Khóa luận Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phƣơng pháp RFLP – PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001 – 2005 SINH VIÊN THỰC HIỆN: VŨ THỊ QUỲNH CHI Thành phố Hồ Chí Minh -2005- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Hội đồng hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN VŨ THỊ QUỲNH CHI ThS. PHAN THÀNH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh -2005- iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . PGS.TS Bùi Cách Tuyến cùng ThS. Phan Thành Dũng – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam – đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. TS. Bùi Minh Trí và TS. Đinh Duy Kháng đã có những chỉ dẫn, động viên giúp tôi thực hiện tốt khóa luận này. KS. Nguyễn Ngọc Mai cùng các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật/Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Chị Huỳnh Kim Hưng cùng các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hướng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận. Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp. Và Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để Con được như ngày hôm nay. iv TÓM TẮT VŨ THỊ QUỲNH CHI. Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 09/2005. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR. Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN. ThS. PHAN THÀNH DŨNG. Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su là một bệnh mới do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra nhưng có tác hại rất lớn đến nền kinh tế của nhiều nước, đặc biệt là những nước sản xuất cao su thiên nhiên. Triệu chứng biểu hiện của bệnh hiện nay rất biến thiên và dễ nhầm lẫn với các bệnh về lá khác. Do đó tìm hiểu phương pháp chẩn đoán, phát hiện nhanh bệnh Corynespora cũng là cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước khi bệnh lây lan. Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy, nấm C. cassiicola có sự phân hóa trong cùng loài, C. cassiicola trên các dòng vô tính cao su khác nhau có sự khác biệt về di truyền, nhờ đó có thể nhận biết C. cassiicola qua khả năng gây bệnh cho các dòng vô tính cao su khác nhau. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở nước ta là một việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa sự đa dạng di truyền của C. cassiicola với tính kháng của một số dòng vô tính cao su đang được trồng ở Việt Nam. Kết quả đạt được: Nhận diện được triệu chứng đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su. Thu thập mẫu bệnh trên 32 dòng vô tính cao su khác nhau, tiến hành quy trình chẩn đoán và phân tích đa hình vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng phương pháp RFLP – PCR trên 7 dòng vô tính. Qua phân tích chúng tôi đi đến kết luận: Quy trình phản ứng PCR đối với nấm C. cassiicola của Silva và cộng sự (1998) có thể sử dụng để nghiên cứu vùng ITS nấm C. cassiicola ở Việt Nam. Chẩn đoán bệnh Corynespora bằng cách nhận diện sản phẩm khuếch đại vùng ITS sử dụng cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả, sản phẩm thu nhận được không đặc trưng cho nấm C. cassiicola. v Không tìm thấy bất cứ sự đa hình nào trong vùng ITS của các mẫu nấm nghiên cứu khi sử dụng phương pháp RFLP – PCR với các enzyme cắt giới hạn EcoRI, CfoI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI. Các mẫu nấm được dùng trong phân tích có thể thuộc cùng một chủng nấm C. cassiicola và đây có thể là chủng duy nhất gây bệnh trên cây cao su ở Việt Nam hiện nay vi MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................... i Tóm tắt ........................................................................................................................ ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... vi Danh sách các hình ................................................................................................... vii Danh sách các bảng ................................................................................................... vii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3 2.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg. .................................... 2.2. Sơ lược về nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ....................................... 4 2.2.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................... 4 2.2.2. Phạm vi phân bố .................................................................................. 4 2.2.3. Phạm vi ký chủ và khả năng gây bệnh ................................................. 5 2.2.4. Đặc tính sinh học của C. cassiicola ..................................................... 5 2.3. Nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg ....................................................................................................... 6 2.3.1. Sự xuất hiện của nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su Hevea brasiliensis .................................................................................... 6 2.3.2. Tình hình bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su tại một số nước trồng cao su .............................................................................................. 6 2.3.3. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su ..................... 9 2.4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh do C. cassiicola ............... 9 vii 2.5. Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) .............................................. 10 2.5.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR ........................................................... 10 2.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .......................................... 12 2.6. Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease – RE) ................................. 14 2.6.1. Giới thiệu ............................................................................................ 16 2.6.2. Định danh các enzyme ....................................................................... 15 2.6.3. Trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn ................................. 16 2.6.4. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA .................... 16 2.6.5. Phân tích kết quả của các phản ứng cắt bằng RE ............................... 18 2.6.6. Bản đồ giới hạn ................................................................................... 19 2.7. Vùng ITS và vai trò của nó trong phân tích đa dạng di truyền .................... 19 2.8. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong và ngoài nước ............................ 21 2.8.1. Những nghiên cứu về C. cassiicola ngoài nước ................................. 21 2.8.2. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong nước ................................. 23 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .............................................. 24 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ................................................................... 24 3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 24 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 24 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 24 3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 24 3.2.1. Phân lập nấm nguồn nấm C. cassiicola ............................................. 24 3.2.1.1. Hóa chất và dụng cụ .................................................................... 24 3.2.1.2. Phương pháp lấy mẫu .................................................................. 25 3.2.1.3. Phương pháp phân lập ................................................................. 25 3.2.2. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR ........................................... 26 3.2.2.1. Chuẩn bị DNA khuôn mẫu cho phản ứng PCR........................... 26 3.2.2.2. Thực hiện phản ứng PCR ............................................................ 28 3.2.2.3. Đọc kết quả của phản ứng PCR ................................................... 30 3.2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng các enzyme cắt giới hạn (RE) ........... 30 viii 3.2.3.1. Hóa chất và dụng cụ ................................................................... 31 3.2.3.2. Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP .................................. 31 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 32 4.1. Về tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora ................................................ 32 4.2. Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola .................................................... 37 4.3. Kết quả PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola ............................................ 37 4.4. Kết quả phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS ..................................... 40 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 46 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 48 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 52 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR: Polymerase Chain Reaction. RE: Restriction endonuclease. PDA: Potato Dextrose Agar. PSA: Potato Saccharose Agar. EtBr: Ethidium Bromide. TE: Tris EDTA. TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA. RFLP: Restriction Fragments Length Polymorphism. ITS: Internal Transcribed Spacer. RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. Bp: base pairs rRNA: ribosomal RNA. dvt: dòng vô tính. BVTV: bảo vệ thực vật VNCCSCN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Một vài RE và vị trí phân cắt của nó ........................................................ 15 Bảng 2.2: Liệt kê các RE xếp thứ tự theo bản chất vị trí cắt của nó ......................... 17 Bảng 2.3: Trình tự một số primer và trình tự của nó dùng trong nghiên cứu vùng ITS của nấm ..................................................................................................................... 21 Bảng 3 .1: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR ................................................ 29 Bảng 3.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP ............................................... 31 Bảng 4.1: Các dòng vô tính cao su được lấy mẫu và đặc điểm triệu chứng của bệnh (đặc trưng/ không đặc trưng)..................................................................................... 33 Bảng 4.2: Một số dòng vô tính cao su phân lập được nấm C. cassiicola ................ 36 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Một đợt dịch bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su ở Việt Nam .... 8 Hình 2.2: Hình minh họa phản ứng PCR .................................................................. 11 Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS ở nấm .............................................................................. 20 Hình 2.4: Lược đồ các primer trên vùng ITS ............................................................ 20 Hình 3.1: Hình minh họa chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng trong thí nghiệm ............................................................................................ 29 Hình 4.1: Triệu chứng bệnh đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora ................... 34 Hình 4.2: Triệu chứng biến thiên của bệnh rụng lá Corynespora ............................ 34 Hình 4.3:Triệu chứng của bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioidies ........................................................................................................ 35 Hình 4.4: Bào tử nấm C. cassiicola dạng đơn dưới kính hiển vi và bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioidies ............................................................................... 35 Hình 4. 5: Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trường PDA ................................ 36 Hình 4.6: Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola từ các nguồn khác nhau ........... 37 Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu nấm C. cassiicola ............... 38 Hình 4.8: Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi giảm lượng primer dùng trong phản ứng PCR ........................................................................................................... 39 Hình 4.9: Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola và so sánh với sản phẩm PCR của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae ................. 40 Hình 4.10: Các sản phẩm tạo thành khi phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme EcoRI .......................................................................................... 41 Hình 4.11: Phân cắt các sản phẩm PCR bằng enzyme MspI .................................... 42 Hình 4.12: Phân cắt sản phẩm bằng enzyme CfoI .................................................... 42 Hình 4.13: Phân cắt sản phẩm bằng enzyme RsaI .................................................... 43 Hình 4.14: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HaeIII ........................................ 43 Hình 4.15: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme Sau3AI ...................................... 44 1 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nấm bệnh trên cây trồng, đặc biệt là nấm ký sinh là dịch hại nguy hiểm đối với nền nông nghiệp của nhiều quốc gia trên thế giới. Trong đó, nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei có khả năng phân bố và phổ ký chủ rộng đã gây thiệt hại đáng kể cho nền kinh tế của nhiều nước. Trong phổ ký chủ, Corynespora cassiicola gây hại đặc biệt nghiêm trọng cho cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.), đây là loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao được trồng nhiều ở các nước Đông Nam Á, châu Phi và Nam Mỹ. Trên cây cao su, C. cassiicola gây ra bệnh rụng lá – còn được gọi là bệnh rụng lá Corynespora, bệnh này có thể xảy ra trên cây cao su thuộc mọi lứa tuổi và xảy ra quanh năm, gây thiệt hại rất lớn về năng suất mủ cao su. Bệnh này đã bùng phát thành những đợt dịch bệnh và được ghi nhận lần đầu tiên vào những năm 1980 ở Sri Lanka, Indonesia, Malaysia và Thái Lan trên các dvt mẫn cảm như RRIC 103, RRIM 725, KRS 21, PPN 2447. Trong khoảng thời gian từ 1980 - 1988, ở Indonesia, khoảng 1200 ha cao su đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng, thiệt hại khoảng 400 ha, ước tính giá trị thiệt hại lên đến 50 triệu USD (theo CFC/INRO Project Proposal, 1999). Trong những năm gần đây, khả năng gây hại của nấm C. cassiicola ngày càng lớn và ngày càng có nhiều dvt cao su bị nhiễm bệnh. Biện pháp phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora bằng hóa chất khá tốn kém và được nhận định là không kinh tế bằng cách thay thế các dvt mẫn cảm bằng các dvt có tính kháng (Chee, 1988). Dịch bệnh do nấm C. cassiicola gây ra thường làm kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản và thời gian phục hồi của những dvt bị nhiễm bệnh. Trước tình hình đó, người trồng cao su thường được khuyến cáo trồng các dvt có tính kháng bệnh. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của các dòng C. cassiicola là rất khác nhau tùy thuộc vào dvt cao su khác nhau và các điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa, độ cao và độ màu mỡ của đất. Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy nấm C. cassiicola trên cây cao su có sự phân hóa về di truyền (CFC/INRO Project Proposal, 1999; Safia và Noor Hisham, 2003). Do vậy, việc xác định sự đa dạng sinh học, đặc biệt là đa dạng ở mức độ phân tử của C. cassiicola là việc rất cần thiết. Đây 2 chính là tiền đề cho việc xác định các marker phân tử có liên quan đến tính độc của C. cassiicola và phục vụ cho việc nghiên cứu tính kháng trên các dvt cao su. Ở Việt Nam, bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su đã được ghi nhận vào tháng 09/1999, gây hại nặng cho các dvt RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Hiện nay, số lượng dvt cao su bị nhiễm bệnh đã tăng lên nhiều, bệnh đã xuất hiện tại một số công ty cao su ở miền Đông Nam Bộ (Phan Thành Dũng, 2004) và một số tỉnh phía Bắc như Hà Tây và Nghệ An (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật, 2000). Những nghiên cứu về bệnh này ở Việt Nam hiện chưa nhiều và mới chỉ dừng lại ở phân tích, đánh giá tình hình bệnh cũng như tính kháng của một số dvt cao su đối với nấm C. cassiicola. Việc ứng dụng các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh và nghiên cứu về nấm C. cassiicola chưa nhiều trong khi bệnh rụng lá Corynespora ngày càng lan rộng, triệu chứng bệnh ngày càng biến thiên, càng ngày càng có nhiều dvt cao su bị nhiễm bệnh, đã trở thành mối lo ngại của nhiều nước trồng cao su. Xuất phát từ các vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phƣơng pháp RFLP – PCR”. 1.2.Mục đích yêu cầu 1.2.1.Mục đích Thu thập và phân lập nấm C. cassiicola trên lá cao su bị bệnh có biểu hiện các triệu chứng đặc trưng, không đặc trưng trên các dvt cao su khác nhau, tại một số địa điểm khác nhau. Xác định sự khác biệt di truyền giữa các mẫu nấm C. cassiicola phân lập từ các dvt cao su khác nhau bằng phương pháp RFLP – PCR (Restriction Fragments Length Polymorphism – Polymerase Chain Reaction). 1.2.2. Yêu cầu Nhận dạng được các triệu chứng biểu hiện của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su. Nắm vững kỹ thuật nuôi cấy và phân lập nấm C. cassiicola. Nắm vững kỹ thuật PCR và sử dụng các enzyme cắt giới hạn. 3 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) Cây cao su (Hevea br