Khóa luận Phân tích amino acid bằng sắc ký lỏng cao áp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: ĐOÀN BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐOÀN BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii LỜI CẢM TẠ CHÂN THÀNH CẢM ƠN: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Bộ môn Bảo vệ Thực vật Quí thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy Bùi Cách Tuyến, Thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh. Cô Trần Thị Dung, Thầy Lƣu Phúc Lợi, Thầy Nguyễn Văn Cƣờng, Anh Mai Huy Hoàng đã giúp tôi có trang thiết bị cũng nhƣ phòng thí nghiệm để hoàn thành khóa luận. Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hòan thành khóa luận. Anh Lê Viết Ngọc Viện hạt nhân Đà Lạt, anh Hoàng trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã cung cấp giống nấm bào ngƣ cho tôi thực hiện khóa luận. Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iii TÓM TẮT Đoàn Bảo Quốc, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ Pleurotus spp. bằng sắc ký lỏng cao áp - high performance liqud chromatography (HPLC) thời gian từ 14/2/2005 đến 18/8/2005. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. Lê Đình Đôn Khóa luận đƣợc thực hiện trên đối tƣợng nấm bào ngƣ Pleurotus spp.. Đây là loại nấm rất phổ biến trên thị trƣờng Việt Nam. Vì thế, thành phần dinh dƣỡng của chúng, đặc biệt là thành phần amino acid rất đƣợc quan tâm. Để thực hiện phân tích amino acid trên nấm, chúng tôi tiến hành trồng nấm tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học và sử dụng thiết bị là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của Trung tâm Hóa Lý đều thuộc Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Những kết quả đạt đƣợc: Nuôi trồng đƣợc 4 dòng nấm Pleurotus spp. trên cơ chất là mùn cƣa có bổ sung thêm cám gạo, và một số chất khác. Phân tích và định lƣợng đƣợc 17 amino acid trong 2 loài nấm Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius. Từ đó chúng tôi tiến hành so sánh thành phần amino acid của chúng với một số rau quả khác, với một số nấm khác và so sánh giữa chúng. iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ta ................................................................................................................ i Tóm tắt .................................................................................................................... ii Mục lục .................................................................................................................. iii Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... vi Danh sách các hình ............................................................................................... vii Danh sách các bảng ............................................................................................. viii 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................... 1 1.2. Mục đích ............................................................................................ 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................ 1.4. Nội dung thực hiện ............................................................................ 2 2. TỔNG QUAN ............................................................................................. 3 2.1. Nấm trồng .......................................................................................... 3 2.1.1. Khái niệm về nấm ........................................................................ 3 2.1.2. Sinh sản và chu trình sống ........................................................... 5 2.1.3.. Đặc điểm biến dƣỡng và sinh lý ................................................. 7 2.2. Nấm bào ngƣ ...................................................................................... 8 2.2.1. Giới thiệu ..................................................................................... 8 2.2.2. Một số loài nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng ở VIệt Nam .............. 9 2.2.2.1. Nấm bào ngƣ Pleurotus florida ........................................ 10 2.2.2.2. Nấm bào ngƣ Pleurotus sajor-caju ................................... 10 2.2.2.3. Nấm bào ngƣ Pleurotus pulmonarius ............................... 11 2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus ..................................... 11 2.3. Phƣơng pháp sắc ký ......................................................................... 12 2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký ................................. 12 2.3.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký .................................................. 12 2.4. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tich amino acid ................. 13 v 2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatography) ......................................... 13 2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) ............. 14 2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ................ 15 2.4.3.1. Pha tĩnh .............................................................................. 15 2.4.3.2. Pha động ............................................................................ 16 2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC ............................................................. 16 2.5. Các bƣớc phân tích amino acid ....................................................... 17 2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis) .............................................. 17 2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) .................................... 19 2.5.3. Phân tách trên HPLC ................................................................. 20 2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu .................................................... 21 2.4.4.1. Định tính ............................................................................ 21 2.4.4.2. Định lƣợng ......................................................................... 21 2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ .......................................... 23 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 23 3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................... 23 3.1.1. Thời gian thực hiện ................................................................... 23 3.1.2 .Địa điểm ..................................................................................... 23 3.1.3.Vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 23 3.2. Hóa chất và dụng cụ ........................................................................ 23 3.2.1. Hóa chất ..................................................................................... 23 3.2.2. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................... 24 3.3. Phƣơng pháp nhân giống và trồng nấm ........................................... 24 3.3.1. Môi trƣờng ................................................................................. 24 3.3.2. Phƣơng pháp .............................................................................. 24 3.2.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA ............................................... 24 3.2.2.2. Chuẩn bị môi trƣờng hạt ................................................... 24 3.3.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng giá môi ........................................... 25 3.2.2.4. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng ........................................ 25 3.2.2.5. Tóm tắt quy trình ............................................................... 26 3.3.3. Phân tích amino acid .................................................................. 26 3.3.3.1.Thủy phân mẫu ................................................................... 26 vi 3.3.3.2. Tạo dẫn xuất: ..................................................................... 27 3.3.3.3. Phân tích HPLC ................................................................. 28 3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả ........................................... 28 4.. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 29 4.1. Kết quả ............................................................................................. 29 4.1.1. Kết quả trồng nấm ...................................................................... 29 4.1.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng ................. 29 4.1.1.2. Sự hình thành quả thể ........................................................ 30 4.1.2. Kết quả phân tích amino acid .................................................... 32 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 35 5.1. Kết luận ............................................................................................ 35 5.2. Đề nghị............................................................................................. 35 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 36 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN:Acetonitril HPLC: High performance liquid chromatography TLC: Thin layer chromatography PITC: phenylisothiocyanate PTC: phenylisocarbamyl TEA: Triethylamine. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH .......................................................................................................... TRANG Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm ................................................................................ 3 Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm...................................................................... 6 Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius ......................................................................... 11 Hình 2.4. Pleurotus abalonus ............................................................................... 11 Hình 2.5 Pleurotus sp .......................................................................................... 11 Hình 2.6. Pleurotus floridanus ............................................................................. 11 Hình 2.7. Mô hình sắc ký giấy ............................................................................. 14 Hình 2.8. Mô hình sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 14 Hình 2.9. Bộ dụng cụ HPLC ................................................................................ 16 Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl .............................................................. 18 Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC .................................................. 20 Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bởi sắc ký giấy tròn ..... 22 Hình 4.1. Sinh trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus floridanus, Pleurotus flabellatus, Pleurotus flabellatus .......................................................................... 31 Hình 4.2. Pleurotus abalonus trên giá mô .................................................................. 31 Hình 4.3. Bào tử Pleurotus abalonus ................................................................... 31 Hình 4.4. Bào tử đảm Pleurotus floridanus ...................................................................................... 31 Hình 4 .5. Bào tử đảm Pleurotus abalonus ...................................................................................... 31 Hình 4.6. Quả thể nấm Pleurotus floridanus ........................................................ 32 Hình 4.7. Quả thể nấm Pleurotus abalonus ......................................................... 32 Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus ........................................................ 32 Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius .................................................... 32 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG ......................................................................................................... TRANG Bảng 2.1. Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngƣ .................................. 10 Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản ........................................................................ 13 Bảng 4.1. Thời gian lan tơ đầy thiết bị của các dòng nấm ................................... 29 Bảng 4.2. Đặc tính quả thể của các dòng nấm ..................................................... 30 Bảng 4. 3. Thành phần amino acid trên Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus .. 33 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, nấm bào ngƣ đang dần trở thành một trong những khẩu phần chính trong bữa ăn của ngƣời dân. Bên cạnh mùi vị thơm ngon, giàu dinh dƣỡng, rất dễ chế biến, nấm còn đƣợc xem nhƣ là một loại “rau sạch” và có giá trị dƣợc liệu. Sản lƣợng nấm bào ngƣ tăng lên rất nhanh trong vài thập kỷ qua. Theo thống kê của Chang và ctv (1999) chỉ trong vòng 36 năm trở lại đây tổng sản lƣợng nấm trồng tăng gấp 21 lần từ 350.000 năm 1965 tăng lên 7,5 triệu tấn, trong đó nấm bào ngƣ Pleurotus spp. tăng từ 169000 tấn năm 1986 lên 876000 tấn năm1997. Gần đây, Việt Nam cũng đang phát triển công nghệ trồng nấm trong nƣớc. Vì thế, ngoài việc khai thác nấm hoang dại đem về trồng, nƣớc ta còn nhập khẩu nhiều loại nấm bào ngƣ khác từ nƣớc ngoài nhƣ Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản. Trong số đó, có một số loài đã đƣợc biết rất rõ về thành phần dinh dƣỡng, một số loài còn lại thành phần này vẫn chƣa đƣợc công bố chính thức, đặc biệt là thành phần amino acid. Vì thế, việc xác định thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đối với Việt Nam là điều cần thiết để có thể đánh giá giá trị sinh học, cũng nhƣ so sánh sự khác nhau giữa chúng. Từ xƣa đến nay, việc xác định amino acid đã đƣợc thực hiện trên rất nhiều công cụ khác nhau nhƣ: sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng. Phân tích amino acid trên các công cụ phân tích truyền thống này thì đòi hỏi nhiều thời gian và rất phức tạp. Ngày nay, với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, việc xác định thành phần amino acid trong mẫu sinh hóa đã đƣợc đơn giản hơn rất nhiều, bởi hầu hết các công cụ đã đƣợc tự động hóa và đƣợc nối trực tiếp bộ phận xử lý số liệu. Hiện nay, trên thị trƣờng đang tồn tại rất nhiều kỹ thuật phân tích amino acid nhƣ: sắc ký lỏng cao áp, HPLC (high performance liquid chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis). Trong phạm vi cho phép, chúng tôi chỉ thực hiện “Phân tích amino acid bằng sắc ký lỏng cao áp” trên một số loài nấm đang có ở thị trƣờng Việt Nam. Từ đó, với kết quả thu đƣợc chúng tôi sẽ tiến hành so sánh với các đối tƣợng khác cũng nhƣ sự khác nhau giữa chúng và dữ liệu về thành phần amino acid của từng loài nấm bào ngƣ sẽ đƣợc lƣu lại để làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này. 2 1.2. Mục đích So sánh sự thành phần amino acid giữa các loài nấm bào ngƣ đang có trên thị trƣờng Việt Nam. Khi đó, chúng tôi sẽ chọn ra một loài phù hợp để so sánh thành phần amino acid khi trồng trên các cơ chất khác nhau 1.3. Yêu cầu Tạo đựợc mẫu có độ tinh sạch cao. Tránh hiện tƣợng làm thay đổi tính chất mẫu nhƣ oxy hóa, halogen hóa, hay làm mẫu bị hủy hoàn toàn trong quá trình thủy phân. Sử dụng thiết bị HPLC (high performance liquid chromatography) của Trung tâm Phân Tích Hóa Lý để phân tích thành phần amino acid của các loài nấm kể trên 1.4. Nội dung thực hiện Thu thập và nhân giống các loài nấm đang có trên thị trƣờng. Nuôi trồng các loài nấm này trên môi trƣờng mùn cƣa có bổ sung một số vi lƣợng. Tiến hành thu quả thể Xác định thành phần amino acid trên các loài nấm bào ngƣ bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Nấm trồng 2.1.1. Khái niệm về nấm Hiện nay, số loài nấm trồng đƣợc chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong số nấm ăn thiên nhiên. Ngoài đặc điểm chung là quả thể hay tai nấm có kích thƣớc lớn (đa số dạng tán dù), chúng còn ăn ngon và rất giàu dinh dƣỡng [5]. Nấm rất phong phú và đa dạng, bao gồm cả những loại ăn đƣợc và không ăn đƣợc, những loài cho quả thể lớn có thể thấy bằng mắt thƣờng và những loài phải sử dụng kính hiển vi mới quan sát đƣợc [5]. Ban đầu nấm đƣợc xếp vào giới thực vật. Tuy nhiên, quan điểm này ngày nay không còn thuyết phục nữa và nhiều nhà phân loại học đã đề nghị xếp nấm vào một giới riêng, gọi là giới nấm. Sở dĩ xếp Nấm thành một giới riêng mà không xếp vào giới Thực vật vì nấm không có lục lạp, không có sắc tố quang hợp, không có đời sống tự dƣỡng nhƣ thực vật, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn không chứa cellulose trong thành tế bào [1]. Lysosome Thành tế bào Màng tế bào chất Bộ máy golgi Nhân Ti thể Mạng lƣới nội chất Ribosome Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm (Nguyên Lân Dũng, 2001) 4 Nấm ăn có cấu tạo chủ yếu là hệ sợi nấm. Các sợi nấm ăn có dạng ống tròn. Các ống này đều có vách ngăn. Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty (hypha), hệ sợi nấm còn gọi là khuẩn ty thể (mycelium). Khoảng cách giữa hai vách ngăn gọi là tế bào. Tế bào nấm có những đặc trƣng riêng, khác biệt với tế bào động vật và thực vật. Trƣớc hết là thành tế bào. Dƣới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy thành tế bào cấu tạo bởi nhiều lớp. Nếu nhƣ thành tế bào của thực vật cấu tạo chủ yếu bởi cellulose thì thành tế bào của những nhóm nấm khác nhau lại có cấu tạo bởi những thành phần khác nhau. Hầu hết các loài nấm đảm đều có thành tế bào cấu tạo chủ yếu bởi kitin- glucan. Thông qua các lỗ trên vách ngăn, chất nguyên sinh có thể di chuyển dễ dàng trong sợi nấm.[1]. Trong tế bào sơi nấm khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học phóng đại từ 1000 đến 1500 lần (Hình 2.1) có thể thấy Màng tế bào Nhân tế bào Bộ máy golgi Ribosome Lysosome Ti thể Mạng lƣới nôi chất. Sợi nấm có thể phát triển từ bào tử hay tử một đoạn sợi nấm. Bào tử nảy mầm theo nhiều hƣớng khác nhau, sợi nấm phân nhánh nhiều lần, tạo nên một hệ sợi chằng chịt và thƣờng có màu trắng. Riêng ở nấm đảm nói chung thƣờng có tới 3 cấp sợi nấm. Sợi nấm cấp một (sơ sinh), sợi nấm cấp hai (thứ sinh) và sợi nấm cấp ba (tam sinh). Sợi nấm cấp một lúc đầu không có vách ngăn và có nhiều nhân, dần sẽ tạo thành vách ngăn và phân thành nhiều tế bào đơn nhân trong sợi nấm. Sợi nấm cấp hai đƣợc tạo thành do sự phối trộn của hai sợi nấm cấp một. Khi đó nguyên sinh chất trong hai sợi nấm sẽ phối trộn với nhau. Hai nhân vẫn đứng riêng rẽ làm cho tế bào có hai nhân. Ngƣời ta còn gọi sợi nấm loại này là sợi nấm song nhân (dycaryolic hyphae). Sợi nấm cấp ba là do sợi nấm cấp hai phát tr iển thành. Các sợi nấm này liên kết chặt chẽ với nhau và tạo thành quả thể [1]. 5 2.1.2. Sinh sản và chu trình sống Khả năng sinh sản là một đặc điểm quan trọng của nấm. Một tai nấm rơm trƣởng thành có thể phóng hàng tỉ bào tử. Nhờ vậy, nấm phát triển rất