Khóa luận Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO ÑAÏI HOÏC NOÂNG LAÂM TP. HOÀ CHÍ MINH BOÄ MOÂN COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC  KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP KHAÛO SAÙT ÑOÄC TÍNH CUÛA NAÁM Metarhizium anisopliae TREÂN SUØNG TRAÉNG (Phyllophaga crinita) Ngaønh hoïc: COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC Nieân khoaù: 2001-2005 Sinh vieân thöïc hieän: Ninh Thò Huyeàn Nga Thaønh phoá Hoà Chí Minh Thaùng 8/2005 2 BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO ÑAÏI HOÏC NOÂNG LAÂM TP. HOÀ CHÍ MINH BOÄ MOÂN COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC  KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP KHAÛO SAÙT ÑOÄC TÍNH CUÛA NAÁM Metarhizium anisopliae TREÂN SUØNG TRAÉNG (Phyllophaga crinita) Ngaønh hoïc: COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC Nieân khoaù: 2001-2005 Giaùo vieân höôùng daãn: TS. Traàn Taán Vieät TS. Leâ Ñình Ñoân Sinh vieân thöïc hieän: Ninh Thò Huyeàn Nga Thaønh phoá Hoà Chí Minh Thaùng 8/2005 3 LỜI CẢM TẠ Lời đầu tiên con vô cùng biết ơn ba mẹ đã sinh thành, dưỡng dục và nuôi dạy con đến ngày hôm nay. Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt mọi kiến thức cho em trong suốt thời gian em theo học tại trường. Em vô cùng biết ơn thầy Trần Tấn Việt, thầy Lê Đình Đôn người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giải đáp những khó khăn, vướng mắc trong thời gian làm đề tài và giúp em hoàn thành tốt đề tài này. Bên cạnh đó em xin chân thành cảm ơn cô Oanh, cô Thuận và thầy Trúc đã giúp đỡ em và tạo điều kiện thuận lợi cho em khi làm thí nghiệm bên phòng 105, phòng côn trùng. Em xin cảm ơn chị Ngọc phòng côn trùng, chị Thơ, chị Kiều, chị Vy phòng 118 đã tận tình giúp đỡ em và chị Tùng Anh đã hướng dẫn cho em trong thời gian em làm đề tài. Ngoài ra tôi xin cảm ơn chú Ba, chú Tư, anh Linh ở trại phân Nông Học đã giúp đỡ tôi suốt thời gian thực tập đề tài. Sau cùng tôi xin cảm ơn bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Tp.HCM, tháng 8 năm 2005 Sinh viên Ninh Thị Huyền Nga 4 TÓM TẮT NINH THỊ HUYỀN NGA, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CỦA NẤM Metarhizium anisopliae TRÊN SÙNG TRẮNG. Giảng viên hướng dẫn: TS. TRẦN TẤN VIỆT TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Nấm Metarhizium anisopliae là loại nấm diệt được các côn trùng trên đồng ruộng rất hiệu quả. Lợi dụng đặc điểm này người ta đã tạo ra chế phẩm sinh học MA diệt trừ các loại sâu, rầy… trên đồng ruộng giúp cải thiện năng suất cây trồng nông nghiệp. Đề tài đã được thực hiện tại trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh nhằm khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên gồm 18 nghiệm thức trong đó 14 nghiệm thức ứng với 10 dòng nấm (BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8, MA 2, CP MA, SCLLLA 4, RBC – Q9 – 3,MA 11 và MA 13) và 4 nghiệm thức đối chứng bao gồm: để nguyên, phun nước, phun môi trường bã bia + mật rỉ + nước và đối chứng gây vết thương. Các nghiệm thức được thực hiện dựa trên 3 phương pháp gây nhiễm, 5 mẫu trên mỗi nghiệm thức. Có 3 dòng nấm có khả gây độc trên sùng trắng là BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11. Trong đó dòng MA 11 biểu hiện độc tính cao nhất (tỷ lệ sùng chết 80%). Phương pháp gây nhiễm 1 và phương pháp gây nhiễm 2 không mang lại hiệu quả khi gây nhiễm nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng. Phương pháp gây nhiễm 3 (tạo vết thương nhẹ trước khi gây nhiễm nấm) là phương pháp hiệu quả khi gây nhiễm các dòng nấm BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11. Các dòng còn lại (BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8, RBC – Q9 – 3, MA 11, MA 2, CP MA, MA 13) không hiệu quả với cả 3 phương pháp gây nhiễm. 5 MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................ iii TÓM TẮT ..................................................................................................................... iv MỤC LỤC ...................................................................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ....................................................................... vii DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ ................................................................................... viii Chương 1: Lời mở đầu ................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2 Mục đích yêu cầu ................................................................................................ 2 1.2.1 Mục đích .................................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ...................................................................................................... 2 Chương 2: Tổng quan tài liệu ........................................................................................ 3 2.1 Giới thiệu sùng trắng ................................................................................................ 3 2.1.1 Môi trường sống, nguồn thức ăn và khả năng gây hại của sùng trắng ................. 3 2.1.2 Đặc điểm sinh học, phân bố, chu kì sống, tập tính hoạt động của sùng trắng và xác định loài .............................................................................................................. 3 2.1.3 Các giai đoạn phát triển khác của sùng trắng ....................................................... 5 2.1.4 Biểu hiện gây hại ................................................................................................... 6 2.1.5 Các biện pháp hạn chế sùng trắng ......................................................................... 6 2.2 Chế phẩm sinh học diệt côn trùng ............................................................................ 7 2.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của biện pháp phòng trừ sinh học ..................... 7 2.2.1.1 Giai đoạn tiền sử đến năm 1888......................................................................... 7 2.2.1.2 Giai đoạn phát triển từ năm 1888 đến năm 1940 ............................................... 9 2.2.1.3Giai đoạn phát triển từ 1940 năm đến năm 1960 .............................................. 10 2.2.1.4 Giai đoạn phát triển từ năm 1960 đến nay ........................................................ 11 2.2.2 Vai trò của chế phẩm sinh học ............................................................................ 11 2.2.3 Tính ưu việt của chế phẩm sinh học ................................................................... 13 2.2.4 Các bước áp dụng biện pháp sinh học ................................................................ 14 2.2.5 Một số chế phẩm sinh học diệt côn trùng hiện nay............................................. 15 2.3 Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae ................................................................ 15 6 2.3.1 Nấm ký sinh côn trùng ........................................................................................ 15 2.3.2 Nấm Metarhizium anisopliae .............................................................................. 18 2.3.2.1 Phổ kí chủ của nấm Metarhizium anisopliae ................................................... 19 2.3.2.2 Tác động của nấm Metarhizium anisopliae vào cơ thể côn trùng ................... 19 2.3.2.3 Độc tố diệt côn trùng của nấm Metarhizium anisopliae .................................. 19 2.3.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của M.anisopliae .................................................. 19 2.3.2.5 Các dạng nấm Metarhizium anisopliae ............................................................ 20 2.4 Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới ........................................................... 21 2.4.1 Các nghiên cứu trong nước ................................................................................. 21 2.4.2 Các nghiên cứu trên thế giới ............................................................................... 21 Chương 3: Vật liệu – Phương pháp ............................................................................. 23 3.1 Nuôi sùng trắng ...................................................................................................... 23 3.2 Nhân giống nấm Metarhizium anisopliae .............................................................. 24 3.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae .............................................. 26 3.3.1 Phương pháp khảo sát độc tính ........................................................................... 26 3.3.2 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................. 27 Chương 4: Kết quả và thảo luận .................................................................................. 29 4.1 Giai đoạn nuôi sùng ............................................................................................... 29 4.2 Giai đoạn nhân nấm ............................................................................................... 29 4.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae .............................................. 32 4.3.1 Phương pháp gây nhiễm 1 và 2 ........................................................................... 32 4.3.2 Phương pháp gây nhiễm 3 ................................................................................... 36 4.3.3 Ảnh hưởng của các phương pháp gây nhiễm nấm .............................................. 40 4.3.4 Hiệu quả của các dòng nấm với các phương pháp xử lý .................................... 41 Chương 5: Kết luận và kiến nghị ................................................................................. 43 5.1 Kết luận .................................................................................................................. 43 5.2 Kiến nghị ................................................................................................................ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 44 7 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Bảng tra phổ tác động của nấm bất toàn trên động vật chân đốt ................... 16 Bảng 2.2 Bảng tra các loài trong chi nấm lục cương .................................................... 18 Sơ đồ 3.1 Qui trình lên men xốp tạo chế phẩm diệt sâu và côn trùng gây hại .............. 25 Bảng 3.1 Bảng bố trí thí nghiệm theo phương pháp 1 .................................................. 27 Bảng 3.2 Bảng bố trí thí nghiệm theo phương pháp 2 .................................................. 27 Bảng 3.3 Bảng bố trí thí nghiệm theo phương pháp 3 .................................................. 28 Bảng 4.1 Số lượng bào tử của các dòng nấm trong 1 g bột nấm ................................... 31 Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 1 ...................................................................................................................................... 32 Bảng 4.3 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 2 ...................................................................................................................................... 33 Bảng 4.4 Kết quả gây nhiễm nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 3 ................................................................................................................ 36 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của phương pháp gây nhiễm 1,2 và 3 trên dòng nấm M.anisopliae BXĐTV 3 ................................................................................................. 41 Bảng 4.6 Hiệu quả của các dòng nấm với 3 phương pháp gây nhiễm .......................... 42 8 DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1 Các đốt hậu môn từ các loài sùng trắng khác nhau .......................................... 4 Hình 2.2 Vòng đời sùng .................................................................................................. 5 Hình 4.1 Sùng nuôi trong điều kiện thí nghiệm ............................................................ 29 Hình 4.2 Nấm Metarhizium anisopliae trên môi trường thạch và trên môi trường xốp (cơm) ....................................................................................................................... 30 Hình 4.3 Nghiệm thức đối chứng sùng phun nước và phun môi trường bã bia + mật rỉ + nước .................................................................................................................. 34 Hình 4.4 Kết quả gây nhiễm sùng với các dòng nấm M.anisopliae BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8 theo phương pháp 1 và MA 11 và CP MA theo phương pháp 2. ............................................................................................................................ 35 Hình 4.5 Kết quả nghiệm thức đối chứng gây vết thương ............................................ 37 Hình 4.6 Kết quả gây nhiễm sùng với các dòng nấm M.anisopliae BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11 theo phương pháp 3 ................................................................... 38 Hình 4.7 Kết quả gây nhiễm sùng với các dòng nấm BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8, MA 13, RBC – Q9 – 3 theo phương pháp 3 .............................................................. 39 Hình 4.8 Kết quả phân lập nấm M.anisopliae từ sùng nhiễm ....................................... 40 9 Chƣơng 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Côn trùng gây hại luôn là mối đe dọa cho nền sản xuất nông nghiệp. Đối với các quốc gia dựa vào nền nông nghiệp, sự nguy hại đó càng nghiêm trọng. Chính vì vậy chúng trở thành đối tượng quan tâm trong rất nhiều nghiên cứu khoa học với mong muốn là làm sao loại trừ được các côn trùng gây hại? Qua nhiều thập kỉ, để diệt các côn trùng gây hại người ta đã sử dụng biện pháp hóa học như một biện pháp đem lại hiệu quả tối đa.Tuy nhiên song song với lợi ích đó, biện pháp hóa học gây xáo trộn hệ sinh thái, làm thoái hóa đất và làm ô nhiễm môi trường. Cao hơn nữa là vấn đề kháng thuốc và dư lượng thuốc hóa học tồn đọng trong thực vật gây tác động xấu đến sức khỏe của con người. Trước thực tế đó, con người phải tìm kiếm một phương pháp khác vừa hiệu quả vừa an toàn cho con người và không ô nhiễm môi trường đồng thời không làm mất cân bằng sinh thái, biện pháp phòng trừ bằng sinh học ra đời. Biện pháp này dựa trên khả năng kí sinh của các loài nấm, vi khuẩn và virus; có nghĩa là sử dụng các sinh vật sống để diệt trừ côn trùng gây hại. Nhờ những ưu điểm của mình, biện pháp này hiện đang được các nhà khoa học khắp thế giới rất quan tâm và là hướng ưu tiên hàng đầu trong công tác phòng trừ sâu bệnh. Hiện nay nấm được sử dụng rộng rãi trong phòng trừ các côn trùng gây hại do tính hiệu quả và các lợi ích về môi trường và con người, hơn thế nữa nấm còn một ưu điểm về phổ kí sinh rộng. Chính vì vậy, việc sản xuất chế phẩm nấm diệt côn trùng đã dần dần được chú trọng. Do sự đa dạng về các chủng loài với độc tính khác nhau, các nghiên cứu về nấm vẫn không ngừng được tìm tòi nghiên cứu. Trong các loại nấm diệt côn trùng, nấm Metarhizium anisopliae được xem là một loại nấm có khả năng diệt côn trùng rất hữu hiệu. Theo các nghiên cứu trước, loại nấm này có khả năng diệt được cào cào và bọ xít với hiệu quả rất tốt. Đặc biệt trong phổ kí sinh của mình, nấm M. anisopliae có thể diệt được một số loài bọ cánh cứng có thể gây hại nghiêm trọng cho cây trồng nông nghiệp. Trong số các 10 loài bọ cánh cứng đó, các côn trùng họ bọ hung là loài côn trùng rất được quan tâm hiện nay do khả năng gây hại nghiêm trọng trên rễ thực vật của ấu trùng (còn gọi là sùng trắng) và khả năng gây hại trên lá của thành trùng. Trước thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng .” 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích  Chọn lựa phương pháp nhân nấm thích hợp cho nghiên cứu.  Đánh giá độc tính của các dòng nấm Metarhizium anisopliae để chọn lọc được các dòng có độc tính cao. 1.2.2 Yêu cầu  Hiểu biết về đặc điểm sinh học, nguồn thức ăn, tập tính hoạt động của sùng trắng. Từ đó tìm ra cách thức nuôi thích hợp đối với sùng trắng.  Tìm hiểu đặc điểm sinh học của nấm Metarhizium anisopliae và các phương pháp nuôi cấy và nhân giống nấm thích hợp cho nghiên cứu. 11 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu sùng trắng Có hơn 100 loài bọ cánh cứng thuộc họ bọ hung từ vài giống khác nhau (Cyclocephala, Phyllophaga, Ataenius) được xem là sùng trắng. Tuy nhiên gọi chung là Phyllophaga crinita. Đặc điểm sinh học của chúng giống nhau nhưng khác nhau về sự phân bố, môi trường sống, chu kì sống và thời gian xuất hiện. Nhìn chung các loài bao gồm: Cyclocephala immaculata (Oliver), Cotinis nitida (Linnaeus). Một thành viên quan trọng khác của họ bọ hung là Popillia japonia di chuyển vào Đông Bắc Mỹ và di cư đến phía Tây và Nam. 2.1.1 Môi trường sống, nguồn thức ăn và khả năng gây hại của sùng trắng Môi trường sống và nguồn thức ăn của sùng trắng chủ yếu trên các đồng cỏ. Sùng ăn trên lá cỏ, các thực vật cấy ghép và cây trang trí trong nông nghiệp. Chúng là côn trùng gây hại nghiêm trọng đến thức ăn của bò, gây hại đến bắp lúa miến và mía đường. Ngoài ra sùng còn ăn các chất hữu cơ mục nát Hầu hết sự tàn phá trên thực vật do sự gây hại của sùng trên rễ. Sùng trắng là một trong những côn trùng phá hoại lớp đất mặt. Chúng ăn rễ cỏ và có thể phá hoại hoàn toàn hệ thống rễ của thực vật. Vùng rộng của lớp đất mặt có thể bị chết trong một thời gian ngắn. 2.1.2 Đặc điểm sinh học, phân bố, chu kì sống, tập tính hoạt động của sùng trắng và xác định loài Sùng trắng là ấu trùng hình chữ C của một nhóm lớn bọ cánh cứng được gọi là bọ hung. Nhiều loài bọ hung được tìm thấy ở bang United States dưới các đám cỏ. Hầu hết các loài quan trọng là: bọ cánh cứng Nhật Bản , Popillia japonica Newman; loài bọ cánh cứng tháng 5 và tháng 6 , Phylophaga spp.; loài bọ da phía bắc và phía nam, Cyclcephala spp.; ataenius, Ataenius spretulus. Cụ thể hơn, các con sùng trắng phân bố rộng khắp trên trái đất, chúng là ấu trùng của bọ da Châu Âu, Rhizotrogus majalis (Razoumowsky); Bọ cánh cứng ở Châu Á, Maladera castanea ; và bọ cánh cứng vào tháng 6, Cotinis nitida. 12 Có nhiều loài sùng trắng ở Nebraska. Hầu hết các nhóm quan trọng là bọ da Cyclocephala spp. (ấu trùng một năm), bọ cánh cứng tháng 5/tháng 6 Phyllophaga spp. (vòng đời 3 năm), và vài loài riêng trong nhóm riêng của chúng, black turfgrass ataenius, Ataenius spretulus. Việc xác định các giai đoạn ấu trùng của 3 nhóm này có thể thực hiện được bằng cách kiểm tra các đốt hậu môn. (Nguồn Bọ da Loại sùng trắng này hoàn thành chu kì sống của nó trong một năm. Thành trùng màu nâu rám nắng, dài 15mm và nhỏ hơn ấu trùng tuổi 3. Thành trùng thường xuất hiện từ cuối tháng 6 đến tháng 7. Chúng bị hấp dẫn bởi ánh sáng và thường ở quanh các cửa sổ hoặc các đèn hành lang. Thành trùng để trứng trên mặt đất thành từng cụm nhỏ. Ấu trùng nhỏ nở ra từ trứng và bắt đầu ăn rễ cỏ. Hầu hết sự phá hoại xuất hiện vào cuối mùa và sớm giảm khi ấu trùng tiến đến giai đoạn ấu trùng thứ 2. Khi bắt đầu thời tiết lạnh, các ấu trùng di chuyển sâu hơn xuống đất cho đến khi qua mùa đông. Khi đất trở nên ấm hơn trong mùa xuân chúng di chuyển lên trên và ăn rễ cỏ trong một thời gian ngắn, hóa nhộng và nhũ hóa thành thành trùng để bắt đầu chu kì sống mới. Bọ cánh cứng tháng 5/tháng 6 Ấu trùng ăn chủ yếu các cây mục nát. Ấu trùng đào bới làm nhổ bật cỏ. Có thể thấy ấu trùng trên mặt đất sau cơn mưa rào. Chúng rất dễ nhận biết vì chúng thường đi bằng lưng chứ không đi bằng chân Các ấu trùng loại này phải mất 3 năm để hoàn thành chu kì sống. Tuy nhiên có thể dưới 2 năm ở nh