Khóa luận Sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR để phát hiện virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya ringspot virus) tại hai tỉnh Đồng Nai và Đồng Tháp

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii iii LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo điều kiện cho em thực hiện khóa luận này. Em xin cảm ơn thầy Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ bảo và hỗ trợ cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Con cảm ơn Ba, Mẹ đã luôn dành tình thƣơng cho con; dạy dỗ, động viên con; là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con trong suốt thời gian qua. Em xin cảm ơn các Anh, Chị ở Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh đã hết lòng giúp đỡ, đóng góp nhiều kinh nghiệm quý báu cho em hoàn thành tốt khóa luận. Em chân thành cảm ơn anh Cƣờng- Viện Cây Ăn Quả miền Nam, anh Dũng- Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Tiền Giang, anh Vinh- Trạm BVTV Tân Phú- Định Quán đã cung cấp tài liệu và tạo điều kiện thuận lợi cho em thu thập mẫu thí nghiệm. Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình dạy bảo, dìu dắt em trong suốt quãng đƣờng sinh viên. Cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 đã luôn bên cạnh mình, đóng góp, động viên mình trong học tập cũng nhƣ trong cuộc sống. TP. HCM, Tháng 9 năm 2005 Nguyễn Thị Thùy Dƣơng iv TÓM TẮT NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG, Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2005. “SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÒNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP”. Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Bùi Cách Tuyến Đề tài đƣợc tiến hành tại hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh- Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. Nội dung thực hiện: - Tiến hành lấy mẫu bệnh đốm vòng trên cây đu đủ tại hai tỉnh điều tra. - Sử dụng kĩ thuật DAS ELISA để chẩn đoán và đánh giá mức độ nhiễm bệnh đốm vòng ở hai tỉnh này. - Thiết lập quy trình RT-PCR để phát hiện PRSV với đối tƣợng thí nghiệm là các mẫu dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp ELISA. Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp DAS ELISA - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng ở các địa điểm - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo từng giống cây - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo tuổi cây 4 - 5 tháng (chƣa trái) 70,00 % 6 - 8 tháng 85,71 % 8 - 11 tháng 12,50 % Trên 1năm 36,11 % Xã Mỹ Hiệp 92,68 % Xã Bình Thạnh 77,42 % Xã Phú Tân 47,37 % Xã Phú Lộc 47,37 % Xã Phú An 16,00 % Da bông (Db) 86,54 % Mã Lai (Ml) 80,00 % Địa phƣơng (Đp) 34,92 % v Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp RT-PCR - Cặp mồi 1 không đặc hiệu cho trình tự gen coat protein của PRSV-P song vẫn khuếch đại đƣợc sản phẩm mong muốn. - Cặp mồi P4-M30 và P14-M31 đặc hiệu cho trình tự coat protein của PRSV-P. Kết quả giải trình tự một số mẫu - Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P14-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 619 bp. - Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P7-M31): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 410 bp. - Mẫu Định Quán (giải trình tự với mồi P7-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 412 bp. So sánh các trình tự vừa giả đƣợc với trình tự coat protein và genome của PRSV-P trên Genebank, thấy có sự tƣơng đồng khá cao. Chứng tỏ, sản phẩm thu từ mồi P14- M31 và P7-M30 đúng là đợc khuếch đậi từ gen coat protein của PRSV-P. Nhƣ vậy, đã xây dựng đƣợc quy trình chẩn đoán PRSV trên cây đu đủ bằng phƣơng pháp RT-PCR với các cặp mồi P14-M31 hay P7-M30. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i TÓM TẮT .......................................................................................................................iv MỤC LỤC ......................................................................................................................vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................ix DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................. x DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................xi DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ....................................................................................... xii PHẦN I ............................................................................................................................ 1 GIỚI THIỆU .................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục đích ............................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................. 2 1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................ 2 PHẦN II ........................................................................................................................... 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................ 3 2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .) ........................................................... 3 2.1.1. Phân loại học .................................................................................................. 3 2.1.2. Nguồn gốc, phân bố ....................................................................................... 4 2.1.3. Đặc điểm thực vật học .................................................................................... 4 2.1.4. Nhu cầu sinh thái ............................................................................................ 5 2.1.5. Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dƣỡng của đu đủ ............................................ 6 2.1.5.1. Giá trị dinh dƣỡng ................................................................................... 6 2.1.5.2. Ứng dụng thực tiễn .................................................................................. 7 2.1.6. Tình hình sản xuất .......................................................................................... 8 2.1.7. Sâu bệnh ......................................................................................................... 9 2.1.7.1. Các loài côn trùng gây hại chính ........................................................... 10 2.1.7.2. Các bệnh phổ biến trên đu đủ ................................................................ 10 2.2. Sơ lƣợc về Papaya ringspot virus và tác hại của nó trên đu đủ.......................... 11 vii 2.2.1. Khái niệm chung về bệnh virus hại thực vật ................................................ 11 2.2.2. Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV) ........................ 15 2.2.3. Những phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus PRSV ...................................... 20 2.2.3.1. Phƣơng pháp quan sát triệu chứng ........................................................ 20 2.2.3.2. Phƣơng pháp cây chỉ thị ........................................................................ 20 2.2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng hiển vi điện tử ....................................... 21 2.2.3.4. Phƣơng pháp huyết thanh học ............................................................... 21 2.2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử ............................................. 22 2.2.3.6. Các phƣơng pháp khác .......................................................................... 22 2.2.4. Sơ lƣợc về phƣơng pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay . 22 2.2.5. Sơ lƣợc về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) ................................................................................................................ 24 PHẦN III ....................................................................................................................... 27 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 27 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 27 3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu ......................................................................................... 27 3.3. Phƣơng pháp giám định bệnh đốm vòng trên đu đủ (Papaya Ringspot Desease) .................................................................................................................................... 28 3.3.1. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 28 3.3.2. Hóa chất ....................................................................................................... 29 3.3.3. Quy trình thực hiện ...................................................................................... 31 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA ............................................................................. 31 3.3.3.2. Phƣơng pháp RT-PCR ........................................................................... 35 PHẦN IV ....................................................................................................................... 39 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................................... 39 4.1. Hiện trạng canh tác cây đu đủ ở nơi lấy mẫu ..................................................... 39 4.2. Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm với bộ kit DAS- ELISA ................................... 40 4.2.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra ........................................................ 40 4.2.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây ................................................................. 42 4.2.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây ..................................................................... 43 4.3. Kết quả thí nghiệm PCR ..................................................................................... 44 4.4. Kết quả giải trình tự một số mẫu ........................................................................ 53 viii PHẦN V ........................................................................................................................ 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................... 56 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 56 5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 58 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 61 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid CP gene: Coating protein gene DAS ELISA: Direct double antibody sandwich DMSO: Dimethylsulforxide DNA: Deoxyribonucleic acid DNase: Deoxyribonuclease dNTP: Deoxynucleotide triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid EIA: Enzyme immunoassay ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay EtBt: Ethidium bromide FDA: Food and Drug Administration MMLV: Moloney murine leukemia virus mRNA: Messenger RNA OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction p-NPP: p- nitrophenyl phosphate PRSV: Papaya ringspot virus PSP-T: Phosphate buffer saline with TWEEN-20 RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease RT-PCR: Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature UV: Ultra violet x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cây đu đủ ........................................................................................................ 3 Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus ........................................................................ 12 Hình 2.3 Các dạng thể vùi của virus tồn tại trong mô cây ............................................ 16 Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên lá ................................................................................. 17 Hình 2.5 Đối chiếu giữa lá bệnh (bên trái) và lá khỏe (bên phải) ................................. 18 Hình 2.6 Triệu chứng trên cuống lá và quả ................................................................... 18 Hình 2.7 Myzus persicae (trái) và Aphis gossypii (phải) ............................................... 19 Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA .................................................................................. 24 Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn ........................................... 44 b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2 ................................ 44 Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1 .................................................................. 45 Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1 .............................................................. 46 Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1 ........................................................... 47 Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên ................................................. 50 Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31 ...................................................... 51 Hình 4.7 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 ........................................................ 52 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giá trị dinh dƣỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn đƣợc của cây đu đủ ...... 6 Bảng 2.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ trên thế giới (Trần Thế Tục, 1998) ..................... 9 Bảng 3.1 Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm ........................................ 28 Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo địa bàn điều tra .......................................... 40 Bảng 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh Đốm vòng theo giống cây .................................................. 42 Bảng 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây ....................................................................... 43 xii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh trên các địa bàn điều tra ................................................... 41 Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây .................................................................. 42 Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây ..................................................................... 43 1 PHẦN I GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Tính cấp thiết của đề tài Đu đủ (Carica papaya L.) là một loại trái cây giàu dinh dƣỡng và đang có giá trị kinh tế hiện nay. Trái chín có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, theo phân tích thành phần hoá học, trong 100g thịt trái chín có chứa 86,6 % nƣớc, 12,1 % tinh bột, 0,6 % protein, 0,3 % lipit, năng lƣợng là 50 calo, 0,7 % xơ, 0,5 % tro và khá nhiều khoáng nhƣ: Kali (204 mg), Ca (34 mg), P (11 mg). Đặc biệt, đu đủ cung cấp lƣợng vitamin rất phong phú: vitamin A (450 mg), C (74 mg), B1 (0,03 mg), P (0,5 mg), B2 (0,04mg) (Trần Thế Tục, 1998). Hơn nữa, lá đu đủ có thể sử dụng làm mềm thịt hay làm giảm độ đục trong quy trình sản xuất bia. Ngoài ra, đu đủ còn đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhƣ: ly trích papain, sử dụng làm rau (đối với trái chƣa chín), hoặc để diệt khuẩn. Trên thế giới, vùng trồng và xuất khẩu đu đủ nổi tiếng là Hawaii, đồng thời nó cũng là nơi sản xuất đu đủ lớn nhất ở Mỹ, cung cấp 60 % số quả tƣơi cho Mỹ và Nhật Bản. Tuy nhiên việc sản xuất đang bị hạn chế bởi bệnh do papaya ringspot virus (PRSV) (Gonsalves, 1998). Đây là virus gây thiệt hại hàng đầu đối với canh tác đu đủ. Không chỉ ở Hawaii, Philippine - một quốc gia nổi tiếng về sản xuất đu đủ - cũng bị thiệt hại rất lớn bởi loài virus này. Chẳng hạn, năm 1984, 200 ha đu đủ ở Silang, Cavite đã bị tàn phá, làm thiệt hại 300.000 USD (Opina, 1986). Do tính chất gây bệnh đặc trƣng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kì phƣơng thức nào mà chỉ có thể khắc phục bằng cách phòng trừ và sử dụng giống kháng bệnh nên thiệt hại của bệnh rất nghiêm trọng. Thêm vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi ta quan sát đƣợc triệu chứng một cách rõ ràng thì đã quá muộn và thƣờng không chính xác. Thiệt hại đáng kể do PRSV đối với việc canh tác đu đủ đã làm nảy sinh nhu cầu làm sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm. Đây không chỉ là vấn đề quan trọng đối với các nƣớc có nền sản xuất đu đủ lớn nhƣ Mỹ, Brazil, Philippine, Cuba… mà còn 2 đối với các nƣớc nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam - tiềm năng khí hậu, đất đai rất phù hợp cho việc phát triển sản xuất đu đủ. Cùng với sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh ngày nay đã giúp ta có thể chẩn đoán nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh virus. Xuất phát từ các vấn đề trên, trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp, tôi xin thực hiện với nội dung “Sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR để phát hiện virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya ringspot virus) tại hai tỉnh Đồng Nai và Đồng Tháp”. 1.2. Mục đích - Khảo sát và thu thập mẫu đu đủ ở một số vùng chuyên trồng đu đủ ở Đồng Nai và Đồng Tháp. - Chẩn đoán nhanh và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kit ELISA. - Xây dựng quy trình RT-PCR để nhận biết virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ. - Phân tích trình tự gene của một số mẫu bệnh nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa các chủng gây bệnh tại Việt Nam với các chủng khác trên thế giới. 1.3. Yêu cầu - Đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kỹ thuật ELISA trên các mẫu thu thập đƣợc. - Xây dựng quy trình RT-PCR có tính đặc hiệu, độ tin cậy cao và kết quả rõ ràng. 1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu lá đu đủ (Carica papaya L.) đƣợc lấy từ hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp. - Phạm vi nghiên cứu Chẩn đoán và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng phƣơng pháp DAS-ELISA. Nhận biết sự hiện diện của virus PRSV trên mẫu đu đủ thu thập đƣợc thông qua sử dụng kĩ thuật RT-PCR 3 Hình 2.1 Cây đu đủ (Semillas del Caribe, 2003) PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .) 2.1.1. Phân loại học - Tên khoa học: Carica papaya L. - Họ: Caricaceae (hay Papayaceae- họ đu đủ) Đu đủ do có nhiều đặc tính ƣu việt nhƣ cây thân thảo nên tiết kiệm đƣợc diện tích trồng trọt, tận dụng đƣợc những khoảng không gian trống trên đồng ruộng, vƣờn nhà… lại mau cho trái (khoảng từ 6 - 7 tháng) nên cây đƣợc trồng rất phổ biến ở khắp nơi trên thế giới dù đây là một loại cây khá nhạy cảm với các tác nhân gây hại trong tự nhiên. Sản phẩm thu hoạch đƣợc sử dụng để ăn hoặc làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp nhƣ thực phẩm, dƣợc, thuộc da. Ở một số nơi trên thế giới, đặc biệt là ở Australia và một vài đảo ở phía đông Ấn Độ, cây đu đủ đƣợc biết đến với tên gọi là papa