phương pháp pha loãng, sử dụng môi trường MHB-GMB. Kết quả được xác định sau 24 giờ và 48 giờ ủ ở 37 oC. Điểm dừng đọc kết quả được xác định ở 80% ức chế sự phát triển của vi nấm. Bảng 3. Nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp. của fluconazol Khoảng MIC µg/ml ≤ 8 16-32 ≥ 64 Chủng nấm Số chủng 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ Candida albicans 30 29 29 1 0 0 1 Candida non albicans 36 19 12 16 11 1 13 Bảng 4. Nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp. của ketoconazol. Khoảng MIC µg/ml ≤ 8 8-16 ≥ 16 Chủng nấm Số chủng 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ Candida albicans 21 16 16 5 5 0 0 Candida non albicans 12 12 12 0 0 0 0 So sánh mức độ nhạy cảm của Candida spp. với ketoconazol và fluconazol xác định bằng phương pháp pha loãng và phương pháp khuếch tán Theo hướng dẫn của NCCLS M27-A2, mức độ kháng nấm men của fluconazol và ketoconazol được qui định như sau: Fluconazole: nhạy (S) khi MIC ≤ 8 μg/ml; trung gian (SDD) khi MIC từ 16-32 μg/ml; và đề kháng (R) khi MIC ≥ 64 μg/ml. Ketoconazol: nhạy (S) khi MIC < 8 μg/ml; trung gian (SDD) khi MIC từ 8- 16μg/ml; và đề kháng (R) khi MIC > 16 μg/ml Dựa vào đường kính vòng ức chế và nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp., mức độ nhạy của Candida spp. với fluconazol và ketoconazol được tóm tắt ở bảng 5 và bảng 7. Bảng 5. So sánh mức độ nhạy cảm của Candida spp. với fluconazol và ketoconazol. Mức độ nhạy cảm với chất kháng nấm (%) S SDD R Chủng nấm Phương pháp Thời gian đọc kết quả FLC KTZ FLC KTZ FLC KTZ Khuếch tán 24h 96,67 75,00 0 12,5 3,33 12,5 24h 96,67 76,19 0 23,81 3,33 0 Candida albicans Pha loãng 48h 96,67 76,19 0 23,81 3,33 0 Khuếch tán 24h 91,67 75,00 5,55 0 2,78 25,00 24h 52,78 100 44,44 0 2,78 0 Candida non albicans Pha loãng 48h 30,55 100 30,55 0 36,11 0 S: nhạy; SDD: nhạy cảm tùy thuộc liều; R: đề kháng; FLC: fluconazol; KTZ: ketoconazol Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 453 BÀN LUẬN Mức độ nhạy cảm của Candida spp. với fluconazol và ketoconazol Khi xác định mức độ nhạy của Candida spp. với ketoconazol và fluconazol bằng phương pháp khuếch tán, theo đúng hướng dẫn và bàn luận kết quả của NCCLS M44-A, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ kháng thuốc của các chủng Candida albicans và Candida non albicans phân lập từ niêm mạc miệng và âm đạo bệnh nhân không cao, 1/30 và 1/36 với fluconazol; 1/8 và 3/12 với ketoconazol (bảng 1 và 2). Kết quả nhận được từ phương pháp pha loãng cũng cho kết quả tương tự. So với công bố của Trần Phủ Mạnh Siêu và Hồ Quang Thắng(6), sự đề kháng với ketoconazol và fluconazol của các chủng Candida albicans và C. tropicalis phân lập từ phết họng, đàm, dịch rửa phế quản, nước tiểu chiếm tỉ lệ rất cao từ 26,67% đến 100%. Tuy nhiên do các tác giả không cho biết đã thực hiện kháng sinh đồ ở môi trường nuôi cấy nào, nồng độ kháng sinh trong mỗi đĩa giấy và tiêu chuẩn xác định mức độ nhạy hoặc kháng thuốc, nên khó tìm ra lý do của sự khác biệt này. So sánh giữa phương pháp pha loãng và phương pháp khuếch tán, Phương pháp khuếch tán là phương pháp được sử dụng thường qui ở các bệnh viện để xác định mức độ nhạy của các chủng lâm sàng với kháng sinh sử dụng trong điều trị. Phương pháp đơn giản, ít tốn thời gian, giúp chọn thuốc thích hợp trong điều trị nhanh nhất. Phương pháp pha loãng cho sự tương quan cao giữa các phòng thí nghiệm và có mối tương quan tốt hơn giữa kết quả in vitro và hiệu quả điều trị. Để xác định nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của nấm men của các chất kháng nấm bằng phương pháp pha loãng, theo hướng dẫn của NCCLS M27-A2, thử nghiệm được thực hiện với môi trường RPMI với đệm MOPS. Đây là môi trường khá đắt tiền, qui trình điều chế phức tạp. Vì vậy chúng tôi sử dụng môi trường lỏng Mueller Hinton bổ sung glucose và xanh methylen để xác định nồng độ tối thiểu ức chế Candida spp. Đây là môi trường được NCCLS M44-A hướng dẫn sử dụng để xác định mức độ nhạy của nấm men với các chất kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán. Môi trường Mueller Hinton có công thức ổn định, được dùng thông dụng cho vi khuẩn, cách điều chế đơn giản. Bằng cách so sánh với kết quả nhận được từ phương pháp khuếch tán đã được chuẩn hóa bởi NCCLS M44-A, để tìm sự tương quan giữa hai phương pháp. Kết quả thực nghiệm cho thấy, môi trường MHB-GMB cho bước nhảy rõ ràng, ít bị ảnh hưởng của hiện tượng kéo đuôi (trailing growth), gây khó khăn cho việc xác định MIC ở Candida. MIC xác định sau 24 giờ cho tương quan tốt hơn với phương pháp khuếch tán. Tỉ lệ các chủng đề kháng với ketoconazol và fluconazol của C. albicans không khác biệt đáng kể giữa hai phương pháp. Tuy nhiên, phương pháp pha loãng có thể phát hiện được các chủng có mức độ nhạy tùy thuộc liều với MIC cao hơn. Ở Candida non albicans, khi sử dụng phương pháp pha loãng, đọc kết quả sau 24 giờ đã phát hiện được các chủng nhạy tùy thuộc liều cao hơn phương pháp khuếch tán (16/36 chủng có MIC trung gian, so với 0/36 chủng ở phương pháp khuếch tán), nếu đọc kết quả sau 48 giờ, tỉ lệ chủng kháng thuốc tăng cao so với phương pháp khuếch tán (13/36 so với 1/36). Qua kết quả khảo sát, các chủng Candida albicans phân lập từ niêm mạc miệng và âm đạo của bệnh nhân vẫn còn nhạy với ketoconazol và fluconazol. Đối với Candida non albicans, khi dùng phương pháp khuếch tán đã được chuẩn hóa của NCCLS M44-A, chưa phát hiện nguy cơ kháng thuốc cao, tuy nhiên mức độ nhạy với fluconazol và ketoconazol của các chủng này đã giảm với tỉ lệ chủng nhạy tùy thuộc liều tăng cao đến 44,44%. Trong một số công bố khác của Huang và cs., khi nghiên cứu sự tương quan giữa giá trị MIC in vitro và hiệu quả điều trị in vivo nhận thấy ở những ca Candida nhiễm trùng huyết ngay khi có MIC của fluconazol < 32 μg cũng đã Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 454 kém đáp ứng với fluconazol khi điều trị. Vì vậy chúng tôi đề nghị, để có sự tương quan tốt giữa kết quả in vitro và lâm sàng, ngoài việc sàng lọc nhanh kháng sinh thích hợp bằng phương pháp khuếch tán, nếu có điều kiện có thể sử dụng môi trường MHB-GMB xác định thêm MIC của kháng sinh đã chọn để chọn liều điều trị hợp lý. Cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. HCM đã cung cấp kinh phí và tạo điều kiện nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anaissie EJ., McGinnis MR. & Pfaller MA. (2003) Clinical Mycology. Churchill Livingstone, p. 161-163. 2. Capoor MR and cs. (2005) Emergence of Non-albicans Candida Species and antifungal resistance in a tertiary care hospital. Jpn. J. Infect. Dis., 58, 344-348. 3. Ernst EJ. và Rogers PD (2007), “Methods in Molecular medicine”, Antifungal agent - methods and protocols, Voll.188, Humana Press Inc, Totowa, NJ, pp. 3-7. 4. Sheehan DJ., Pfizer (2003), Susceptibility of global isolates of Candida species to fluconazole and Voriconazole by disk diffusion. Foccus on Fungal Infections 13.1. 5. The national committee for clinical laboratory standards (1996) Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts, Approve standard-second edition”, NCCLS document M27-A2.22(15). 6. Trần Phủ Mạnh Siêu, Hồ Quang Thắng (2010). Tình hình nhiễm vi nấm Candida spp. trên các bệnh nhân nhập viện tại bệnh viện Nhiệt đới TP. HCM năm 2009. Tạp chí Y học, phụ bản số 1, tập 14, tr. 206-212.