Khảo sát tác động kháng Staphylococcus aureus của phối hợp Berberin và kháng sinh β-lactam

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 437 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS CỦA PHỐI HỢP BERBERIN VÀ KHÁNG SINH β-LACTAM Đinh Thị Liên*, Vũ Thanh Thảo*, Trần Cát Đông*, Trần Thành Đạo* TÓM TẮT Mở đầu: Staphylococcus aureus kháng meticillin (MRSA) thường gặp trong nhiễm trùng bệnh viện, tuy nhiên, việc điều trị gặp nhiều khó khăn do vi khuẩn này đề kháng với nhiều kháng sinh, nhất là các kháng sinh β- lactam. Nhiều nghiên cứu cho thấy sự phối hợp giữa kháng sinh và các chất không phải kháng sinh làm tăng hoạt tính đối với vi khuẩn đã đề kháng. Berberin là một loại kháng sinh thực vật có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus. Mục tiêu: Sàng lọc những phối hợp có tác dụng hiệp đồng kháng khuẩn giữa berberin và một số kháng sinh β-lactam trên Staphylococcus aureus. Phương pháp: Tác động kháng khuẩn của berberin và tác động hiệp đồng kháng khuẩn của berberin với một số β-lactam được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Khả năng hiệp đồng kháng khuẩn của berberin với kháng sinh được xác định bằng phương pháp bàn cờ. Kết quả được đánh giá qua chỉ số ức chế riêng phần FIC. Kết quả: Trên cả 2 chủng MSSA và MRSA, kết quả định tính cho thấy berberin có tác dụng hiệp đồng với ampicillin, oxacillin và cefuroxim. Từ đó, xác định giá trị MIC của berberin trên MSSA là 256 µg/ml, MRSA là 128 µg/ml. Trên MSSA, các cặp phối hợp berberin/ampicillin; berberin/oxacillin có FIC là 0,375 (hiệp lực) và phối hợp berberin/cefuroxim có chỉ số là FIC là 1 (cộng lực). Trên MRSA, berberin có tác dụng hiệp đồng với ampicillin (FIC = 0,375), oxacillin (FIC=0,5) và cefuroxim (FIC=0,313). Kết luận: Berberin có tác dụng hiệp lực hay cộng hợp với các β-lactam bán tổng hợp (ampicillin và oxacicillin) và cephalosporin thế hệ 2 (cefuroxim) trên S. aureus và không hiệp đồng với cephalosporin thế hệ 3. Từ khóa: Staphylococcus aureus, berberin, tác dụng hiệp đồng, kháng sinh β-lactam. ABSTRACT INVESTIGATION OF ANTIMICROBIAL ACTIVITIES ON STAPHYLOCOCCUS AUREUS OF BERBERIN AND β-LACTAMS COMBINATION Dinh Thi Lien, Vu Thanh Thao, Tran Cat Dong, Tran Thanh Dao * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 437 - 442 Background: Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) was frequently reported in nosocomial infection. However, treatment was usually failed because of multiple resistance with antibiotics, especially β- lactams. Recently studies showed combination between antibiotic and non-antibiotic substances may increase antimicrobial effect on resistant strains. Berberin has been use for a long time as plant derived antimicrobial agent against Staphylococcus aureus. Objectives: Screening for combinations of berberin and β-lactams having synergic effect on Staphylococcus aureus. Methods: Antimicrobial activities of berberin and combined effects with β-lactams were determined agar *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: PGS. TS. Trần Thành Đạo ĐT: 0903716482 Email: thanhdaot@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 438 diffusion method. Checkerboard method was used to determine type of combined effect of combination between berberin and β-lactams. Outcome was assessed by FIC index. Results: On both Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) and Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains, the preliminary test showed berberin has combined effect with ampicillin, oxacillin and cefuroxim. MIC of berberin on MSSA was 256 µg/ml, on MRSA was 128 µg/ml. On MSSA, combination of berberin/ampicillin; berberin/oxacillin have FIC of 0,375 (synergic effect) and berberin/cefuroxim has FIC of 1 (additional effect). On MRSA, berberin has synergic effect with ampicillin (FIC = 0,375), oxacillin (FIC=0,5) and cefuroxim (FIC=0,313). Conclusions: Berberin has additional or synergic effect with semi-synthetic β-lactams (ampicillin và oxacicillin) or second generation cephalosporin (cefuroxim) on S. aureus, but no combined effect was observed with third generation cephalosporin. Keyword: Staphylococcus aureus, berberin, combined effect, β-lactam antibiotics ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với việc khám phá và sử dụng kháng sinh trong điều trị nhiễm khuẩn thì vấn đề đề kháng kháng sinh của vi sinh vật cũng được đặt ra. Hiện nay “sự kháng thuốc của vi khuẩn đã trở thành một thảm họa ngấm ngầm”. WHO đã kêu gọi các quốc gia phải coi tình trạng kháng kháng sinh nói riêng và kháng thuốc kháng khuẩn nói chung là mối đe dọa toàn cầu(5). Staphylococcus aureus là nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm trùng trên người và động vật. Mặc dù hiện nay đã phát hiện nhiều kháng sinh mới nhưng chúng không tác động trên Staphylococcus aureus đề kháng methicillin. Do đó, việc nhiễm vi khuẩn này vẫn còn vấn đề nghiêm trọng trên lâm sàng và việc nghiên cứu những chất kháng khuẩn mới và xác định cơ chế tác động của chúng là mục tiêu của việc nghiên cứu khoa học liên tục. Mặt khác, tỷ lệ Staphylococcus aureus đề kháng với những kháng sinh truyền thống như methicillin, oxacillin, hay nafcillin tiếp tục tăng. Vancomycin là phương kế cuối cùng trong điều trị Staphylococcus aureus kháng đa thuốc, nhưng vào năm 2002 theo báo cáo Trung tâm Phòng chống bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) đã ghi nhận có những trường hợp nhiễm trùng do Staphylococcus aureus kháng vancomycin hoàn toàn. Vì vậy, tìm ra một phối hợp có tác dụng tốt (kháng sinh với kháng sinh hoặc kháng sinh với một chất không phải là kháng sinh) trong trường hợp nhiễm Staphylococcus aureus đề kháng methicillin là việc cần thiết, có ý nghĩa thực tiễn. Để hạn chế sự đề kháng trên, vấn đề điều trị bằng phối hợp kháng sinh đã chứng tỏ hiệu quả trong những trường hợp nhiễm trùng nghiêm trọng. Trong những năm qua, vấn đề xác định tương tác kháng sinh đã có nhiều kết quả quan trọng được công bố và các nghiên cứu này thực hiện chủ yếu xác định tương tác giữa hai kháng sinh. Gần đây cũng đã có những nghiên cứu cho thấy phối hợp giữa kháng sinh và các chất không phải kháng sinh - ví dụ berberin, một kháng sinh thực vật đã được sử dụng trong y học cổ truyền từ lâu - làm tăng hoạt tính đối với vi khuẩn đã đề kháng. Với khuynh hướng trở về với thiên nhiên, ngày nay các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên càng được các nhà nghiên cứu quan tâm. Alkaloid là những hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong thực vật(6). Những nǎm gần đây khi nghiên cứu, sàng lọc các chất không phải là kháng sinh có nguồn gốc từ dược liệu, các nhà khoa học đã phát hiện berberin có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus đề kháng methicillin(4,6,7,8). Hyeon-Hee Yu và cộng sự khi phối hợp berberin với ampicillin, oxacillin trên các MRSA bằng phương pháp bàn cờ đã ghi nhận MIC của berberin nguyên chất trên MRSA từ 32-128 μg/ml giảm xuống còn 10-50 μg/ml khi phối hợp với ampicillin, oxacillin(10). Nhằm góp phần tìm được một phối hợp có tác dụng tốt, gia tăng hiệu quả của các kháng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 439 sinh trên tụ cầu đề kháng methicilin, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm sàng lọc những phối hợp có tác dụng hiệp đồng kháng khuẩn giữa berberin và một số kháng sinh β-lactam đối với Staphylococcus aureus nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo để có thể chọn lựa được phối hợp thuốc điều trị hữu hiệu Staphylococcus aureus. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng thử nghiệm Berberin clorid: do công ty trách nhiệm hữu hạn Dược Phẩm Thanh Thảo cung cấp đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III. Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu do công ty Nam Khoa sản xuất gồm các kháng sinh (ampicillin 10 μg/đĩa; oxacillin 1 μg/đĩa; cefotaxim (Ct, 30 μg/đĩa); ceftazidim (Cz, 30 μg/đĩa); ceftriaxon (Cx, 30 μg/đĩa); cefuroxim (Cu, 30 μg/đĩa). Bột kháng sinh: ampicillin (Am), oxacillin (Ox), cefuroxim (Cu, tiêu chuẩn USP) và môi trường: Mueller-Hinton Agar (MHA); Tryptic Soy Broth (TSB) và Tryptic Soy Agar (TSA) do công ty Merck cung cấp. Vi khuẩn thử nghiệm Staphylococcus aureus ATCC 29213 (MSSA), Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) do Bộ môn Vi sinh-Ký sinh, Đại học Y Dược TP.HCM cung cấp. Phương pháp nghiên cứu Quá trình thực hiện gồm 3 bước: Định tính tác động kháng khuẩn berberin và thử nghiệm kháng sinh đồ của các kháng sinh thử nghiệm để xác định đường kính vùng ức chế bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch(2). Định tính tác động hiệp đồng kháng khuẩn của berberin với kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch(1). Định lượng khả năng hiệp đồng kháng khuẩn của berberin với kháng sinh trên vi khuẩn bằng phương pháp bàn cờ(1,4). Đánh giá kết quả: các phối hợp có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thử nghiệm sẽ được chọn để tính chỉ số ức chế riêng phần FIC (fractional inhibitory concentration), dựa theo công thức sau(1,2). Trong đó: FIC < 0,5: hiệp đồng; 0,5 < FIC < 2: cộng hợp, FIC > 2: đề kháng. MIC: nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả xác định đường kính vòng vô khuẩn của berberin và kháng sinh thử nghiệm Berberin được pha thành các dung dịch mẹ trong dimetyl sulfoxid (DMSO), sau đó pha thành dung dịch có nồng độ 1024 μg/mL với môi trường MHA sao cho nồng độ chất trợ tan DMSO là 5%. Cho khoảng 8 - 10 μL dung dịch trên vào lỗ đã đục trên mặt thạch. Tiến hành song song với mẫu chứng chứa DMSO. Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35- 37 oC trong 16-18 giờ. Đọc kết quả bằng mắt thường, ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn (mm) trong Bảng 1. Đường kính vòng kháng khuẩn của các kháng sinh thử nghiệm trên Staphyllococcus aureus ATCC 29213 (MSSA) nằm trong giới hạn cho phép của CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Như vậy đĩa kháng sinh sử dụng, chủng vi khuẩn, phương pháp khuếch tán đạt yêu cầu của CLSI (2). Ngoài ra, kết quả trên MRSA cho thấy vi khuẩn này đã đề kháng với các kháng sinh β-lactam được sử dụng. Bảng 1. Định tính tác dụng kháng khuẩn của berberin và kháng sinh đồ của các kháng sinh thử nghiệm Đường kính vùng ức chế của các chất thử nghiệm (mm) Vi khuẩn Berberin Am Ox Ct Cx Cz Cu MRSA 9 10 8 17,5 12 13,5 14 MSSA 10 32 25 31 28 18 28 Kết quả định tính tác động hiệp đồng berberin và kháng sinh trong các phối hợp Các chất thử nghiệm được pha thành dung dịch có nồng độ 1024 μg/ml với nồng độ chất trợ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 440 tan DMSO là 5% rồi nhỏ khoảng 8-10 μL vào lỗ trên mặt thạch (8). Đặt đĩa kháng sinh lên bề mặt thạch sao cho khoảng cách từ tâm đĩa kháng sinh đến tâm giếng chứa chất thử lớn hơn tổng bán kính vòng kháng khuẩn riêng phần của kháng sinh và của chất thử nghiệm 1-2 mm. Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. Song song tiến hành trên mẫu chứng là lỗ chỉ chứa DMSO. Đọc kết quả dựa vào sự lan rộng vòng vô khuẩn hướng vào nhau giữa 2 chất thử nghiệm phối hợp. Kết quả định tính tác động hiệp đồng kháng S. aureus được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2. Các kháng sinh có tác dụng hiệp đồng với berberin Berberin Kháng sinh MSSA MRSA Am + + Ox + + Ct - - Cx - - Cz - - Cu + + Trên vi khuẩn S. aureus nhạy cảm meticillin (MSSA) có 3 phối hợp thể hiện tác động hiệp đồng: berberin và ampicillin; berberin và oxacillin; berberin và cefuroxim. Trên vi khuẩn S. aureus kháng methicillin (MRSA) có 2 phối hợp thể hiện tác động hiệp đồng: berberin và ampicillin; berberin và oxacillin; berberin và cefuroxim. Giá trị MIC của kháng sinh và berberin riêng rẽ trên S. aureus thử nghiệm Các bột kháng sinh được cân chính xác và pha trong nước cất vô trùng. Các chất thử nghiệm chalcon được pha thành các dung dịch mẹ trong DMSO, sau đó pha với môi trường MHA sao cho nồng độ chất trợ tan DMSO là 5% để đạt nồng độ mong muốn trong các giếng. Nồng độ các chất thử nghiệm và kháng sinh được pha loãng giảm dần ½ trong phiến 96 giếng. Ủ ở nhiệt độ 37 oC trong thời gian 16-18 giờ. Đọc kết quả: giá trị MIC được tính cho giếng có nồng độ chất thử thấp nhất vi khuẩn thử nghiệm không mọc được. Kết quả được trình bày ở Bảng 3. Bảng 3. MIC (µg/ml) của berberin và kháng sinh trên S. aureus MIC (μg/ml) Chất thử MSSA MRSA Berberin 256 128 Am 0,5 8 Ox 0,5 16 Cu 1 128 Giá trị MIC của berberin trên MSSA là 256 μg/ml trên MRSA là 128 μg/ml. Giá trị MIC của các β-lactam trên MRSA cho thấy chủng vi khuẩn này đề kháng với các kháng sinh đã dùng trong thử nghiệm (2). Định lượng tác dụng hiệp đồng của berberin và các kháng sinh trên phiến 96 giếng Pha nồng độ berberin và kháng sinh phối hợp với nhau theo tỉ lệ nhất định trong mỗi giếng của phiến 96 giếng và dao động xung quanh MIC của mỗi chất thử nghiệm. Trên phiến 96 giếng xem chiều ngang là nồng độ của berberin phối hợp với kháng sinh có nồng độ giảm dần ½ bắt đầu từ giếng chứa berberin và kháng sinh có nồng độ gấp 2 lần MIC của mỗi chất, giếng tiếp theo nồng berberin giữ nguyên còn kháng sinh có nồng độ giảm dần ½. Vi khuẩn được chấm khoảng 1-2 μl lên bề mặt tất cả các giếng, ủ ở 37 oC/16-18 giờ. Đối với MRSA ủ trong 24 giờ. Song song tiến hành chấm vi khuẩn lên một mẫu chứng không chứa berberin và kháng sinh. Đọc kết quả: giếng có nồng độ thấp nhất của kháng sinh ức chế hoàn toàn sự tạo khóm vi khuẩn được dung để tính chỉ số ức chế riêng phần FIC của berberin và kháng sinh. Bảng 4. Giá trị FIC khi phối hợp kháng sinh với berberin trên MSSA ST Các phối MIC (µg/ml) FIC Kết luận Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 441 T hợp Riêng rẽ Phối hợp Mức giảm MIC (lần) Kiểu tác động phối hợp Berberin 256 32 8 1 Am 0,5 0,125 0,38 4 Hiệp đồng B 256 32 8 2 Ox 0,5 0,125 0,38 4 Hiệp đồng B 256 128 2 3 Cu 1 0,5 1 2 Cộng hợp Trên MSSA có 2 phối hợp có tác dụng hiệp đồng là: berberin và ampicillin; berberin và oxacillin với chỉ số FIC là 0,38 và 1 phối hợp có tác dụng cộng hợp là berberin và cefuroxim với chỉ số FIC là 1. Phối hợp giữa berberin và ampicillin, giữa berberin và amoxicillin đều thể hiện kiểu tương tác hiệp đồng và giá trị MIC thấp, có tìm năng trong sử dụng trị liệu. Trên MRSA có 3 phối hợp có tác dụng hiệp đồng là: berberin và ampicillin với chỉ số FIC là 0,38; berberin và oxacillin là 0,5 và berberin và cefuroxim là 0,31. Các phối hợp giữa berberin và ampicillin, berberin và oxacicillin, berberin với cefuroxim đều thể hiện kiểu tương tác hiệp đồng và giá trị MIC thấp, chứng tỏ có tìm năng trong sử dụng trị liệu. Hoạt tính kháng MSSA của các kháng sinh và berberin trong các phối hợp cũng được tăng lên đáng kể. Với berberin tăng 2-8 lần, trong khi kháng sinh tăng 2-4 lần. Phối hợp giữa berberin và ampicillin, giữa berberin và amoxicillin đều thể hiện kiểu tương tác hiệp đồng và giá trị MIC thấp, chứng tỏ có tìm năng trong sử dụng trị liệu. Bảng 5. Giá trị FIC khi phối hợp berberin với kháng sinh trên chủng MRSA MIC (µg/ml) Kết luận STT Phối hợp Riêng rẽ Phối hợp FIC Mức giảm MIC (lần) Kiểu tác động phối hợp Berberin 128 32 4 1 Am 8 1 0,38 8 Hiệp đồng B 128 32 4 2 Ox 16 4 0,50 4 Hiệp đồng B 128 8 16 3 Cu 128 32 0,31 4 Hiệp đồng Trên MRSA có 3 phối hợp có tác dụng hiệp đồng là: berberin và ampicillin với chỉ số FIC là 0,375; berberin và oxacillin là 0,5 và berberin và cefuroxim là 0,31. Các phối hợp giữa berberin và ampicillin, berberin và oxacicillin, berberin với cefuroxim đều thể hiện kiểu tương tác hiệp đồng và giá trị MIC thấp, chứng tỏ có tiềm năng trong sử dụng trong trị liệu. Kết quả trên so với nghiên cứu về tác dụng hiệp đồng của berberin với ampicillin, oxacillin trên MRSA là phù hợp với nghiên cứu của Hyeon-Hee Yu và cộng sự (khi phối hợp berberin với ampicillin, oxacillin thì MIC của berberin, ampicillin, oxacillin giảm một cách rõ rệt (với nồng độ berberin từ 10-50 μg/ ml đã làm tăng độ nhạy cảm của MRSA đối với kháng sinh)(10). Ngoài ra, nghiên cứu này ghi nhận được trong các phối hợp với cephalosporin thử nghiệm, berberin cho tác động hiệp đồng với cefuroxim (thế hệ thứ 2), không làm tăng tác động của ceftazidim, ceftriaxon (cephalosporin thế hệ 3) trên S. aureus nhạy hay đề kháng methicillin. KẾT LUẬN Berberin có tác dụng hiệp đồng và cộng hợp trên cả MSSA và MRSA với các penicillin bán tổng hợp (ampicillin và amoxicillin) và cephalosporin thế hệ 2 (cefuroxim), không hiệp đồng với cephalosporin thế hệ 3. Như vậy, berberin và ampicillin, berberin và amoxicillin, berberin và cefuroxim là những phối hợp tiềm năng có thể phát triển thành chế phẩm phối hợp hoặc phương pháp trị liệu phối hợp đối với các trường hợp nhiễm S. aureus. Cảm ơn: Các tác giả cảm ơn Đại học Y Dược TP.HCM đã tài trợ kinh phí nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bajaksouzian S., Visalli M. A., Jacobs M. R., and Appelbaum P. C.. (1997). Activities of levofloxacin, ofloxacin, and ciprofloxacin, alone and in combination with amikacin, against acinetobacters as determined by checkerboard and time-kill studies. Antimicrob. Agents Chemother. 41:1073– 1076. 2. Bonapace C. R., White R. L., Friedrich L. V., and Bosso J. A.. (2000). Evaluation of antibiotic synergy against Acinetobacter baumannii: a comparison with E-test, time-kill, and Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 442 checkerboard methods. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 38:43– 50. 3. CLSI (2008). Performance standards for antimicrobial disk susceptibility testing; Informational supplement. M100-S18. 4. Lương Đăng Hoàng (2007). Sử dụng phương pháp bàn cờ để khảo sát tác dụng hiệp đồng của các flavonoid và các kháng sinh trên MRSA. Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. 5. Nguyễn Xuân Hùng (2010). Sự kháng thuốc của vi khuẩn một thảm họa ngấm ngầm. Thuốc và sức khỏe. 402, 8. 6. Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học. NXB Y Học Hà Nội. 7. Simoes M, Bennett RN, Rosa EAS. (2009). Understanding antimicrobial activities of phytochemicals agaisnt multudrug resistant bacteria and biofilm. Natural Product. 26, 746-757. 8. Stermitz FR, Lorenz P, Tawara JN, et al. (1999). Synergy in a medicinal plant: Antimicrobial action of berberine potentiated by 5′-methoxyhydnocarpin, a multidrug pump inhibitor. PNAS. 97(4), 1433-1437. 9. Trần Cát Đông, Nguyễn Văn Thanh (2002). Xây dựng mô hình đánh giá chất có tiềm năng kháng khuẩn. Y Học TP. Hồ Chí Minh, 6(1):309 - 313. 10. Yu Hyeon-Hee, Kim Kang-Ju, Cha Jeong-Dan, et al. (2005). Antimicrobial activity of berberine alone and in combination with ampicillin or oxacillin against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Journal of Medicinal Food. (454-461).