Khảo sát tế bào thần kinh ở một số vùng não suy thoái và sự thay đổi yếu tố hỗ trợ dinh dưỡng thần kinh bdnf do trimethyltin (TMT) trên chuột nhắt trắng

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 162 KHẢO SÁT TẾ BÀO THẦN KINH Ở MỘT SỐ VÙNG NÃO SUY THOÁI VÀ SỰ THAY ĐỔI YẾU TỐ HỖ TRỢ DINH DƯỠNG THẦN KINH BDNF DO TRIMETHYLTIN (TMT) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Nguyễn Quỳnh Hương**, Nguyễn Phương Dung*, Kiyokazu Ogita** TÓM TẮT Mục tiêu: Những bệnh lý thần kinh xảy ra từ sự suy thóai tế bào thần kinh (TBTK) tùy thuộc vị trí não và chức năng của nhóm tế bào đặc biệt. Trimethyltin (TMT) gây độc có chọn lọc lên TBTK ở một số vùng não và gây suy giảm trí nhớ. Việc xác định sự suy thóai TBTK do TMT trên chuột nhắt là cần thiết để nghiên cứu những yếu tố tổn thương liên quan. Phương pháp: Đối tựơng: Chuột nhắt trắng (đực), giống Std-ddY, trọng lượng 30-35g, 5 tuần tuổi (Osaka, Nhật Bản).Nguyên vật liệu: Trimethyltin clorid (TMT) – Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Nhật). Fluoro Jade B – Millipore, Mỹ. Kháng thể đa dòng vô tính anti-BDNF (brain-derived neurotrophic-factor) (AB1779SP) từ Chemicon (Millipore), kháng thể anti-rabbit được biotin hóa (Vector Laboratories, USA). Diaminobenzidin (DAB)/ Hydrogen peroxid của Histofine, Ninirei Co. (Nhật). Kết quả: Từ kết quả nhuộm Fluoro Jade B: TBTK suy thoái biểu hiện Fluoro Jade B tìm thấy chủ yếu ở vùng hồi răng; bên cạnh đó cũng ở vùng hành khứu giác, vùng hạch khứu giác trước và ở những lớp tế bào trên của vùng vỏ não sau khi tiêm TMT.Từ kết quả nhuộm BDNF: TMT gây nên sự giảm biểu hiện của BDNF ở một số tế bào vùng vỏ não như ở vùng hành khứu giác trong khi gây tăng biểu hiện này ở vùng hồi răng. Kết luận: TMT gây ra sự hiện diện TBTK suy thoái nhận biết với Fluoro Jade B đặc hiệu ở vùng hồi răng, vùng hành khứu giác, hạch khứu giác trước, và lớp trên của vùng vỏ não theo thời gian sau khi tiêm TMT. Cơ chế suy thoái tế bào thần kinh ở những vùng này còn chưa xác định chi tiết.Ngoài ra, vai trò của BDNF trong mô hình gây độc thần kinh với TMT được ghi nhận tùy thuộc vào từng vùng não.Đây chỉ là một phần của kết quả nghiên cứu, những nội dung còn lại sẽ đề cập tiếp ở các bài báo khác. Từ khóa: suy thoái tế bào thần kinh, trimethyltin ABSTRACT PARTIAL STUDY ABOUT NEURODEGENERATIVE REGIONS AND THE CHANGE IN BNDF EXPRESSION INDUCED BY TRIMETHYLTIN (TMT) IN MICE Nguyen Quynh Hương, Nguyen Phuong Dung, Kiyokazu Ogita * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 162 - 168 Objective: Mental diseases occur as the result of neurodegeneration depending on brain parts and the function of specific neurons.Trimethyltin (TMT) induces neuro-toxicity selectively in several brain parts; therefore it induces memory deficit. Determining neurodegenerative regions induced by TMT in mice is necessary to study more about the involved harmful factors. Method: Male mice of 5 week old age, Std-ddY strain, weigh from 30 – 35g from Osaka, Japan. Trimethyltin chloride (TMT) – Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, Japan). Fluoro Jade B – Millipore, Temecula, CA, USA. Rabbit polyclonal antibody against BDNF (brain-derived neurotrophic-factor) (AB1779SP) from Chemicon ∗ Khoa Y Học Cổ Truyền, Đại học Y Dược TP HCM *+ Bộ môn Dược lý, Đại học Setsunan Osaka, Nhật Bản Tác giả liên lạc: DS. Nguyễn Quỳnh Hương ĐT: 0933192602 Email: qhbeta@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 163 (Millipore), biotinylated secondary antibody against rabbit IgG (Vector Laboratories, CA, USA). Diaminobenzidine (DAB)/ Hydrogen peroxide của Histofine, Ninirei Co. (Tokyo, Japan).Drug administration: Adult male Std-ddY mice, weighing 30 – 35 g and 5 weeks of age, were breed with free access to food and water for at least 4 days before use.Animals were intraperitoneally injected with TMT (2.8 mg/kg) dissolved in phosphate- buffered saline, and then returned to their home cages until the time of decapitation. Histological assessment and immunohistochemical procedure: Mice were deeply anesthetized with pentobarbital (250 mg/kg, i.p.) and intra- cardially perfused with saline and then 4% (wt/v) paraformaldehyde. Post-fixed brains were embedded in paraffin, a cut as sagittal sections of 1- to 3-μm thickness with a microtome, and placed on MAS-coated slide glasses. The paraffin-embedded brain sections were deparafinized with xylene, ethanol of 100% to 50% (v/v), and water.Sections so obtained were subjected to specific desired antibody following protocols of their manufacturers. Stained sections were viewed with an Olympus U-LH100HG microscope. Results: Result of Fluoro Jade B staining: Fluoro Jade B (+) neuronal cells was present predominantly in the dentate gyrus; positively in the olfactory bulb, in the anterior olfactory nucleus and in the cortical superficial layers after TMT injection.Result of BDNF immunostaining: TMT induced a decrease of BDNF expression in cortical and olfactory neurons. Meanwhile, BDNF (+) neurons were enhanced in the dentate gyrus by TMT. Conclusion: Here we showed that TMT produced an expression of Fluoro Jade B in the dentate gyrus, olfactory bulb, anterior olfactory nucleus and partial cerebral cortex of the mice. The mechanism of neurodegeneration was still defined poorly. Moreover, the role of BDNF in TMT neurotoxicity was suggested probably region-specific. Keywords: neurodegeneration, trimethyltin, BDNF ĐẶT VẤN ĐỀ Những bệnh lý thần kinh xảy ra từ sự suy thoái tế bào thần kinh (TBTK) tùy thuộc vị trí não và chức năng của nhóm tế bào đặc biệt.Trimethyltin (TMT) gây độc có chọn lọc lên TBTK ở một số vùng não và gây suy giảm trí nhớ. Việc xác định sự suy thoái TBTK do TMT trên chuột nhắt là cần thiết để nghiên cứu những yếu tố tổn thương liên quan. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tựơng Chuột nhắt trắng (đực), giống Std-ddY, trọng lượng 30-35g, 5 tuần tuổi (Osaka, Nhật). Nguyên vật liệu Trimethyltin chloride (TMT) – Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Nhật). Fluoro Jade B – Millipore, Mỹ. Kháng thể đa dòng vô tính anti-BDNF (brain-derived neurotrophic- factor) (AB1779SP) từ Chemicon (Millipore). Diaminobenzidine (DAB)/ Hydrogen peroxide của Histofine, Ninirei Co. (Nhật). Phương pháp nghiên cứu Mô hình gây suy thoái thần kinh bằng TMT: Chuột nhắt 5 tuần tuổi, giống Std-ddY từ 30-35g (Osaka, Nhật Bản) được nuôi trong chuồng kim lọai trong phòng có chu kỳ sáng/ tối 12h/ 12h, độ ẩm 55%, nhiệt độ 23˚C. Chuột được ăn uống tự do để ổn định thể chất ít nhất 4 ngày trước thí nghiệm. Chuột được tiêm phúc mô với TMT liều duy nhất 2.8 mg/kg rồi thả về chuồng cho đến lúc mổ chuột lấy não theo một số thời điểm tính từ lúc tiêm. Những thí nghiệm được tiến hành lặp lại tối thiểu 3 lần (n = 4). Khảo sát mô học: Mẫu não được cố định trong paraffin và cắt theo phương đối xứng dọc từng lớp có độ dày 1-3 μm. Lớp não cắt và dán trên phiến kính phủ MAS (Kyoto, Nhật). Quy trình nhuộm mô theo hóa miễn dịch Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 164 (immunohistochemistry) BDNF: Mẫu não được xử lý loại bỏ paraffin khi ngâm qua xylen-cồn từ 100% - 50%-nước cất. Phiến kính ngâm trong 10 mM hệ natri phosphate (pH = 7,0) được ủ tủ ấm 10 phút đến 100˚C, rửa với TBST (Tris-buffered saline Tween), rồi ngâm với H2O2 0,03% trong methanol 5 phút. Sau 1 giờ ủ với huyết tương dê 5% trong TBST, mẫu được ủ với kháng thể kháng BDNF qua đêm ở nhiệt độ 4˚C.Ngày hôm sau tiếp tục được ủ với kháng thể tương thích anti-rabbit được biotin-hóa. Cuối cùng, mẫu được quan sát và chụp hình bằng kính hiển vi sau khi xử lý với DAB/ hydrogen peroxidase. Phương pháp nhuộm Fluoro Jade B: Fluoro Jade B (FJB) là thuốc nhuộm đặc hiệu cho TBTK bị suy thoái. Quy trình lọai bỏ lớp paraffin cố định mẫu tiến hành tương tự qua các dung môi xylen-cồn như trên. Theo hướng dẫn của nhà cung cấp, trong vòng 20 phút mẫu được ủ với FJB 0,0004%, sau đó được rửa nước cất 3 lần 1 phút/ lần. Sau khi để khô, mẫu được ngâm trong xylen ít nhất 1 phút. Mẫu được quan sát và chụp hình lại dưới kính hiển vi huỳnh quang. Hình ảnh nền từ chuột chứng được làm nổi để phân biệt các vùng não khác nhau. KẾT QUẢ Sự suy thoái TBTK do TMT nhận biết bằng FJB ở vùng hồi răng (dentate gyrus) Trong 1-3 ngày sau khi tiêm TMT, TBTK hạt vùng hồi răng biểu hiện FJB ở thân (soma) tế bào, đôi khi ở cả sợi trục (axon). TBTK hạt (granular) biểu thị FJB tăng dần đến ngày thứ 2 và giảm dần sau đó (Hình 1). Sự suy thoái TBTK do TMT nhận biết bằng FJB ở vùng vỏ não(cerebral cortex) Vỏ não chi phối chức năng thần kinh cao cấp như nhận thức, cảm giác, trí nhớ.TBTK vùng vỏ não có hình dạng phong phú ví dụ hình sao (stellate), hạt (granular), tháp (pyramidal). TMT gây suy thoái không chỉ ở vùng hồi răng mà còn ở những lớp trên của vùng vỏ não (hình 2). Sự suy thoái TBTK do TMT nhận biết bằng FJB ở vùng hành khứu giác - HKG (olfactory bulb, OB) và hạch khứu giác trước HKGT (anterior olfactory nucleus, AON) Tương tự kết quả báo cáo(4), TMT đồng thời gây ra sự suy thoái TBTK ở hành khứu giác và vùng lân cận là hạch khứu giác trước được phóng to ở hình 3. BDNF (brain-derived neurotrophic factor) ở một số vùng não chuột thử nghiệm tiêm TMT BDNF biểu hiện khác nhau ở các vùng não của chuột không tiêm TMT. TMT gây giảm biểu hiện của BDNF ở những vùng có suy thoái như vỏ não (4a) và HKG (4c) trong khi ở vùng hồi răng thì ngược lại (4b). Ở chuột chứng, BDNF biểu hiện dày ở tế bào vỏ não và hành khứu giác trong khi chỉ biểu hiện ở một vài tế bào vùng hồi răng. Ở chuột tiêm TMT, BDNF bị mất đi ở một số tế bào vỏ não (đánh dấu bởi mũi tên màu đen), trong khi ở vùng hồi răng tăng một số tế bào BDNF (+) cho đến ngày thứ 10. Ở HKG, BDNF giảm biểu hiện ở ngày 1 và dần phục hồi ở ngày thứ 10. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 165 TMT (2,8 mg/kg, tiêm phúc mô) Hình 1: FJB ở TBTK vùng hồi răng của chuột chứng và tiêm TMT. Ô viền trắng và xanh chỉ định hình ảnh phóng to tương ứng của TBTK suy thoái biểu hiện FJB ở một số ngày sau khi tiêm TMT.Tỉ lệ hình 200 μm. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 166 Hình 2: FJB ở vỏ não chuột chứng và tiêm TMT. Phần thân TBTK hạt, sao hay tháp biểu hiện FJB được phóng to ở ô viền vàng.Đôi khi FJB biểu hiện ở phần trục (axon). TBTK ở vỏ não biểu hiện FJB được tìm thấy sau thời điểm TBTK vùng hồi răng suy thoái. Hình 3: TBTK suy thoái biểu hiện FJB ở hành khứu giác (OB) xuất hiện trước, sau đó thể hiện ở vùng lân cận (AON) ở chuột thử nghiệm tiêm phúc mô TMT 2,8 mg/kg. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 167 Hình 4: BDNF ở chuột chứng (ngày 0) và sau khi tiêm TMT. BÀN LUẬN Mô hình nghiên cứu thần kinh với trimethyltin (TMT) đã được ứng dụng rộng rãi trong và ngoài nước(5). Căn bản đây là độc tố thần kinh có thể gây nên tổn thương dạng suy thoái rất khó xác định(2,1). Trong báo cáo này, chúng tôi cung cấp hình ảnh cụ thể về việc áp dụng FJB thành công và tiên lợi để phát hiện sự suy thoái đặc biệt ở TBTK (chứ không phải tế bào thần kinh đệm -neuroglia). Cho đến ngày thứ 3, FJB biểu hiện đặc biệt ở TBTK vùng hồi răng ở HKG và HKGT tương tự như kết quả của báo cáo trước đây(4). Sau ngày thứ 3, FJB tìm thấy ở TBTK tháp lẫn TBTK không phải tháp của vùng vỏ não. Như vậy, TMT gây nên sự tổn thương TBTK ở một số vùng não bộ.TBTK biểu hiện FJB không tìm thấy ở những vùng khác như não tủy (pons and medulla), tiểu não (cerebellum). Những yếu tố suy thoái thần kinh còn cần được nghiên cứu sâu hơn ở những vùng tìm thấy biểu hiện FJB. BDNF thuộc nhóm neurotrophin được ghi nhận hỗ trợ dinh dưỡng cho TBTK ở thời kỳ đầu của quá trình phát triển(7,3). BDNF biểu hiện khác nhau tại vỏ não, vùng hồi răng, HKG của chuột không tiêm và tiêm TMT có thể thấy vai trò của BDNF phụ thuộc vào từng khu vực não riêng. KẾT LUẬN Mô hình gây tổn thương TBTK và suy giảm trí nhớ bằng TMT đã được áp dụng trong điều kiện nghiên cứu ở Việt Nam rất hữu hiệu(Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.). Fluoro Jade B là marker đặc hiệu của quá trình suy thoái TBTK (neurodegeneration) đã được tìm thấy trong chuột nhắt tiêm TMT(0). TMT – gây – suy thoái TBTK ở một số vùng chọn lọc như vùng hồi răng, lớp trên của vùng vỏ não cũng như hành khứu giác và hạch khứu giác trước ở chuột thử nghiệm. Cơ chế suy thoái nằm ở TBTK nhận Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 168 biết bằng FJB và vai trò của BDNF ở các vùng não còn cần được nghiên cứu sâu hơn.Đây chỉ là một phần của kết quả nghiên cứu, những nội dung còn lại sẽ đề cập tiếp ở các bài báo khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chang LW (1986), “Neuropathology of trimethyltin: a proposed pathogenetic mechanism” Fundamental Applied Toxicology 6:217-232. 2. Geloso MC, Corvino V, Michetti F (2011), “Trimethyltin- induced hippocampal degeneration as a tool to investigate neurodegenerative processes”. Neurochem Int. (Epub ahead of print). PMID: 21414367. 3. Han BH, Holtzman DM (2000), “BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway” Journal of Neuroscience 20:5775-5781. 4. Kawada K, Yoneyama M, Nagashima R, Ogita K(2008), “In vivo acute treatment with trimethyltin chloride causes neuronal degeneration in the murine olfactory bulb and anterior olfactory nucleus by different cascades in each region”. J Neurosci Res 86:1635–1646. 5. Ogita K, Nitta Y, Watanabe M, Nakatani Y, Nishiyama N, Sugiyama C, Yoneda Y (2004), “In vivo activation of c-Jun N- terminal kinase signaling cascade prior to granule cell death induced by trimethyltin in the dentate gyrus of mice” Neuropharmacology 47(4):619-630. 6. Schmued LC, Hopkins KJ (2000), “Fluoro-Jade B: a high affinity fluorescent marker for the localization of neuronal degeneration” Brain Research 874(2):123-130. 7. Yamada K, Nabeshima T (April 2003). "Brain-derived neurotrophic factor/TrkB signaling in memory processes". J. Pharmacol. Sci. 91(4):267–270. Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014